Комплексообразование с фуллереном C60 увеличивает эффективность доксорубицина против лейкемических клеток in vitro

Результаты и обсуждение

ВЭЖХ-МС / МС анализ C ₆₀ -Докс Комплексы

Для хроматографического разделения мы использовали условия обращенно-фазовой обработки, ожидая, что в процессе разделения гидрофобный C ₆₀ молекулы удерживаются на колонке намного сильнее, чем у более полярного Dox [41]. Элюирование полярной подвижной фазой, очевидно, должно вызвать разложение комплекса и высвобождение свободного доксионата, который обладает более высоким сродством к подвижной фазе и может быть обнаружен с помощью масс-спектрометрии.

Чтобы подтвердить присутствие комплекса в растворе, концентрация Dox 1 мкМ была выбрана как оптимальная для аналитического анализа. В условиях изократического потока время удерживания свободных Dox и Dox в составе комплексов с C ₆₀ был разным - 11,66 и 9,44 мин соответственно (рис. 1). Кроме того, хроматографические пики Dox, высвобожденного из комплексов, были более широкими и с наблюдаемым «хвостом» пика. Обнаруженный сдвиг во времени удерживания, а также различная форма зубца указывают на то, что разложение C ₆₀ -Dox конъюгаты на молекулах фуллерена колонки, которые обладают более высоким сродством к колонке C18. Следовательно, наноструктура занимает часть активных сайтов связывания и препятствует правильному связыванию Dox с этими сайтами, тем самым влияя на процесс разделения. Это приводит к более короткому удерживанию (уменьшенное время, необходимое для прохождения Dox через колонку), а также к границе пика и хвосту для Dox, высвобожденного из комплекса, по сравнению со свободным лекарственным средством. Очень похожее явление наблюдали Ли и др. [42] при хроматографическом разделении C ₆₀ нековалентные комплексы с пуллуланом. Различия в хроматограммах свободного Dox и освобожденного из комплексов явно указывают на присутствие C ₆₀ -Докс комплексы в растворе.

Хроматограммы многократного мониторинга реакции свободного Dox (1 мкМ), C ₆₀ -Dox 1:1 и C ₆₀ -Dox 2:1 (концентрация Dox-эквивалента 1 мкМ) в изократическом потоке (ацетонитрил, 0,1% муравьиная кислота в H ₂ О, 80:20, v : v ) переход предшественник → ионы продукта:544,2 → 130,2 и 361,1 m / z; а.е. условные единицы

Спектроскопический и флуорометрический анализ

Оптические свойства Dox определяются электронным переходом в π-комплексной системе его ароматических колец и кетоновых групп [43]. Типичный спектр поглощения Dox находится на длинах волн λ <600 нм с широкой полосой при 480 нм (рис. 2а). Спектр поглощения в УФ / видимой области чистого C ₆₀ водный коллоидный раствор имеет три типичных полосы поглощения с максимумами при 220, 265 и 350 нм и длинный небольшой широкий хвост до красной области видимого света [34, 44]. Следовательно, соответствующие контрольные спектры свободного C ₆₀ были вычтены из спектров комплекса. Наблюдаемые спектры поглощения обоих 50 мкМ комплексов были аналогичны спектрам свободного 50 мкМ Dox, но наблюдался 30% гипохромный эффект (рис. 2а), указывающий на фиксацию Dox на C ₆₀ поверхность из-за π-π стэкинг-взаимодействий.

Оптическая характеристика комплексов. Спектры оптической плотности свободного Dox и C ₆₀ -Докс комплексы ( а ). Спектры флуоресценции свободного Dox и C ₆₀ Комплексы Dox в концентрации Dox-эквивалента от 3 до 50 мкМ ( b ); а.е. условные единицы

Длинноволновый максимум поглощения Dox (λ =480 нм) использовался в качестве длины волны возбуждения для отслеживания его флуоресценции. Спектр флуоресценции показывает одну широкую полосу, состоящую из трех пиков при 560, 594 и 638 нм с максимумом около 594 нм (рис. 2b) [43], тогда как C ₆₀ не имеет заметной флуоресценции в этой спектральной полосе. С ₆₀ Флуоресценцию комплексов Dox оценивали в серии разведений с концентрацией Dox-эквивалента от 3 до 50 мкМ. Независимо от разбавления флуоресценция Dox (λ _ex =480 нм, λ _em =594 нм) в комплексах гасили C ₆₀ фрагментов (рис. 2б). Таким образом, флуоресценция Dox в обоих комплексах при концентрации Dox-эквивалента 3 мкМ, по-видимому, подавлялась на 50%. Наблюдаемое тушение флуоресценции Dox объясняется сильной электроноакцепторной способностью C ₆₀ [3] и внутримолекулярный перенос энергии в возбужденном состоянии, характерный для нековалентных докс-комплексов [18, 36, 45], что указывает на тесную пространственную близость компонентов.

