Температурно- и pH-чувствительные наногели на базе PNIPAM для двойной стимулируемой доставки β-лапахона

Аннотация

Наногели из поли-N-изопропилакриламида (PNIPAM) кополимеризировали с акриловой кислотой (AAc) для настройки нижней критической температуры растворимости (НКТР). Полученные наногели PNIPAM-co-AAc демонстрируют два различных объемных фазовых перехода, причем НКТР растет с увеличением содержания AAc. При загрузке β-лапахоном (β-ЛП) освобождение лекарства управляется как температурой, так и pH, и сильно зависит от соотношения AAc. В частности, формуляция PNIPAM-co-AAc20 удерживает <10 % выпуска препарата при кислом–нейтральном pH и температуре тела, в то время как при щелочном pH освобождается >70 %. Эти результаты показывают, что температурно- и pH-чувствительные наногели PNIPAM являются перспективными переносчиками для кишечно-специфической доставки лекарств при пероральном введении.

Введение

Стимулореагирующие нанопереносчики все чаще применяются в доставке лекарств, визуализации и диагностике. Среди используемых триггеров — pH, температура, редокс, магнитное поле, свет — температура и pH остаются наиболее широко используемыми для контролируемого выпуска. PNIPAM, термореагирующий полимер, сворачивается выше своей НКТР (~32 °C) из-за гидрофобных взаимодействий, в то время как депротонированные карбоксильные группы AAc вводят дополнительное электростатическое отталкивание, сдвигая НКТР вверх. Кополимеризация PNIPAM с AAc таким образом создает настраиваемую платформу, реагирующую и на температуру, и на pH. β-Лапахон, природный антираковый агент, имеет узкое терапевтическое окно из-за быстрого метаболизма и офф-таргет токсичности; инкапсуляция в реагирующие наногели может смягчить эти недостатки. В данном исследовании мы сообщаем о синтезе наногелей PNIPAM-co-AAc с разным содержанием AAc, их поведении при двойной стимуляции выпуска препарата и цитотоксической эффективности в фибробластах.

Методы

Материалы

NIPAM (97 %, Sigma-Aldrich), N,N'-метиленбисакриламид (MBA), AAc, дистиллированная вода, EtOH, персульфат калия (KPS, 98 %, Dae Jung), β-ЛП (Natural Products) и ФСБ были аналитической чистоты и использованы как получено.

Синтез наногелей PNIPAM-co-AAc

В колбе 500 мл растворяли 2,26 г NIPAM, 0,154 г MBA и 0–0,145 г AAc в 200 мл воды при 75 °C. После пурживания азота добавляли 37,5 мг KPS и рефлюксировали 10 мин, получая мутный раствор. Полимер диализировали (12–14 кДа) 7 дней, заморозили в жидком азоте и сублимировали 3 дня для получения сухих наногелей (PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10, PNIPAM-co-AAc20).

Загрузка β-ЛП

1 мг сухого наногеля растворяли в 1 мл EtOH, добавляли 0,1 мг β-ЛП. Смесь перемешивалиovernight в темноте, затем диализировали (6–8 кДа), заморозили и сублимировали. Полученные загруженные β-ЛП наногели хранили при 4 °C.

Характеризация

Морфологию изучали ТЭМ (200 кВ) и FE-СЭМ (15 кВ). FT-IR спектры записывали на спектрометре Nicolet 6700. Загрузку и выпуск препарата квантовали UV-Vis спектроскопией (200–800 нм). НКТР определяли динамическим световым рассеянием (ДСР) с шагом 1 °C от 30 до 50 °C.

Исследование выпуска препарата

10 мл загруженных β-ЛП наногелей помещали в диализационные трубки (3,5 кДа) и инкубировали при 24 °C и 37 °C в ФСБ при pH 2, 4, 7,4 и 8,0. В заданные временные точки (0–12 ч) отбирали 2 мл аликвот и анализировали UV-Vis. Накопленный выпуск рассчитывали относительно общего количества загруженного β-ЛП.

Тесты живучести клеток

Фибробласты NIH3T3 (2×10⁴ клеток/колодез) обрабатывали свободным β-ЛП, PNIPAM-co-AAc5-β-ЛП или PNIPAM-co-AAc20-β-ЛП в концентрациях 0–20 мкг/мл. Через 3 ч проводили MTT-тест (595 нм) и окраску LIVE/DEAD® для оценки цитотоксичности.

Результаты и обсуждение

Подготовка и морфология

ТЭМ и СЭМ изображения (Рис. 1) показали монодисперсные наногели со средним диаметром ~250 нм для PNIPAM-co-AAc5. Зета-потенциал снижался от -13,6 мВ (PNIPAM) до -23,6 мВ (PNIPAM-co-AAc20), отражая увеличение поверхностных карбоксильных групп.

Температурно-реагирующее поведение

Измерения ДСР (Рис. 2) выявили два различных перехода набухания-сворачивания. Первый переход начинался при ~30 °C, второй появлялся около 40 °C, сдвигаясь до 45 °C для PNIPAM-co-AAc20. Таким образом, НКТР растет с содержанием AAc, в согласии с предыдущими отчетами.

Двойной стимулируемый выпуск препарата

При 37 °C PNIPAM-co-AAc20 выпускал только ~61 % β-ЛП за 6 ч, тогда как PNIPAM и PNIPAM-co-AAc5 выпускали ~80 %. При pH 8,0 выпуск из PNIPAM-co-AAc20 увеличивался на ~10 % по сравнению с нейтральным или кислым pH (Рис. 3). Эти результаты подтверждают, что выпуск препарата синергически усиливается при щелочном pH и повышенной температуре.

In vitro цитотоксичность

Свободный β-ЛП снижал живучесть клеток сильнее, чем наногелевые формуляции. PNIPAM-co-AAc20 демонстрировал более высокую живучесть при 20 мкг/мл, что коррелирует с его меньшим выпуском препарата при 37 °C. Окраска живых/мертвых клеток (Рис. 4) показала выраженную цитотоксичность для PNIPAM-co-AAc5-β-ЛП через 3 ч, в то время как PNIPAM-co-AAc20-β-ЛП оставался в основном нетоксичным до 6 ч при pH 8,0, где наблюдался синергический эффект гибели клеток.

Заключение

Мы успешно спроектировали наногели PNIPAM-co-AAc, чья НКТР настраивается содержанием AAc. Формуляция с высоким AAc (20 %) демонстрирует минимальный выпуск β-ЛП при физиологической температуре, но эффективно высвобождает препарат при щелочном pH, имитирующем среду тонкого кишечника. Эти двойно-стимулируемые наногели представляют убедительную платформу для пероральной кишечно-таргетированной доставки β-лапахона.