Ультрачувствительный безметкачный иммуноассей на гибридных плазмонных биосенсорах Au наночастиц-графен оксид

Введение

Углерод-базированные наноматериалы — графен, углеродные нанотрубки, графен оксид (GO) — стали основой в биосенсорике благодаря их исключительным электрическим, оптическим и поверхностно-химическим свойствам. Двумерная структура GO и киснутые функциональные группы (эпоксиды, гидроксили, карбоксили) придают высокую аффинность к белкам и позволяют ковалентную связь, делая его привлекательным субстратом для электрохимических, флуоресцентных, SPR и ЛПР сенсоров. Золотые наночастицы (AuНЧ) привносят настраиваемое плазмонное поглощение, биосовместимость и простую поверхностную химию, позволяя им выступать усилителями сигналов или оптическими тегами. Когда AuНЧ декорируют GO, гибрид наследует быструю связь GO и интенсивный ЛПР AuНЧ, ведуя к усиленной чувствительности в иммуноассеях, ДНК детектировании и ферментативных анализах. Несмотря на обширные электрохимические и SERS исследования, ни одного быстрого, колориметрического или безметкачного иммуноассея на голых AuНЧ-GO гибридах не сообщалось доселе. Это исследование заполняет этот пробел, разрабатывая хемисорбционный, ЛПР-усиленный иммуноассей, работающий в водном буфере и терпящий распространенные интерференты.

Методы/Эксперимент

Материалы

Графит (Graphene Supermarket), GO (модифицированный метод Хэммерса, 0,1–1 мкм хлопья, 1,1 нм толщина), цистамин дигидрохлорид (Cys, 96 %), HAuCl₄·3H₂O (99,99 %), натрий цитрат, BSA, анти-BSA (кроличий IgG), NHS и EDC все получены от Sigma-Aldrich или Alfa Aesar. Все реактивы использовали без дополнительной очистки.

Синтез AuНЧ

AuНЧ синтезировали цитратной редукцией: 15 мл 1 мМ HAuCl₄ рефлюксировали при 550 °C, 1100 об/мин; добавили 1,8 мл 38,8 мМ натрий цитрат. Через 5 мин смесь кипятили при 400 °C, 900 об/мин 30 мин и охлаждали до комнатной температуры. Процедура дает ~15 нм сферические AuНЧ; использование 0,8 мл цитрата производит ~60 нм частицы. Реакция: HAuCl₄ + C₆H₅O₇Na₃ → Au(s) + CO₂ + HCOOH.

Подготовка GO-BSA антигенной мишени

GO листы (0,1 г/л) активировали EDC (400 мкМ) и NHS (100 мкМ) (1:1 объемное соотношение). BSA (20 мкл, 100 мкг/мл) ковалентно сцепляли через амидную связь и очищали повторной центрифугацией. Рисунок 1 иллюстрирует рабочий процесс GO-BSA конъюгации.

GO-BSA взаимодействие. Карбоксил группа GO листов может быть активирована EDC/NHS реакцией и подготовкой GO на основе антигенной мишени для GO-BSA

Подготовка AuНЧ-антиBSA зонда

AuНЧ функционализировали Cys (10 мМ, 2 ч, RT) для введения экспозированных –NH₂ групп. Анти-BSA (20 мкл, 100 мкг/мл) затем сцепляли через амидные связи без дополнительной активации, с последующей центрифугацией для удаления несвязанного антитела. Серийные разведения от 100 мкг/мл до 1 пг/мл дали диапазон AuНЧ-антиBSA зондов (Рис. 2a). AuНЧ-GO-антиBSA композиты собирали EDC/NHS активацией GO карбоксилов и ковалентным присоединением Cys-модифицированных AuНЧ, затем антителой сцепкой (Рис. 2b).

AuНЧ-антиBSA и AuНЧ-GO-антиBSA взаимодействия. Подготовка a AuНЧ и b AuНЧ-GO на основе антителого зонда

Методы характеризации

Структурная и оптическая характеристика использовали FE-TEM, HR-TEM, SEM (JEOL JSM-7800F), UV-vis спектроскопию (U-2900, Hitachi), Raman микроскопию (MRI, Protrustech), FTIR (Bruker Vertex 80v ATR) и XPS (Национальный синхротронный центр радиации). Размер AuНЧ, распределение и поверхностная химия подтверждались по всем образцам.

Результаты и обсуждение

Морфология и состав

SEM и TEM раскрыли равномерные 60-нм AuНЧ, равномерно распределенные на сморщенных GO листах (Рис. 3). XPS подтвердил наличие C-C (sp²), C-C (sp³), C-O, C=O и O-C=O функциональных групп на GO, в то время как Au 4f пики верифицировали интеграцию AuНЧ.

