Продвинутые комплексы PAMAM-квантовые точки для быстрых клинических иммуноанализов

Аннотация

Представлена группа комплексов для клинических иммуноанализов. Комплексы включают PAMAM-конъюгированный козли анти-кроличий IgG и квантовые точки (КТ), конъюгированные с козли анти-мышиный IgG. При добавлении кроличьего анти-антигена и мышиного анти-антигена обнаруживается соответствующий антиген. Метод прост, удобен, быстр и с минимальным числом этапов. Применим к разным методам: ФКМ (потоковая цитометрия), ИКХ (иммуноцитохимия), ИГХ (иммуногистохимия) для детектирования множества антигенов.

Введение

Квантовые точки (КТ) широко используются как люминофоры благодаря высокому квантовому выходу флуоресценции, высокой фотстабильности и низкому фотобленчингу. Применяются как органические флуорофоры в клеточной визуализации и биотехнологиях. Особенно выгодны кадмий-содержащие КТ (CdSe, CdTe): под облучением одной длины волны (430–660 нм) имеют размерозависимый спектр эмиссии [1, 2]. Антитела, конъюгированные с КТ, — перспективные зонды для молекулярной визуализации.

Полиамидоаминовый дендример (PAMAM) — одно из наиболее изученных дендритных макромолекул. Характеристики: огромное число поверхностных функциональных групп, много внутренних полостей, наномасштабный размер, высокая биосовместимость. При конъюгации с препаратами и антителами дендримеры улучшают растворимость и системное циркулирование препарата, не препятствуя биологической активности [3]. Поэтому PAMAM-модифицированные антитела часто используют в клинической иммунологии.

Клинические иммуноанализы включают множество методов: WB, ELISA, ИГХ, ИКХ, ФКМ. ФКМ с специфическими антителными зондами обеспечивает быстрый анализ отдельных клеток или биологических частиц на клеточно-молекулярном уровне — один из самых широко используемых иммуноанализов. Для скрининга клеток достаточно соответствующего антителного зонда; для скрининга малых биомолекул (малые белки, вирусы, цитокины) нужен метод CBA (цитометрический бидовый массив), так как ФКМ не детектирует малые цитокины напрямую. CBA использует краситель-маркированные биды с захватающими антителами на поверхности. При смешивании бидов CBA с пробой и маркированными детектирующими антителами формируются сэндвич-комплексы как в ELISA, и малый антиген детектируется ФКМ.

В работе представлена группа комплексов: PAMAM-конъюгированный козли анти-кроличий IgG и КТ-конъюгированный козли анти-мышиный IgG. Эта группа применима для ФКМ, ИКХ, ИГХ. При добавлении кроличьего и мышиного анти-антигенов обнаруживается соответствующий антиген. Модель детектирует многие типы антигенов, включая малые белки, вирусы, цитокины при наличии соответствующих мышиных и кроличьих антител. Схема 1 показывает комплексы для ФКМ на примере HSP27. HSP27 (HSPB1) — важный белок, участвующий в лекарственной резистентности, росте клеток, апоптозе, онкогенезе, метастазировании [4, 5]. В модели PAMAM-козли анти-кроличий IgG выступает носителем и захватчиком, как биды CBA, позволяя детектировать малые молекулярные антигены ФКМ. КТ-козли анти-мышиный IgG — флуоресцентный зонд. Если антигены — мембранные или внутриклеточные белки, можно использовать традиционный ФКМ, добавляя только КТ без PAMAM. Для внутриклеточных и мембранных белков клетки сами являются мишенями для прямого детектирования ФКМ; им не нужен PAMAM для формирования псевдоклетки. Поэтому комплексы можно разделять и использовать по отдельности.