Анализ распределения размеров с помощью динамического рассеяния света

Размер и стабильность противоракового лекарственного средства в виде наночастиц в значительной степени зависят от состава среды для культивирования клеток, ионной силы и концентрации белка. Средний гидродинамический диаметр 1 мкМ C ₆₀ Комплексы -Dox 1:1 и 2:1 в физиологическом растворе (0,9% NaCl) оказались равными 135 ± 5 нм и 134 ± 6 нм соответственно, что соответствует данным предыдущих исследований [20]. Чтобы оценить стабильность в среде для культивирования клеток, 1 мкМ C ₆₀ Комплексы -Dox инкубировали при 37 ° C в течение 72 часов в RPMI с добавлением 10% FBS. Характер гранулометрического состава в этой среде (рис. 3) объясняется высоким содержанием белка, а также его вероятной агрегацией [46, 47].

Гидродинамический размер (диаметр, нм) 1 мкМ С ₆₀ Комплексы Dox в среде для культивирования клеток RPMI с добавлением 10% FBS при 0 ( a ) и 72-ч ( b ) инкубация. Интенсивность (%) в процентах от всей интенсивности рассеянного света

Данные динамического светорассеяния на 1 мкМ C ₆₀ Распределение гидродинамического диаметра нанокомплекса Dox 1:1 и 2:1 в культуре клеток с добавлением FBS показало, что их размер составлял 138 ± 6 нм и 139 ± 5 нм при немедленном измерении (рис. 3a) и 146 ± 4 нм и 144 ± 5. нм после 72 ч инкубации (рис. 3b) соответственно.

Обнаруженная стабильность максимума (около 140 нм) указывает на отсутствие дополнительной агрегации C ₆₀ -Комплексы Dox во время длительной инкубации в среде для культивирования клеток с добавлением FBS, что подтвердило их пригодность для исследований in vitro.

Жизнеспособность ячейки

Жизнеспособность лейкозных клеток человека разных линий оценивали с помощью МТТ-теста через 24, 48 и 72 ч инкубации в присутствии C ₆₀ -Докс комплексы, а также свободный докс отдельно в эквивалентных концентрациях. С ₆₀ сам по себе в концентрациях, эквивалентных концентрациям в комплексах, не влиял на жизнеспособность лейкозных клеток (данные не показаны).

На рис. 4 представлено зависимое от времени и концентрации снижение жизнеспособности лейкозных клеток при лечении Dox. Было показано, что лекарство проявляет токсичность в отношении лейкозных клеток в наномолярном диапазоне. Было обнаружено, что чувствительность лейкозных клеток к Dox соответствует порядку Molt-16, THP1, Jurkat, CCRF-CEM (менее чувствительный).

Жизнеспособность лейкозных клеток CCRF-CEM, Jurkat, THP1 и Molt16, обработанных равными дозами свободного Dox или C ₆₀ -Комплексы Dox на 24, 48 и 72 часа (* p ≤ 0,05 по сравнению с бесплатным Dox, ** p ≤ 0,05 по сравнению с C ₆₀ -Dox 1:1 комплекс, n =5)

