Повышенная биосовместимость в массивах анодных TaO x нанотрубок

Фон

Тантал (Ta) - редкий, твердый, высококоррозионно-стойкий и биоинертный металл [1,2,3]. Окисление материала тантала за счет образования на его поверхности очень тонкой непроницаемой оксидной пленки способствует его биосовместимости. Высокая гибкость и биосовместимость тантала обеспечивает его клиническое применение, например, в зубных имплантатах, ортопедических имплантатах и ​​реконструкции костей [4,5,6]. Недавно было обнаружено, что тантал обладает лучшей биосовместимостью, чем титан, такой как более обильное образование внеклеточного матрикса, отличная адгезия и рост клеток, а также гораздо более высокая плотность живых клеток на поверхности [7,8,9]. С другой стороны, несколько исследований доказали, что отличительные физико-химические свойства геометрии наноструктурированной поверхности являются основным фактором, влияющим на поведение клеток [10,11,12]. Идеальная поверхность биоматериала должна обеспечивать оптимальную среду для прорастания клеток. Ruckh et al. продемонстрировали, что анодированные нанотрубки Ta обеспечивают подложку для улучшенной остеоинтеграции по сравнению с плоской поверхностью [13]. Недавно разработанный пористый танталовый материал, имитирующий свойства кости, обеспечивает прорастание мягких тканей и кости, что обеспечивает хорошую биологическую фиксацию [14,15,16,17]. Высокая стабильность и потенциал к заживлению пористого тантала помогают заполнить промежутки между костными структурами во время реконструктивной хирургии. Таким образом, пористый тантал вновь вызвал большой интерес в области биоматериалов из-за его нескольких преимуществ по сравнению с другими трансплантатами, таких как отсутствие заболеваемости донорством, высокая стабильность, отличные остеоинтеграционные свойства и предотвращение потенциального риска передачи инфекционных заболеваний [18,19,20 , 21]. Недавний клинический обзор показал, что пациенты, получившие пористые танталовые вертлужные чашки, имели более высокую степень фиксации имплантата по сравнению с пациентами с титановыми (Ti) чашками, покрытыми гидроксиапатитом [22,23,24,25].

Недавно мы разработали самоорганизующийся TiO ₂ нанотрубки разного диаметра методом электрохимического анодирования [26, 27]. Мы обнаружили, что клетки фибробластов человека демонстрируют более очевидное поведение, зависящее от диаметра, в сверхкритическом CO ₂ (ScCO ₂ ) -обработанных нанотрубок, чем на уже анодированных [27]. Далее мы изготовили TiO ₂ , декорированный Ag. нанотрубки методом электронно-лучевого испарения и обнаружили, что нанотрубки наименьшего диаметра (25 нм), украшенные серебром, проявляют наиболее очевидную биологическую активность в обеспечении адгезии и пролиферации человеческих фибробластов, а также человеческих эпителиальных клеток носа [26]. В этом исследовании мы изготовили TaO _x нанотрубки разного диаметра аналогичным методом электрохимического анодирования. Поведение клеток, включая адгезию и пролиферацию клеток, в зависимости от диаметра TaO _x нанотрубки. Целью данного исследования является изучение биосовместимости самоорганизующегося TaO _x массивы нанотрубок с различным диаметром нанотрубок, изготовленные электрохимическим анодированием.

Методы

Подготовка TaO _x Нанотрубки

Листы Ta были приобретены у ECHO Chemical (толщина 0,127 мм, чистота 99,7%, CAS № 7440-25-7). Перед процессом анодирования листы Ta подвергали ультразвуковой очистке в ацетоне, изопропаноле, этаноле и воде. Все эксперименты по анодированию проводились при 20 ° C в растворе серной кислоты, содержащем 4,9 мас.% HF, который был приготовлен из химически чистых химикатов и деионизированной воды. Использовалась двухэлектродная электрохимическая ячейка с Ta в качестве анода и Pt в качестве противоэлектрода. Напряжения были отрегулированы от 10 до 40 В, чтобы получить TaO _x диаметры нанотрубок от 20 до 90 нм. Облучение УФ-светом низкой интенсивности (около 2 мВт / см ² ) с люминесцентными лампами черного света на TaO _x образцы нанотрубок в течение 8 часов были взяты перед испытаниями на биосовместимость.