Результаты и обсуждение

Группа комплексов состоит из двух частей: PAMAM-часть и КТ-часть. PAMAM-часть — PAMAM-конъюгированный козли анти-кроличий IgG. Использовали 5-е поколение амино-терминированные PAMAM дендримеры (G5 PAMAM) как поверхностно-стабилизирующий агент для идеальной растворимости в водной среде, но этот дендример имеет сильный положительный заряд, вредный для связывания антител. Для нейтрализации положительного заряда растворили PAMAM в DMSO и добавили сукциновый ангидрид (дигидро-2,5-дикетогидрофуран) для нейтрализации аминогрупп PAMAM. Аминогруппа PAMAM реагирует с сукциновым ангидридом, образуя амидные связи [6–10]. После реакции продукт диализировали, лиофилизировали, взвесили, перерастворили — получен почти нейтральный продукт «N-PAMAM», способный конъюгироваться с козли анти-кроличьим IgG. PAMAM, особенно G5, содержит много полостей, и IgG может инкапсулироваться в пустоты G5 PAMAM [11]. Козли анти-кроличий IgG растворили в MES-буфере (0,1 моль/л, pH 6,0), добавили EDC и sulfo-NHS (молярное соотношение 1:1), инкубировали 15 мин. Затем добавили N-PAMAM и инкубировали при 4 °C на шейкере на ночь. Полимер самособирался в водном растворе, формируя полимерные мицеллы, инкапсулирующие нерастворимые низкомолекулярные гости [12]; после реакции диализ для удаления нереагировавших материалов. Затем лиофилизация, взвешивание, перерастворение в консервирующем буфере — получен N-PAMAM-конъюгированный козли анти-кроличий IgG.

Флуоресцентные и УФ-виз спектры N-PAMAM-IgG (козли анти-кроличий) в MES на рис. 1. По сравнению с N-PAMAM и IgG, пик флуоресцентной эмиссии N-PAMAM-IgG имел наименьшую интенсивность. УФ-виз спектр: по сравнению с IgG, MES, PAMAM, N-PAMAM, только N-PAMAM-IgG имел абсорбционный пик при 200 нм. И флуоресцентный, и УФ-виз спектры N-PAMAM-IgG показывают отличия от N-PAMAM и IgG, косвенно доказывая конъюгацию, а не простое смешивание. Для проверки антителной активности N-PAMAM-IgG провели ELISA. На рис. 2: антигенность IgG (козли анти-кроличий) не потеряна при связывании с N-PAMAM.

КТ-часть — КТ-конъюгированный козли анти-мышиный IgG. Антително-КТ конъюгаты обычно формируют перекрестными реакциями, где антителные молекулы связываются с функциональными группами (карбоксил, амино) на поверхности КТ [13, 14]. В работе использовали ядро/оболочка CdSe/ZnS водорастворимые КТ, стабилизированные карбоксил-лигандами, и карбодиимидную реакцию с EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид). Это один из самых популярных методов конъюгации антител к поверхности КТ [15–17]. КТ-мицеллы CdSe/ZnS сначала инкубировали с EDC и sulfo-NHS вборатном буфере (5 мМ BS, pH 7,2). Затем добавили козли анти-мышиный IgG, инкубировали при 4 °C на шейкере на ночь в темноте. Наконец, добавили 10% БСА (сывороточный альбумин говяжий) для блокировки нереагировавших КТ, очистили последовательной центрифугой и перерастворением для удаления нереагировавших материалов. Антителная активность КТ-IgG (козли анти-мышиный) сохраняется 3 месяца при хранении 4 °C в темноте.

Размер частиц КТ-IgG (козли анти-мышиный) и КТ в консервирующем буфере (2,5 мМ BS, pH 8,0, 0,1% БСА) на рис. 3a. После конъюгации диаметр продукта очевидно увеличился, продукты имели хорошую однородность и стабильность — ключевые характеристики для детекционного зонда. Флуоресцентные спектры КТ-IgG и КТ на рис. 3b: пик флуоресцентной эмиссии КТ-IgG совпал с КТ, что означает: конъюгация IgG с КТ не изменила оптические характеристики КТ, полезно для иммуноанализов. Для проверки антителной активности КТ-IgG использовали ELISA с PVDF мембраной. Мышиный анти-AKT антиген разбавили до 1, 10, 100, 200 мкг/мл, четыре концентрационные градиенты гибридизировали с КТ-IgG (козли анти-мышиный) при одной концентрации 0,1 мг/мл. После гибридизации 40 мин при 37 °C в темноте, мембрану промыли PBST (pH 6,0, 0,1% Tween 20) 3 раза, облучили УФ. Флуоресцентная интенсивность (рис. 3c) росла с увеличением концентрации антигена — КТ-IgG обладает высокой антителной активностью.