Анализ поверхностной морфологии нанокомпозита. a SEM изображения GO листа и b TEM изображение AuНЧ-GO композита. c TEM изображение ERGO AuНЧ-GO пленки

Спектроскопическая характеристика GO

Высокоразрешающие C 1s XPS, Raman и ATR-FTIR спектры подтверждают характерные кислородсодержащие функциональные группы GO (sp² C, эпоксиды, гидроксили, карбонилы, карбоксили). Raman пики при 1355 см⁻¹ (D), 1614 см⁻¹ (G) и 2714 см⁻¹ (2D) корроборируют слоистую структуру (Рис. 4).

Спектральный анализ GO листов. a XPS высокоразрешающий скан в области C1s, b Raman, и c FTIR

Белковое взаимодействие и ЛПР отклик

UV-vis спектры AuНЧ (15 нм и 60 нм) показывают ЛПР пики при 520 нм и 540 нм соответственно. GO одна демонстрирует π-π* абсорбцию при 230 нм и n-π* при 300 нм. После функционализации AuНЧ-Cys-антиBSA конъюгаты показывают двойные пики при 540 нм (AuНЧ) и 755 нм (AuНЧ-Cys-антиBSA) с концентрационно-зависимым сдвигом (Рис. 5). Калибровочные кривые (y = 2,43 + 0,25 x, R² = 0,91 для 540 нм; y = 2,56 + 0,31 x, R² = 0,96 для 760 нм) подтверждают линейность по 1,45 нМ – 145 фМ анти-BSA.

Анализ UV-vis абсорбционных спектров для AuНЧ с антиBSA взаимодействием откликом. a SP абсорбционные спектры AuНЧ, b GO-связанный BSA, c AuНЧ-анти-BSA зонд, и d Калибровочные кривые для AuНЧ с антиBSA взаимодействием откликом при разных разведениях концентраций антиBSA белка от 1,45 нМ ~ 145 фМ

AuНЧ-GO-антиBSA гибриды далее усиливают ЛПР сигнал. При добавлении GO-BSA мишеней, 540-нм пик линейно сдвигается с концентрацией анти-BSA (1,45 нМ–145 фМ), давая LOD 145 фМ (Рис. 6). Калибровка для AuНЧ-GO зонда (f(x) = 0,918 + 0,124 x, R² = 0,94) и для GO одной (f(x) = 0,791 + 0,057 x, R² = 0,954) демонстрируют превосходную чувствительность гибридной системы.

Анализ UV-vis абсорбционных спектров для иммунного отклика. a AuНЧ-связанный GO и GO-связанный BSA, b AuНЧ и GO-связанный анти-BSA, c AuНЧ-GO-антиBSA зонд, и d AuНЧ-GO-антиBSA зонд и GO-BSA мишень для иммунного отклика

Исследования интерференции с 10 нг/мл hCG показали минимальную перекрестную реактивность (R² = 0,89 для AuНЧ-GO; 0,73 для GO одной), подтверждая робастность анализа. Сенсор сохранял производительность после четырех циклов регенерации, указывая на высокую поверхностную стабильность.

Заключение

Мы спроектировали биосовместимый AuНЧ-GO гибрид, использующий ЛПР для достижения безметкачного детектирования анти-BSA при 145 фМ. Нанокомпозит демонстрирует высокую биоаффинность, быстрый отклик и устойчивость к распространенным интерферентам, делая его убедительной платформой для точечных иммуноассеев. Будущая работа изучит мультиплексное детектирование, интеграцию в микродинамические устройства и адаптацию к клинически релевантным биомаркерам.

Аббревиатуры

Ag:

Серебро

AntiBSA:

Антитело к сывороточному альбумину грызуна

Au:

Золото

AuNP:

Золотая наночастица

BSA:

Сывороточный альбумин грызуна

Cys:

Цистамин

EDC:

1-Этил-3-(3-диметиламинпропил)карбодиимид

FEG-TEM:

Полево-эмиссионный передаточный электронный микроскоп

FTIR:

Фурье-трансформированный инфракрасный спектрометр

GO:

Графен оксид лист

HR-TEM:

Высокоразрешающий передаточный электронный микроскоп

LOD:

Предел детектирования

LSPR:

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс

MOA:

8-Меркаптооктановая кислота

NHS:

N-Гидроксисукцинимид

Pd:

Палладий

POCT:

Точечное тестирование

Pt:

Платина

RGO:

Редуцированный графен оксид

SAMs:

Самоорганизующиеся монослои

SERS:

Поверхностно-усиленное Раман рассеяние

UV-vis:

Ультрафиолетово-видимый

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

ZnO:

Оксид цинка