Характеристика материала

Морфология поверхности, внутренний и внешний диаметр, толщина стенки и длина TaO _x нанотрубки были охарактеризованы с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Рентгеновская дифракция (XRD) и просвечивающая электронная микроскопия (TEM), оснащенная энергодисперсионным спектрометром (EDS), были использованы для изучения кристаллической структуры TaO _x массивы нанотрубок. Измерения краевого угла смачивания проводились для оценки смачиваемости поверхности TaO _x образцы нанотрубок методом растяжения с использованием горизонтального микроскопа с угломерным окуляром. В качестве тестовых жидкостей для измерений использовались вода и питательная среда.

Культура клеток фибробластов человека

Человеческие фибробласты MRC-5 (BRCC, Центр сбора и исследования биоресурсов, Синьчжу, Тайвань, BCRC No. 60023) помещали в 10-сантиметровый планшет для тканевых культур и культивировали с минимальной необходимой средой Игла (Gibco), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). ), 2 мМ l-глутамина, 1,5 г / л бикарбоната натрия, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 1,0 мМ пирувата натрия и в 5% CO ₂ при 37 ° С. Затем клетки засевали в автоклавированный TaO _x листы помещают на дно 12-луночного планшета для культивирования (Falcon) для дальнейшего изучения.

Анализ клеточной адгезии

Клетки были засеяны на каждый TaO _x лист плотностью 2,5 × 10 ³ клеток / см ² и инкубировали в 5% CO ₂ при 37 ° C в течение 3 дней и дважды промыть PBS. Прилипшие к субстрату клетки фиксировали в течение 1 ч в 4% параформальдегиде при комнатной температуре с последующими двумя промываниями в фосфатно-солевом буфере (PBS) и пермеабилизацией 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) в PBS в течение 15 мин при 4 ° С. После промывки PBS актиновую нить метили инкубацией с родамином фаллоидином (Life Technologies) при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем ядра клеток окрашивали путем инкубации с диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (Thermo FisherScientific) в течение 5 мин. Клетки анализировали под флуоресцентным микроскопом (AX80, Olympus) для изучения морфологии клеточной адгезии и расположения цитоскелета. Для наблюдения с помощью SEM клетки фиксировали 2,5% раствором глутаральдегида (Merck) в течение 1 ч при комнатной температуре, затем дважды промывали раствором PBS, дегидратировали в серии этанола (40, 50, 60, 70, 80, 90 и 100%). %), а критическая точка была высушена в сушилке для определения критической точки (CPD 030, Leica). Перед наблюдением с помощью СЭМ на образцы была нанесена тонкая пленка платины.

Анализ пролиферации клеток

Ячейки были засеяны на каждом TO _x подложки плотностью 1 × 10 ⁴ клеток / см ² и культивировали в течение 1 недели. Через 1 неделю образцы дважды промывали PBS и оценивали пролиферацию клеток с использованием набора реагентов WST-1 (Roche, Penzberg, Germany). К каждому образцу добавляли среду, содержащую 10% реагента для пролиферации клеток WST-1, и инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO ₂ . при 37 ° C в течение 2 ч. Раствор из каждой лунки переносили в 96-луночный планшет. Оптическую плотность раствора измеряли при 450 нм с помощью спектрофотометра (Spectral Max250).

Статистический анализ

Все эксперименты проводились в трех экземплярах, и было проведено не менее трех независимых экспериментов. Данные были представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD) и проанализированы с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения SPSS 12.0 (SPSS Inc.). А п значение <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты и обсуждение

На рис. 1a – e показаны СЭМ-изображения плоской фольги Ta и анодированного TaO _x массивы нанотрубок со средним диаметром нанотрубок 20, 35, 65 и 90 нм соответственно. Все как анодированный TaO _x нанотрубки демонстрируют четко выраженную нанотрубчатую структуру, а их диаметр почти пропорционален приложенным напряжениям. Среди этих образцов нанотрубки диаметром 20 нм показывают относительно нечеткую нанотрубчатую поверхность, как показано в увеличенной области, взятой из рис. 1b. Это наблюдение можно объяснить более слабой напряженностью поля при низковольтном режиме в процессе анодирования. На рисунке 2 также показан кросс-сеанс всех TaO _x нанотрубки и соответствующие им длины нанотрубок. Анализ XRD и TEM был использован для дальнейшей идентификации TaO _x кристалличность нанотрубок. Как показано в спектрах XRD на рис. 3a, наблюдаются только пики, относящиеся к фольге Ta (карта JCPDS № 04–0788), что свидетельствует о том, что TaO _{x в исходном состоянии.} нанотрубки, возможно, представляют собой аморфную фазу. На рисунке 3b показано типичное изображение ПЭМ, полученное с TaO _{x диаметром 90 нм.} нанотрубка отделилась от образца после анодирования, обнажив четко очерченную нанотрубчатую структуру. Безупречная дифракционная картина на вставке подтверждает, что TaO _x нанотрубки некристаллические.