Дальше описывается использование комплексов в ФКМ. Можно детектировать многие типы антигенов: малые белки, вирусы, цитокины [18], пример — белок HSP27. HSP27 находится в цитоплазме, в больших количествах секретируется опухолевыми клетками, особенно при раке легких, поджелудочной железы, мочевого эпителия, почек, груди, меланоме. Поскольку малая часть HSP27 секретируется внеклеточно, необходимо лизировать клетки для экстракции белка. В эксперименте две линии: MCF-7 (человечный рак груди) — тест, L02 (нормальные человечные клетки печени) — контроль. Клетки лизировали для экстракции внутриклеточных белков. Общий белок собрали, добавили кроличий анти-HSP27 и мышиный анти-HSP27 согласно концентрации белка, инкубация 37 °C 50 мин. Затем добавили N-PAMAM-IgG, инкубация 37 °C 30 мин, разделили на две равные группы: тест и PAMAM-группа. Наконец, тестовой группе добавили КТ-IgG, инкубация 37 °C 30 мин в темноте. Рис. 4 — флуоресцентный анализ двух групп клеток ФКМ. Интенсивность тестовой кривой значительно выше PAMAM-кривой в группе MCF-7, в группе L02 кривые почти совпадают. При наличии HSP27 в экстракте N-PAMAM-IgG и КТ-IgG косвенно связываются в сэндвич-комплекс в присутствии кроличьего и мышиного анти-HSP27. Если HSP27 нет, только малое количество КТ-IgG связывается с N-PAMAM-IgG неспецифической адсорбцией. Если флуоресценция тестовой кривой выше контрольной PAMAM — HSP27 присутствует. Рис. 4 показывает: MCF-7 секретируют больше HSP27, чем L02.

Упомянутые комплексы детектируют секретируемые внутриклеточные белки ФКМ; в принципе применимы к любому антигену. Две части можно использовать отдельно. Если антиген находится в клетке или на поверхности, достаточно КТ-части. Пример — β-актин, основной компонент цитоскелета, широко распространен в эукариотах. Рис. 5a — флуоресцентный анализ только КТ-частью для β-актина в HeLa клетках ФКМ. HeLa промыли, обработали метанолом для повышения проницаемости мембраны, разделили на две группы. β-актин группа инкубировалась с мышиным анти-β-актином 37 °C 30 мин, контроль — с БСА. После промывки PBS обе группы инкубировали с КТ-IgG (козли анти-мышиный) 37 °C 30 мин. После двойной промывки PBS — ФКМ. Флуоресценция β-актин кривой значительно выше контрольной — HeLa содержат β-актин.

Комплексы также применимы к ИКХ. Для ИКХ целевой антиген должен быть в клетке или на поверхности и в больших количествах [19], иначе цель трудно отличить от фона. Пример — β-актин. Посеяли HeLa в 10 см чашку, положили столешницу, культивировали 2 дня. Столешницы извлекли, промыли PBS (2 раза), инкубировали в 400 мкл метанола 20 мин при комнатной температуре. Промыли PBS (3 раза). Блокирующий буфер: PBST (0,1% Tween 20), 22,52 мг/мл глицин, 10% БСА. Столешницу положили в блокирующий буфер 30 мин при комнатной температуре. Удалили блокирующий буфер, инкубировали с мышиным анти-β-актином (PBS, 1% БСА) 37 °C 1 ч, промыли PBST (2 раза), инкубировали с КТ-IgG (козли анти-мышиный) 37 °C 1 ч в темноте. После промывки PBST (2 раза) и окраски ядер DAPI (2 мин) столешницу промыли PBS и водой для визуализации под флуоресцентным микроскопом [20, 21]. Рис. 5b — флуоресцентные изображения HeLa. Преимущество КТ как флуорофора: сигнал КТ и DAPI одновременно наблюдаются под УФ-каналом; по ядрам цель очевидно локализована. β-актин — цитоскелетные белки вокруг ядра, четко видны.

Заключение

Демонстрировано применение комплексов в клинических иммуноанализах: ФКМ и ИКХ. Группа комплексов: PAMAM-конъюгированный козли анти-кроличий IgG и КТ-конъюгированный козли анти-мышиный IgG. При добавлении кроличьего и мышиного анти-антигенов обнаруживается соответствующий антиген. Преимущества: широкий спектр, высокая биосовместимость, высокая световая стабильность, низкая биологическая токсичность. Это универсальная модель, требующая только замены соответствующих первичных антител. В статье детектировали HSP27 и β-актин, но в принципе процесс применим к любому типу антигена. Можно выбирать метод детектирования по свойствам антигена, а также разделять комплексы и использовать по отдельности. Метод позволяет детектировать малые молекулы (малые белки, вирусы) ФКМ. Считаем, что с соответствующими улучшениями применимо к другим методам: иммунофлуоресценция (IF), вестерн-блот (WB), латерально-поточная иммунохроматографическая тест-полоска (LCS).

