Нанокомплексы фуллерена C₆₀ повышают потенцию доксорубицина против лейкемических клеток in vitro

Аннотация

Традиционная химиотерапия часто терпит неудачу из-за тяжелых побочных эффектов и быстрого возникновения мультилекарственной устойчивости. Мы изучили фуллерен C₆₀ как наноразмерный переносчик для доксорубицина (Dox) для улучшения доставки препарата специфически в лейкемические клетки. Нековалентные комплексы C₆₀-Dox (соотношения 1:1 и 2:1) характеризовали УФ/Виз, динамическим световым рассеянием и HPLC-MS/MS, подтверждая стабильный размер наночастиц 140 нм, подходящий для биологического использования. В лейкемических клеточных линиях (CCRF-CEM, Jurkat, THP-1, Molt-16) эти комплексы демонстрировали до 3,5-кратную большую цитотоксичность, чем свободный Dox, при наномолярных концентрациях, с доказательствами внутриклеточного накопления, подтверждающими усиленную доставку. Эти находки указывают на фуллерен C₆₀ как перспективный нанопереносчик для улучшения эффективности Dox против лейкемии.

Введение

Нанобиотехнология предлагает путь к более селективным и мощным противораковым терапиям. Фуллерен C₆₀, сферическая углеродная наноструктура, обладает уникальными физико-химическими свойствами, интринсической антиоксидантной активностью и доказанными возможностями загрузки лекарств. Доксорубицин, хотя и эффективен, ограничен кардиотоксичностью и оксидативным стрессом. Сочетание Dox с C₆₀ использует антиоксидантные свойства фуллерена и потенциал доставки лекарств для смягчения побочных эффектов и улучшения таргетинга опухоли. Предыдущие исследования показывали, что нековалентные комплексы C₆₀ могут усиливать антираковину активность in vitro и in vivo. Это исследование оценивает физико-химические характеристики, клеточный улавливание и цитотоксическую мощность комплексов C₆₀-Dox против человеческих лейкемических клеточных линий.

Методы

Материалы

Химикаты и клеточные линии получены от стандартных поставщиков (Biochrom, Sigma-Aldrich, Leibniz Institute DSMZ). Условия клеточного культивирования соответствовали ISO-стандартным протоколам.

Подготовка комплексов

Первичные водные коллоиды C₆₀ готовили ультразвуковой соникацией, достигая чистоты 150 мкг/мл и гидродинамического диаметра 100 нм. Dox растворяли в концентрации 150 мкг/мл и смешивали с C₆₀ в весовых соотношениях 1:1 или 2:1, сонировали 30 мин и взбалтывали 24 ч при комнатной температуре. Избыток свободного препарата удаляли диализом. Финальные концентрации комплексов составляли 75 мкг/мл (1:1) и 100/50 мкг/мл (2:1). Стабильность подтверждали в течение 6 месяцев в физрастворе.

Аналитическая характеристика

HPLC-MS/MS (Shimadzu LCMS-8040) квантифицировал высвобождение Dox, используя C18 колонку и мобильную фазу ацетонитрил:0,1% муравьиная кислота вода 80:20. УФ/Виз поглощение и флуоресценция регистрировали на Tecan Infinite M200 Pro. Динамическое световое рассеяние (Malvern Zetasizer Nano S) измеряло размер частиц в ФСБ и RPMI-1640 +10% ФКС.

Жизнеспособность клеток

MTT-тесты оценивали жизнеспособность 10⁴ клеток/колодку после 24, 48 и 72 ч экспозиции свободного Dox или комплексов C₆₀-Dox при 0,1–100 мкМ. IC₅₀ значения получали нелинейной регрессией (GraphPad Prism 7).

Исследования улавливания

Флуоресцентная микроскопия (Keyence BZ-9000) и потоковая цитометрия (BD FACSJazz) квантифицировали внутриклеточный Dox после 1, 3 и 6 ч экспозиции 1 мкМ свободного или комплексированного препарата в клетках CCRF-CEM.

Результаты

Стабильность и размер комплексов

HPLC-MS/MS хроматограммы раскрыли отличные времена удержания для свободного Dox (11,66 мин) против комплекс-связанного Dox (9,44 мин), подтверждая формирование комплекса. УФ/Виз спектры показали 30% гипохромический сдвиг поглощения, в то время как кенчинг флуоресценции (~50% при 3 мкМ) указывал на тесное π-π стакирование между Dox и C₆₀. DLS определил средний гидродинамический диаметр ~140 нм, стабильный в ФСБ и после 72 ч инкубации в RPMI-1640 +10% ФКС.

Усиленная цитотоксичность

Все четыре лейкемические линии демонстрировали наномолярную чувствительность к Dox, со значениями IC₅₀ от 2 нМ (Molt-16) до 80 нМ (CCRF-CEM). Комплексы C₆₀-Dox последовательно снижали значения IC₅₀ до 3,5-кратно по сравнению со свободным препаратом, при этом комплекс 1:1 превосходил соотношение 2:1. Более высокое содержание C₆₀ в комплексе 2:1 может оказывать антиоксидантную защиту, смягчая Dox-индуцированный оксидативный стресс.

Повышенное внутриклеточное улавливание

Флуоресцентная микроскопия и потоковая цитометрия доказали, что комплексы C₆₀-Dox проникают в клетки быстрее свободного Dox, достигая 1,5–2,2-кратного увеличения внутриклеточной флуоресценции к 6 ч. Dox локализовался в ядре в обеих формулировках, как подтвердило колокализация с окраской Hoechst 33342.

Заключение

Фуллерен C₆₀ формирует стабильные 140-нм нековалентные комплексы с доксорубицином, которые заметно усиливают его цитотоксичность против человеческих лейкемических клеток. Нанопереносчик облегчает более быстрое клеточное улавливание без изменения локализации препарата, достигая до 3,5-кратного улучшения мощности при эквивалентных дозах. Эти результаты поддерживают дальнейшее развитие нанокомплексов C₆₀ для снижения эффективных концентраций Dox, потенциально уменьшая кардиотоксичность и другие неблагоприятные эффекты в клинических условиях.