SEM-изображения, показывающие a Поверхность фольги Ta и самоорганизованный TaO _x нанотрубки диаметром b 20, c 35, d 65 и e 90 нм соответственно

СЭМ-изображения показывают поперечные сечения TaO _x нанотрубки диаметром a 20, b 35, c 65 и d 90 нм соответственно

а Спектры XRD после анодирования TaO _x нанотрубки разного диаметра и b Изображение ПЭМ, полученное с анодированного TaO _x нанотрубка диаметром 90 нм. На вставке также показана соответствующая дифракционная картина

Предыдущее исследование показало, что прикрепление, распространение и организация цитоскелета клеток значительно лучше на гидрофильных поверхностях по сравнению с гидрофобными поверхностями [28]. Das et al. далее указали, что низкий угол смачивания подразумевает высокую поверхностную энергию, что также является решающим фактором, способствующим лучшему прикреплению клеток [29]. Таким образом, важно понимать влияние TaO _x топография нанотрубок на смачиваемость поверхности. Как показано на рис. 4, все анодированные TaO _x нанотрубки очень гидрофильны, поскольку их краевые углы намного меньше 90 °. Кроме того, было обнаружено, что их краевые углы монотонно уменьшаются при уменьшении диаметра нанотрубок до 35 нм, а затем обратно пропорционально увеличиваются при уменьшении диаметра до 20 нм. Мы также обнаружили, что TaO _x Образцы нанотрубок демонстрируют аналогичную тенденцию при использовании воды или культуральной среды в качестве тестовых жидкостей. Мы пытаемся объяснить наблюдаемое поведение смачиваемости на основе закона Венцеля, который описывает малый угол смачивания гидрофильных материалов [30]. В модели Венцеля увеличение шероховатости поверхности гидрофильного материала приведет к уменьшению угла смачивания, и вода заполнит канавки под каплей. Здесь мы используем коэффициент шероховатости, то есть физическую площадь поверхности нанотрубок на единицу площади проекции, чтобы оценить геометрическую шероховатость TaO _x образцы нанотрубок [31]. Как показано на рис. 5, с внутренним диаметром D , толщина стенки W , и длина нанотрубки L , коэффициент чисто геометрической шероховатости G можно рассчитать как [4π L { D + W } / {√3 (D + 2 W) ² }] + 1 . Этот расчет предполагает, что все поверхности нанотрубок идеально гладкие. Рассчитанные коэффициенты шероховатости для всех образцов нанотрубок приведены в таблице на рис. 5. За исключением образца диаметром 20 нм, нанотрубки меньшего диаметра имеют большую геометрическую шероховатость и, таким образом, считается, что они демонстрируют лучшую гидрофильность в соответствии с моделью Венцеля. Этот вывод согласуется с нашим результатом о том, что краевой угол уменьшается с уменьшением диаметра нанотрубки до 35 нм. Это также хорошо объясняет, что нанотрубки диаметром 20 нм, которые имеют относительно нечеткую нанотрубчатую поверхность, имеют меньшую геометрическую шероховатость и более низкую гидрофильность, чем другие.

а - j Оптические изображения, показывающие капли воды и питательной среды на a , f Поверхность фольги Ta и самоорганизованный TaO _x нанотрубки диаметром b , г 20, c , ч 35, d, i 65 и e , j 90 нм соответственно. Углы смачивания обозначены на изображениях

Принципиальная схема идеализированной нанотрубчатой ​​структуры с внутренним диаметром D , толщина стенки W , и длина нанотрубки L . Рассчитанные коэффициенты шероховатости для всех образцов нанотрубок в этом исследовании приведены в таблице

Поведение клеток фибробластов человека в ответ на плоскую фольгу Ta и TaO _x массивы нанотрубок были дополнительно изучены. Чтобы оценить прикрепление клеток фибробластов на TaO _x нанотрубок, актин цитоскелета был окрашен родамином фаллоидином, чтобы выразить красную флуоресценцию, и ядра, окрашенные DAPI, чтобы выразить синюю флуоресценцию. Иммуноокрашивание актина показывает различимую морфологию контакта клетки с материалом для плоской фольги Ta и TaO _x нанотрубки разного диаметра (см. рис. 6). Хорошо известно, что клетки сначала должны прикрепиться к поверхности материала, а затем распространяться для дальнейшего деления клеток. Лучшая адгезия клеток может вызвать большую активацию внутриклеточных сигнальных каскадов через интегрин, связанный с актиновым цитоскелетом [32,33,34]. FE-SEM использовался для подробного наблюдения за клеточной адгезией (см. Рис. 7). Фибробласты диаметром 35 нм демонстрируют отличную адгезию клеток с удлиненной плоской морфологией. С другой стороны, эти фибробласты на фольге Ta и TaO диаметром 90 нм _x нанотрубки показывают менее прикрепленные клетки и в некоторой степени отсутствие распространения клеток. Зона покрытия клеток на нанотрубках была дополнительно оценена с помощью программного обеспечения ImageJ и отмечена на этих изображениях SEM. Подобно тенденции краевых углов, было обнаружено, что зона покрытия монотонно уменьшается при уменьшении диаметра нанотрубки до 35 нм, а затем обратно пропорционально увеличивается при уменьшении диаметра до 20 нм. TaO _{x диаметром 35 нм} нанотрубка действительно показывает самую большую зону покрытия ячейки. Известно, что клетки распознают особенности поверхности, когда обнаружено подходящее место для адгезии. Предполагается, что клетки могут стабилизировать свои контакты на TaO _x нанотрубки путем формирования фокальных адгезий и зрелых актиновых волокон с последующим привлечением микротрубочек тубулина [35]. Актиновый цитоскелет связан с интегринами, расположенными внутри спаек. Наши результаты показывают, что цитоскелет на нанотрубках диаметром 35 нм может быть сформирован лучше, чем цитоскелет на плоской фольге из Ta или другом TaO _x массивы нанотрубок.

Изображения прикрепления клеток фибробластов на a с помощью флуоресцентной микроскопии Ta фольга и самоорганизованный TaO _x нанотрубки диаметром b 20, c 35, d 65 и e 90 нм соответственно. Красная флуоресценция указывает на филамент актина белка цитоскелета, а синяя флуоресценция указывает на ядра

а - е СЭМ-изображения, показывающие клеточную адгезию и пролиферацию клеток фибробластов человека на a Поверхность фольги Ta и самоорганизованный TaO _x нанотрубки диаметром b 20, c 35, d 65 и e 90 нм соответственно. Зоны покрытия ячеек на образцах, оцененные программой ImageJ, обозначены на изображениях

Анализ WST-1 использовали для дальнейшей оценки пролиферации клеток фибробластов на TaO _x нанотрубки разного диаметра. На рисунке 8 показано сравнение оптических плотностей, измеренных по результатам анализа WST-1. Мы обнаружили, что пролиферация клеток наиболее высока для TaO _{x диаметром 35 нм.} образец нанотрубки. Однако нет существенной разницы между группой Ta и TaO _x массивы нанотрубок. Кроме того, пролиферация клеток и смачиваемость поверхности демонстрируют почти ту же тенденцию, что и TaO _x диаметры нанотрубок. Это наблюдение предполагает, что не только диаметр нанотрубки, но и смачиваемость поверхности сильно влияют на адгезию клеток и последующее растекание. Другими словами, по сравнению с нанотрубками диаметром 35 нм, нанотрубки диаметром 20 нм могут давать больше фокальных точек для клеток фибробластов, но их более низкая гидрофильность устраняет некоторые эффективные фокальные контакты и, таким образом, препятствует прикреплению клеток. В конце концов, TaO _{x диаметром 35 нм} нанотрубки демонстрируют самую высокую биосовместимость среди всех образцов.

Оптическая плотность (QD), измеренная после культивирования клеток фибробластов человека на фольге Ta и самоорганизованном TaO _x нанотрубки разного диаметра. Значения OD с их стандартными отклонениями перечислены в прилагаемой таблице

Выводы

В заключение, в данной работе изучается биосовместимость анодированного TaO _x нанотрубки с различным диаметром нанотрубок. Все анодированные TaO _x Было установлено, что нанотрубки представляют собой в основном аморфную фазу. Мы обсуждаем изменение смачиваемости поверхности с помощью TaO _x диаметры нанотрубок на основе модели Венцеля. Оценка биосовместимости in vitro также показывает, что клетки фибробластов демонстрируют очевидное поведение, зависящее от смачиваемости, на TaO _x массивы нанотрубок. TaO _{x диаметром 35 нм} Массивы нанотрубок демонстрируют лучшую биосовместимость среди всех образцов нанотрубок. Это улучшение может быть связано с высокой плотностью фокуса, предоставленной TaO _x нанотрубки за счет более высокой гидрофильности поверхности. Это исследование демонстрирует, что биосовместимость Ta может быть улучшена путем образования TaO _x массивы нанотрубок с соответствующим диаметром и геометрической шероховатостью.