Методы и эксперимент

Материалы

CdSe/ZnS КТ (водорастворимые, карбоксил-группы, cas no. N/A) — NEPQD, Китай. PAMAM (5-е поколение амино-терминированный, Lot no. CYD-150A) — CYD, Китай. Козли анти-кроличий IgG (ab6702) и мышиный анти-β-актин (ab8226) — Abcam, UK; мышиный анти-HSP27 (BF0624) и кроличий анти-HSP27 (AF6082) — Affinity, USA; козли анти-мышиный IgG (bs0296G) — Bioss, Китай; EDC и sulfo-NHS — Thermo Fisher; DMEM и фетовый сывороточный белок — Gibco; PVDF мембраны (0,2 мкм) — Millipore. Остальные реактивы — аналитического чистоты.

Подготовка N-PAMAM-IgG (козли анти-кроличий)

1. a)

   Подготовка N-PAMAM (нейтральный PAMAM): PAMAM (G5 амино-терминированный, средн. ММ 28826) (60 мг, 2,081 мкМ) растворили в DMSO (2 мл), добавили сукциновый ангидрид (0,266 г, 2,66 мкМ) для нейтрализации аминогрупп. Один моль G5 PAMAM содержит 128 моль аминогрупп, 60 мг PAMAM содержат 0,266 мкМ аминогрупп, мольное соотношение аминогрупп PAMAM и сукцинового ангидрида ~1:10. Смешали на шейкере 100 об/мин 4 ч, диализировали через мембрану MWCO 3500 24 ч, лиофилизировали — получен N-PAMAM.

2. b)

   Подготовка N-PAMAM-IgG (козли анти-кроличий): сформулировали MES-буфер (100 мМ, pH 6,0), взяли 100 мкл MES в пробирку, добавили 20 мкМ EDC и 20 мкМ sulfo-NHS, перемешали вихревым миксером на низкой скорости. Добавили 35,7 мкл IgG (pH, 0,5 мкМ), перемешали вихрем, затем добавили 19 мкг N-PAMAM и инкубировали при 4 °C на ночь, наконец раствор диализировали через мембраны MWCO 3500 и 8000 3 дня, после лиофилизации получен N-PAMAM-IgG.

Подготовка КТ-IgG (козли анти-мышиный)

1. a)

   Формулирование BS-буфера:

1. 1.

   Боракс-буфер (50 мМ): 19,07 г боракса растворили в 1 л ультрачистой воды.

2. 2.

   Борная кислота буфер (50 мМ): 3,09 г борной кислоты растворили в 1 л ультрачистой воды.

3. 3.

   BS-буферы pH 8,0 и pH 7,2 приготовили смешиванием вышеуказанных растворов.

4. 4.

   Промывочный буфер (также консервирующий): разбавили pH 8,0 BS до 5 мМ, добавили 0,1% Tween 20.

5. 5.

   Активационный раствор: разбавили pH 7,2 BS до 5 мМ, добавили 0,1% Tween 20.

6. 6.

   EDC-буфер: 0,27 г EDC в 5 мл активационного раствора; sulfo-NHS буфер: 0,378 г sulfo-NHS в 5 мл активационного раствора.

1. b)

   Подготовка КТ-IgG (козли анти-мышиный):

Сначала 450 мкл КТ (CdSe/ZnS, 5 мг/мл) растворили в 2,25 мл активационного раствора, добавили 150 мкл EDC-буфера и 150 мкл sulfo-NHS буфера, ультразвук на льду 5 мин. Второе, центрифугировали 12000 об/мин 5 мин, удалили supernatнант, осадок растворили в 1,2 мл промывочного буфера. После 30 мин ультразвукового перемешивания добавили 100 мкг IgG антитела, инкубировали на ночь в шейкере при 4 °C. Третье, добавили 150 мкл 10% БСА, инкубировали 30 °C 30 мин, центрифуга 12000 об/мин 2 мин, удалили supernatнант. Осадок перерастворили в 1 мл промывочного буфера, центрифуга 12000 об/мин 2 мин, повторяли, наконец растворили осадок в 1 мл консервирующего буфера. В конце добавили 10% БСА, смешали полным ультразвуковым шоком, центрифуга 820 г/мин для удаления осадка, supernatнант содержит КТ-IgG. Хранить КТ-IgG при 4 °C в темноте 3 месяца. Важно: образцы можно хранить только при 4 °C, заморозка даже с глицерином приводит к агрегации КТ, выпадению осадка, не удаляемому PBST, серьезному фоновому флуоресценции.