Под действием 100 нМ Dox жизнеспособность клеток CCRF-CEM снизилась до 84 ± 7, 50 ± 4 и 34 ± 7% по сравнению с контролем через 24, 48 и 72 часа соответственно. Сравнимый паттерн токсического действия 100 нМ Dox был обнаружен в клетках Jurkat. Было обнаружено, что жизнеспособность клеток THP1 после обработки 100 нМ Dox-клетками составила 50 ± 4, 47 ± 5 и 13 ± 4% через 24, 48 и 72 часа соответственно. Полумаксимальные ингибирующие концентрации Dox (IC50) для клеток CCRF-CEM, THP1 и Jurkat через 72 часа инкубации были оценены как 80 ± 9, 43 ± 5 и 38 ± 6 нМ соответственно. Эти данные соответствуют литературным данным [48, 49]. Клетки Molt-16 оказались наиболее чувствительными к препарату, поскольку его токсический эффект обнаруживался в диапазоне от 1 до 25 нМ во все периоды инкубации клеток. Жизнеспособность клеток Molt-16, обработанных 5 нМ Dox, снижалась до 75 ± 4, 28 ± 4 и 18 ± 4% от таковой в контроле через 24, 48 и 72 часа соответственно, а значение IC50 через 72 часа составляло равняется всего 2,0 нМ. Об аналогичной высокой чувствительности клеток Molt-16 с 10-кратной более интенсивной индукцией апоптоза по сравнению с клетками Jurkat при обработке алкалоидом трав ранее сообщалось Cai et al. [50].

Клетки, обработанные свободным Dox, использовали в качестве контроля для оценки жизнеспособности под действием C ₆₀ -Докс комплексы в эквивалентных дозах препарата. Значение IC50 для бесплатного Dox и C ₆₀ Комплексы Dox были рассчитаны для каждой временной точки и линии клеток и перечислены на рис. 4.

Было показано, что как C ₆₀ Комплексы -Dox обладают более высоким токсическим потенциалом по сравнению со свободным Dox против линий лейкозных клеток человека (рис. 4).

Таким образом, наши многочисленные эксперименты показали для четырех клеточных линий различную повышенную токсичность до 3,5 раз. С ₆₀ Комплекс -Dox 1:1 показал более высокую токсичность по сравнению с комплексом 2:1. Менее выраженный эффект (снижение IC50 в ≥ 2,5 раза по сравнению с таковым для свободного Dox) комплекса 2:1 можно объяснить более высокой концентрацией C ₆₀ как его составная часть. Из-за его антиоксидантной активности [11, 13] избыток C ₆₀ может защитить клетки от оксидативного стресса, вызванного Dox [27].

Внутриклеточное накопление Free Dox и C ₆₀ -Докс Комплексы

Изучить потенциальную корреляцию усиленного токсического действия C ₆₀ -Комплексы Dox с более эффективным внутриклеточным накоплением лекарств, поглощением клетками свободного Dox и C ₆₀ -Докс изучался. Поскольку Dox обладает сильным поглощением и флуоресценцией в видимой области спектра [43, 45] (рис. 2), отслеживание Dox-комплексов возможно с помощью неинвазивных методов, основанных на прямой флуоресценции. Клетки CCRF-CEM инкубировали в присутствии 1 мкМ Dox или C ₆₀ . -Dox-комплексы в концентрации, эквивалентной лекарственному средству, исследованные с помощью флуоресцентной микроскопии и подвергнутые проточной цитометрии для количественного определения внутриклеточного уровня накопленного лекарства после 1-, 3- и 6-часовой обработки (рис. 5). Среднюю интенсивность флуоресценции каждого образца рассчитывали из логарифмических гистограмм FACS по значению соответствующего флуоресцентного сигнала Dox-красного (λ _ex =488 нм, λ _em =585/29 нм) и представлены в таблице 2. Автофлуоресценция необработанных клеток использовалась в качестве отрицательного контроля (рис. 5а).

Внутриклеточное накопление 1 мкМ свободного и C ₆₀ - комплексовал Докс. Проточная цитометрия ( a ) и изображения флуоресцентной микроскопии ( b ) клеток CCRF-CEM, инкубированных с Dox и C ₆₀ -Докс в соотношении 1:1 и 2:1 в течение 1, 3 и 6 ч. Шкала 20 мкМ

Зависимое от времени накопление 1 мкМ Dox оценивали по увеличению интенсивности флуоресценции (рис. 5, таблица 2). Изображения флуоресцентной микроскопии показывают, что C ₆₀ Комплексы -Dox усваивались быстрее, чем свободное лекарство, о чем свидетельствует гораздо более яркая внутриклеточная флуоресценция (рис. 5b). Средняя интенсивность флуоресценции клеток CCRF-CEM, обработанных 1:1 C ₆₀ -Dox-комплекс в концентрации, эквивалентной 1 мкМ Dox, увеличивался в 1,5, 1,7 и 2,2 раза по сравнению со свободным Dox через 1, 3 и 6 ч соответственно. 2:1 C ₆₀ -Dox-комплекс показал замедленное внутриклеточное накопление лекарственного средства, достигающее того же уровня, что и комплекс 1:1, через 6 часов (рис. 5, таблица 2).