ФКМ анализ HSP27 белка

HSP27 в цитоплазме, в больших количествах секретируется опухолевыми клетками. Две линии: MCF-7 (рак груди) — тест, L02 (нормаль печень) — контроль. Посеяли в 10 см чашку, DMEM + 10% FBS, 37 °C. При 80% конфлюэнтности клетки трипсинизировали, промыли PBS (2 раза), ресуспендировали в 1 мл PBS. Посчитали клетки в камере Гориаева, добавили T-PER лизис-буфер согласно концентрации клеток, экстрагировали внутриклеточный белок из лизата. Лизат центрифугировали 14000 об/мин 10 мин, супернатант собрали, концентрацию белка измерили BCA методом. Согласно концентрации белка добавили кроличий анти-HSP27 и мышиный анти-HSP27, инкубация 37 °C 50 мин. Концентрация белка L02 ~0,2 мг/мл, MCF-7 ~0,25 мг/мл, объем 500 мкл. Антитела: кроличий анти-HSP27 и мышиный анти-HSP27 добавили к клеткам (0,625 мкл к MCF-7, 0,5 мкл к L02).

Затем добавили 1 мг/мл N-PAMAM-IgG, инкубация 37 °C 30 мин; 6,25 мкл к MCF-7, 5 мкл к L02. После инкубации продукт разделили на две равные группы: тест и PAMAM. Наконец, тестовой группе добавили КТ-IgG, инкубация 37 °C 30 мин в темноте. Две группы анализировали ФКМ.

ФКМ анализ β-актин белка

β-актин — внутриклеточный белок, основной компонент цитоскелета, широко распространен в эукариотах. HeLa посеяли в 10 см чашку, DMEM + 10% FBS, 37 °C 2 дня, удалили supernatнант, промыли PBS (2 раза). Клетки трипсинизировали, центрифуга 800 об/мин 3 мин, удалили supernatнант, добавили 1 мл холодного метанола для ресуспензии. 5 мин, центрифуга 800 об/мин 3 мин, удалили supernatнант, ресуспендировали в 1 мл PBS. Повторили, разделили HeLa на две равные группы. Тест инкубировали с мышиным анти-β-актином 37 °C 30 мин, контроль — с БСА. Мышиный анти-β-актин растворили в PBST (1% БСА, 5 мкг/мл), 100 мкл IgG добавили к 300 мкл тестовой группы, эквивалентное количество БСА — контролю. После 30 мин инкубации обе группы инкубировали с КТ-IgG (козли анти-мышиный) 37 °C 30 мин. После двойной промывки PBS — ФКМ.

ИКХ анализ β-актин белка

HeLa посеяли в 10 см чашку, DMEM + 10% FBS, 37 °C 1 день. Несколько стерильных столешниц положили в чашку, культивировали еще 2 дня. Столешницы извлекли, промыли PBS (2 раза), инкубировали в 400 мкл метанола 20 мин при комнатной температуре. Промыли PBS (3 раза). Блокирующий буфер: PBST (0,1% Tween 20), 22,52 мг/мл глицин, 10% БСА. Столешница в блокирующий буфер 30 мин при комнатной температуре. Удалили блокирующий буфер, инкубировали с мышиным анти-β-актином (PBS, 1% БСА) 37 °C 1 ч, промыли PBST (2 раза), инкубировали с КТ-IgG (козли анти-мышиный) 37 °C 1 ч в темноте. После промывки PBST (2 раза) и окраски ядер DAPI (2 мин) столешницу промыли PBS и водой для визуализации под флуоресцентным микроскопом.

Доступность данных и материалов

Все данные полностью доступны без ограничений.

Аббревиатуры

CBA:

Цитометрический бидовый массив

DMEM:

Модифицированное среднее Эйгла Дюльбекко

FBS:

Фетовый сывороточный белок

FCM:

Потоковая цитометрия

ICC:

Иммуноцитохимия

N-PAMAM:

Нейтральный PAMAM

PAMAM:

Полиамидоаминовый дендример

QDs:

Квантовые точки