Полученные данные показали, что комплексообразование Dox с C ₆₀ способствовал проникновению в клетки, но не влиял на его локализацию. Контрольное окрашивание исследуемых клеток ДНК-связывающим красителем Hoechst 33342 выявило его совместную локализацию с сигналом Dox (данные не представлены). Очевидно, молекулы Dox из C ₆₀ комплексы и свободное лекарство вошли в ядра, что отражает его антипролиферативное действие через повреждение ДНК [26,27,28]. Повышенное внутриклеточное поглощение лекарственного средства при образовании комплекса с C ₆₀ указывает на то, что последний функционирует как промотор транспорта лекарств. С ₆₀ Было показано, что наноструктура перемещается через клеточную плазматическую мембрану за счет пассивной диффузии [51] и / или эндоцитоза / пиноцитоза [52, 53], тогда как такие небольшие молекулы, как Dox, могут проникать только посредством пассивной диффузии. C ₆₀ структура напоминает структуру клатрина [54, 55], основного компонента оболочки образования пузырьков во время эндоцитоза. Следовательно, C ₆₀ может действовать как переносчик небольших ароматических молекул [56]. Напротив, ковалентная связь между носителем и грузом вносит структурные изменения в молекулу лекарства. Следовательно, паттерн накопления и взаимодействие с внутриклеточными мишенями изменяются, что приводит к полной или частичной утрате функции лекарственного средства. Лю и др. [15] показали, что C ₆₀ с двумя молекулами Dox, связанными амидной связью, был распределен преимущественно в цитоплазме.

Заключение

Физико-химические свойства C ₆₀ -Dox-комплексы с соотношением компонентов 1:1 и 2:1 и оценена их токсичность в отношении лейкозных клеток человека CCRF-CEM, Jurkat, Molt-16 и THP1.

Анализ ВЭЖХ-МС / МС выявил явные различия в хроматограммах свободного Dox и хроматограмм, высвобожденных из C ₆₀ -Докс комплексы. Комплексообразование C ₆₀ с Dox подтвержден гипохромным эффектом поглощения и тушением флуоресценции в C ₆₀ -Докс комплексы. Мы определили, что размер C ₆₀ Комплексы -Dox около 140 нм сохранялись в присутствии белка и длительной инкубации в среде. Исследования линий лейкозных клеток человека показали, что C ₆₀ Комплексы -Dox обладали более высокой цитотоксичностью по сравнению со свободным препаратом в эквивалентных концентрациях. Через 72 ч инкубации клеток значение IC50 для комплексов 1:1 и 2:1 снизилось в ≤ 3,5 и ≤ 2,5 раза соответственно по сравнению с IC 50 для свободного препарата. Комплексообразование с C ₆₀ способствовал проникновению Dox в лейкемические клетки. Обработка клеток CCRF-CEM в течение 6 часов C ₆₀ -Dox-комплексы в концентрации, эквивалентной 1 мкМ Dox, сопровождались увеличением внутриклеточного уровня препарата в 2,2 раза по сравнению с лечением свободным Dox.

Наши результаты подтверждают функцию C ₆₀ как наноноситель и перспективы его применения для оптимизации эффективности Dox против лейкозных клеток. Поскольку Докс является лишь репрезентативным или модельным веществом для многих противоопухолевых препаратов, мы ожидаем, что наши результаты могут быть перенесены на другие препараты. Увеличение поглощения лекарственного средства опухолевыми клетками и / или его противоопухолевых свойств может указывать на новые стратегии лечения. Комплексирование лекарств с наноносителями может способствовать снижению их эффективных мощностей доз и, таким образом, ослабить нежелательные побочные эффекты.

История изменений

Сокращения

C ₆₀ :

С ₆₀ фуллерен

DMSO:

Диметилсульфоксид

Dox:

Доксорубицин

ESI:

Ионизация электрораспылением

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

ВЭЖХ-МС / МС:

Высокоэффективная жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия

IC50:

Полумаксимальная ингибирующая концентрация

LOD:

Предел обнаружения

LOQ:

Limit of quantification

MRM:

Multiple reactions monitoring

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером