Поглощение фотосенсибилизатора хлорина е6 гибридной наносистемой полистирол-дифенилоксазол-поли (N-изопропилакриламид) с помощью метода электронного переноса энергии возбуждения

Фон

Основным недостатком фотодинамической терапии рака является малая глубина проникновения возбуждающего луча в ткань [1]. Так, радиодинамический подход к лечению рака (при котором сенсибилизатор может быть эффективно возбужден рентгеновскими лучами, способными проникать глубоко в организм) был предложен [2] и интенсивно изучается в последние годы [3,4,5]; Одно из направлений исследований - разработка сенсибилизаторов, генерирующих синглетный кислород при возбуждении рентгеновскими лучами [5,6,7,8]. Ключевым процессом в таком сенсибилизаторе рентгеновского излучения является передача энергии электронного возбуждения (EEET) между его сцинтиллирующим и сенсибилизирующим компонентами [2, 6, 9,10,11]. Другой важный компонент упомянутого сенсибилизатора рентгеновского излучения - способ удержания вместе сцинтиллирующих и сенсибилизирующих частей на расстоянии, оптимальном для EEET; Можно упомянуть химическое сопряжение [2, 3], электростатическое притяжение [8, 12], поверхностно-активное вещество [11] или полимерную оболочку [4]. Ранее, в рамках создания наносистем (НС) для сенсибилизации синглетного кислорода с возбуждением рентгеновскими лучами, мы исследовали ЭЭЭТ в полистироле (ПС) -дифенилоксазол (PPO) -хлорине e ₆ НС, где фотосенсибилизатор хлорин е ₆ был связан с наночастицей PS-PPO (которая может использоваться в качестве сцинтиллятора [13, 14]) через оболочку из поверхностно-активного вещества (додецилсульфата натрия) [15].

Поли (N-изопропилакриламид) (ПНИПАМ) относится к материалам, реагирующим на раздражители, которые изменяют свои свойства в ответ на внутренний или внешний раздражитель [16]. Линейный PNIPAM, как известно, претерпевает конформационный переход при нагревании, т. Е. Полимер сжимается (из-за того, что он становится гидрофобным и, таким образом, вытесняет молекулы воды) при температурах, превышающих более низкую критическую температуру раствора (LCST), которая равна 32 ° C для линейного PNIPAM [17]. . Значительное уменьшение ширины оболочки ПНИПАМ при температурном переходе к НКТР было показано для наночастиц ПС-ПНИПАМ в [17]. В то же время для цепей ПНИПАМ, конъюгированных с декстраном, температура конформационного перехода оказалась на 2–4 ° C выше по сравнению с линейным ПНИПАМ с аналогичной молекулярной массой и полидисперсностью из-за стерического взаимодействия между цепями ПНИПАМ, препятствующего конформации. переход [18].

В данной работе были получены наночастицы ПС-ППО, покрытые сшитой оболочкой ПНИПАМ (рис. 1 и 2), в результате чего были получены гибридные НС ПС-ППО-ПНИПАМ. Возможность использования сшитого PNIPAM для присоединения хлорина е ₆ сенсибилизатор к сцинтиллятору НП ПС-ППО. Этот полимер имеет конформационный переход при физиологических температурах (для сшитого PNIPAM НКТР должна быть выше 32 ° C). Таким образом, сжатие сшитой сети PNIPAM после нагрева при возбуждении может привести к уменьшению расстояния между донором PS-PPO и хлорином e ₆ акцептор, который повысит эффективность EEET и, следовательно, эффективность разрушения опухоли.

Строение компонентов гибридной наносистемы ПС-ППО-ПНИПАМ и хлорина е ₆

ПЭМ-изображения полученных гибридных наносистем ПС-ППО-ПНИПАМ с меньшим (слева) и большим (справа) увеличением

Экспериментальный

Материалы

Стирол (СТ, Украина) п.а. качество очищали стандартным методом непосредственно перед полимеризацией. N-изопропилакриламид (NIPAM, Sigma-Aldrich Inc.), N, N'-метиленбисакриламид (BIS, Sigma-Aldrich Inc.), персульфат калия K ₂ S ₂ О ₈ (КПС, Украина), дигидрат одноосновного фосфата натрия NaH ₂ ЗП ₄ × 2H ₂ O (Украина) и анионное поверхностно-активное вещество додецилсульфат натрия (SDS, Sigma-Aldrich Inc.) были химически чистыми и использовались без дополнительной очистки. Хлорин е ₆ (Frontier Scientific Inc.) была любезно предоставлена ​​T.Y. Охульчанский (Институт лазеров, фотоники и биофотоники при Университете штата Нью-Йорк в Буффало). В качестве растворителя использовали 50 миллимолей буфера TRIS-HCl (pH 7,2).

Синтез и характеристика наносистем

Гибридные наносистемы полистирол-поли (N-изопропилакриламид), легированные ППО (гибридные НС ПС-ППО-ПНИПАМ), были синтезированы следующим образом. Во-первых, наночастицы ядра ПС-со-ПНИПАМ, легированные ППО, были приготовлены методом микроэмульсионной полимеризации [13, 14, 19, 20]. Вкратце, 0,2 г НИПАМ, 0,2 г додецилсульфата натрия и 0,01 г NaH ₂ ЗП ₄ × H ₂ O растворяли в 90 г H ₂ О. Затем 0,09 г PPO растворяли в 1,8 г стирола и полученную смесь также добавляли по каплям в течение 30 мин. Смесь перемешивали при 700 об / мин и через смесь барботировали Ar в течение 30 мин. После повышения температуры до 70 ° C 0,01 г K ₂ S ₂ О ₈ растворяется в 1 мл H ₂ O вводили для инициирования полимеризации. Во-вторых, слой оболочки ПНИПАМ был изготовлен после 4-часового нагрева при 70 ° C. Для этого в реактор с помощью шприца добавляли водный раствор мономера NIPAM (0,69 г) и сшивающего агента N, N'-метиленбисакриламида (BIS) (0,06 г). Реакции давали возможность продолжаться в течение 3 часов при 70 ° C и еще 1 час при 90 ° C. Смесь охлаждали до комнатной температуры и диализовали в течение 48 часов с использованием целлюлозной мембраны с MWCO 3500 Да.

Изображения полученных наносистем, полученные с помощью переходной электронной микроскопии (ПЭМ), представлены на рис. 2. Для приготовления образцов медные сетки 400 меш с простой углеродной пленкой были приданы гидрофильным путем обработки тлеющим разрядом (Elmo, Cordouan Technologies Bordeaux France). Наносили каплю 5 мкл и давали адсорбироваться в течение 1 мин, затем избыток раствора удаляли куском фильтровальной бумаги. Наблюдения за наносистемами PS-PPO-PNIPAM проводились на двух ТЕМ, Tecnai G2 или CM12 (FEI, Эйндховен, Нидерланды), а изображения были получены с помощью камеры ssCCD Eagle на Tecnai и камеры Megaview SIS на CM12. Из рис. 2 видно, что полученные гибридные наносистемы состоят из нескольких связанных сферических НЧ ПС-ППО; мы полагаем, что они связаны сеткой из сшитого полимера ПНИПАМ. Таким образом были получены гибридные наносистемы ПС-ППО-ПНИПАМ.

Спектральные измерения и подготовка образцов

Спектры поглощения измеряли на спектрофотометре Specord M40 (Carl Zeiss, Германия). Спектры возбуждения и испускания флуоресценции регистрировали с помощью флуоресцентного спектрофотометра Cary Eclipse (Varian, Австралия). Измерения поглощения и флуоресценции проводили в кварцевой кювете размером 1 × 1 см при комнатной температуре. В качестве растворителя использовали 50 миллимолей буфера TRIS-HCl, pH 7,2. Для спектральных измерений полученный раствор гибридного NS PS-PPO-PNIPAM растворяли 100 раз в буфере. Маточный раствор хлорина е ₆ в концентрации 10 мМ готовили в ДМФ и затем разбавляли буфером до концентрации 1 мМ. Небольшая аликвота этого 1 мМ раствора хлорина е ₆ затем добавляли к 100-кратно растворенному буферному раствору NS; конечная концентрация хлорина е ₆ составляла 2 мкМ, а примесь ДМФ, таким образом, составляла 0,02%. Спектры возбуждения и испускания флуоресценции раствора гибридных НС ПС-ППО-ПНИПАМ с хлорином е ₆ был измерен через 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 и 100 минут после добавления хлорина e ₆ к раствору гибридного НС ПС-ППО-ПНИПАМ. Почти через 80 минут насыщение было достигнуто.

Для температурно-зависимых измерений раствор гибридного НС ПС-ППО-ПНИПАМ в присутствии хлорина е ₆ был помещен в термостатированный держатель кювет ( T =23 ° С). Через 88 мин после приготовления пробы, после поглощения хлорина е ₆ ПС-ППО-ПНИПАМ гибридные НС достигли насыщения, поток воды из водяной бани был включен на нагрев образца до 39 ° С (эта температура должна превышать НКТС для сшитого ПНИПАМ). Спектры возбуждения флуоресценции хлорина е ₆ (излучение при 680 нм) затем измеряли через различные интервалы времени после начала нагрева. Экспериментальные результаты показывают, что конформационный переход начинается примерно через 3 мин после начала нагрева. Следует отметить, что примерно через 18 мин после начала нагревания произошла коагуляция NS с образованием макроскопических сгустков (которые, однако, исчезают после охлаждения раствора, поэтому коагуляция обратима). Температурный эксперимент был проведен трижды, и были получены аналогичные тенденции.

Результаты и обсуждение

Спектры поглощения, возбуждения и испускания флуоресценции полученных гибридных наносистем ПС-ППО-ПНИПАМ в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,2) представлены на рис. 3. Спектр поглощения содержит полосы, соответствующие стиролу (максимум около 260 нм. ) и PPO (максимум около 307 нм). В то же время спектр излучения флуоресценции при возбуждении на 250 нм (диапазон поглощения стирола) привел к спектру, который принадлежит исключительно PPO (с максимумом при 367 нм), а излучение стирола (из-за 307 нм) [15] ) не наблюдалось. Таким образом, EEET от стирола до инкорпорированного PPO близок к завершению. EEET также подтверждается спектром возбуждения излучения PPO (380 нм), где четко наблюдается полоса стирола около 260 нм (рис. 3). Следует добавить, что в спектре излучения PPO можно было наблюдать четкую вибронную структуру (чего не наблюдается для водного раствора PPO [14]), что дополнительно указывает на включение PPO в матрицу PS.

Спектры поглощения (черная сплошная линия), возбуждения флуоресценции (эмиссия на 380 нм, нормализованная; черная короткая штриховая линия) и эмиссии (возбуждение на 250 нм, нормализованная; красная сплошная линия) полученных гибридных наносистем ПС-ППО-ПНИПАМ в 50 мМ Трис-HCl буфер (pH 7,2)

Далее к раствору полученных гибридных наносистем ПС-ППО-ПНИПАМ в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,2) фотосенсибилизатор хлорин е ₆ был добавлен. Спектр поглощения хлорина е ₆ показывает почти отсутствие изменений в присутствии гибридных наносистем по сравнению с буферным раствором, за исключением небольшого уменьшения оптической плотности в максимумах (рис. 4).

Спектры поглощения хлорина е ₆ (2 мкМ) бесплатно (черная линия) и в присутствии гибридных наносистем ПС-ППО-ПНИПАМ (красная линия) в 50 мМ трис-HCl буфере, pH 7,2

В то же время эффект от добавления хлорина е ₆ к гибридным НС ПС-ППО-ПНИПАМ по спектрам флуоресценции гораздо заметнее по сравнению с абсорбционными. Прежде всего, наличие хлорина е ₆ приводит к тушению флуоресцентной эмиссии PPO гибридных NS PS-PPO-PNIPAM, и это тушение действительно усиливается в течение примерно часа (рис. 5). Как правило, такое гашение может быть связано либо с EEET (что привело бы к гашению излучения донора на всех длинах волн излучения), либо с реабсорбцией (что привело бы к гашению излучения донора на длинах волн поглощения акцептора). Различия спектров излучения ПФО (рис. 5) показывают, что сразу после хлорина е ₆ Кроме того, вклад реабсорбции в тушение выбросов PPO является значительным (но также имеет место EEET). В то же время вклад реабсорбции со временем еще больше уменьшается, а вклад EEET растет.

Спектры флуоресценции гибридного ПС-ППО-ПНИПАМ без NS (черная сплошная линия) и при добавлении хлорина е ₆ измерения через 0 мин (черная штрихпунктирная линия) и через 80 мин (черная штрихпунктирная линия). Длина волны возбуждения 250 нм. В качестве растворителя используют 50 миллимоляров трис-HCl буфера, pH 7,2. Различия спектров (сплошные, короткие и пунктирные красные линии) указывают на вклад реабсорбции и переноса энергии электронного возбуждения (EEET) в тушение излучения

Еще один эффект от добавления хлорина е ₆ к гибридному NS ПС-ППО-ПНИПАМ является появление хлорина е ₆ излучение (при возбуждении ФС на длине волны 250 нм), смещенное в длинноволновую область по сравнению с излучением свободного хлорина е ₆ ; как интенсивность, так и сдвиг со временем увеличиваются и достигают насыщения примерно через час (рис. 6). Этот сдвиг указывает на влияние окружения ПНИПАМ на связанные молекулы хлорина е ₆ . В то же время выброс хлорина е ₆ при возбуждении собственное поглощение (при 400 нм) лишь незначительно изменяется в присутствии PS-PPO-PNIPAM NS. Вместе с небольшим изменением хлорина е ₆ абсорбции (рис. 4), это означает, что лишь небольшая часть хлорина е ₆ молекулы связаны с PS-PPO-PNIPAM NS.

Спектры флуоресценции хлорина е ₆ свободен и добавлен к гибридному NS PS-PPO-PNIPAM (измерено через 0, 5, 10, 20, 40 и 80 минут после добавления). Длины волн возбуждения 250 и 400 нм; В качестве растворителя использовали 50 мМ трис-HCl буфер, pH 7,2. Пунктирными стрелками показаны спектры возбуждения при 250 и 400 нм. Сплошная стрелка указывает увеличивающееся время (t) после добавления хлорина е ₆ для спектров, возбужденных при 250 нм

Наконец, полоса PS-PPO появляется в спектре возбуждения хлорина e ₆ добавлен к гибридному NS PS-PPO-PNIPAM (излучение при 680 нм, где вклад связанного с PNIPAM хлорина e ₆ к общему выбросу хлорина е ₆ близко к максимуму). Сначала эта полоса слабая, но в дальнейшем ее интенсивность сильно увеличивается со временем (рис. 7). В то же время эта полоса PS-PPO очень слаба в спектре возбуждения хлорина e ₆ . при излучении при 660 нм (т.е. при максимуме свободного хлорина e ₆ спектр) даже через 100 мин после добавления хлорина е ₆ .

Спектры возбуждения флуоресценции хлорина е ₆ свободен и добавлен к гибридной NS PS-PPO-PNIPAM (измерено через 0, 10, 80 и 100 мин после добавления), а также к самой гибридной NS PS-PPO-PNIPAM. Длины волн излучения хлорина е ₆ составляют 660 нм (нормализованная интенсивность) и 680 нм. Длина волны излучения для PS-PPO-PNIPAM NS составляет 380 нм (нормализованная интенсивность). В качестве растворителя используется 50 миллимоляров трис-HCl буфера, pH 7,2

Таким образом, хлорин е ₆ связывается с гибридным NS PS-PPO-PNIPAM, который вызывает EEET из матрицы PS и инкапсулированный PPO с хлорином e ₆ . Эффективность EEET увеличивается со временем (примерно в течение часа после хлорина e ₆ дополнение), что указывает на поглощение хлорина е ₆ по сети PNIPAM гибридной NS PS-PPO-PNIPAM все еще продолжается в это время. В то же время относительно небольшая часть хлорина е ₆ присутствующий в решении связан PNIPAM.

Следует также упомянуть, что было показано, что НЧ ПС-ППО излучают флуоресценцию ППО [14] или присоединенного порфирина [13] при возбуждении рентгеновскими лучами. Таким образом, EEET от PS до хлорина e ₆ наблюдаемый в гибридных НС ПС-ППО-ПНИПАМ при УФ-возбуждении ПС означает, что энергия рентгеновских лучей может также передаваться хлорину е ₆ в исследуемых НС. В то же время для непосредственного наблюдения рентгеновского стимулированного излучения таких НЧ требуется достаточно высокая концентрация НЧ ПС-ППО [13, 14]. Одним из способов повышения чувствительности таких НЗ к рентгеновскому излучению могло бы стать добавление компонентов, содержащих тяжелые атомы.

Известно, что PNIPAM испытывает конформационный переход при НКТР, равной 32 ° C. Для сшитого полимера значение НКТР должно быть еще выше. Если наш гибридный NS PS-PPO-PNIPAM состоит из сшитой сети PNIPAM, окружающей наночастицы PS-PPO, и хлорина e ₆ привязан к сети PNIPAM, можно ожидать снижения PPO-хлорина e ₆ расстояние и, как следствие, повышение эффективности EEET при нагревании всего гибридного НС.

Чтобы проверить эту идею, эффект нагревания гибридных НС ПС-ППО-ПНИПАМ в присутствии хлорина е ₆ по спектрам возбуждения флуоресценции хлорина е ₆ был изучен. Нагревательный эксперимент проводился трижды; были продемонстрированы аналогичные тенденции. Результаты одного из этих экспериментов представлены на рис. 8 и 9. Таким образом, раствор гибридного НС ПС-ППО-ПНИПАМ в присутствии хлорина е ₆ нагревали до температуры 39 ° C (эта температура должна превышать НКТР для сшитого PNIPAM); нагревание началось после поглощения хлорина е ₆ гибридные НС ПС-ППО-ПНИПАМ достигли насыщения. Во время нагревания соотношение хлорина е ₆ интенсивности флуоресценции (испускание на 680 нм) при возбуждении на 320 нм ( I _ex320 ; то есть хлорин е ₆ выбросы из-за превращения PPO в хлорин e ₆ EEET) и 404 нм ( I _ex404 ; то есть хлорин е ₆ излучение при возбуждении в собственную полосу Соре) (рис. 8 и 9); мы считаем, что это соотношение отражает эффективность отношения PPO к хлорину e ₆ EEET. Таким образом, первые 3 мин после начала нагрева I _ex320 / Я _ex404 уменьшилось с 0,9 до 0,85, возможно, из-за снижения содержания хлорина е ₆ Сродство связывания -to-PNIPAM при повышении температуры. Далее, значение I _ex320 / Я _ex404 отношение увеличилось до 1,02, что сопровождалось усилением светорассеяния (рис. 8; рассеяние проявляется в увеличении интенсивности вблизи 660 нм). Это можно объяснить переходом конформации в PNIPAM, что приводит к уменьшению объема сети сшитого PNIPAM. Это вызывает уменьшение расстояния между донором PS-PPO и хлорином e ₆ акцепторные молекулы связываются с сетью PNIPAM и, таким образом, повышают эффективность EEET.

Спектры возбуждения флуоресценции (нормированные на 404 нм) хлорина е ₆ добавляли к гибридному НС ПС-ППО-ПНИПАМ при 23 ° С (черная линия) и при 39 ° С (через 14 мин после включения нагрева; красная линия). Длина волны излучения 680 нм; В качестве растворителя использовали 50 мМ трис-HCl буфер, pH 7,2

Включена зависимость от времени после нагрева до 39 ° С соотношения интенсивностей излучения хлорина е ₆ добавлен к гибридному NS PS-PPO-PNIPAM при 680 нм при возбуждении на 320 нм (поглощение PPO с последующим EEET до хлорина e ₆ ) к таковой при возбуждении на 404 нм (прямое возбуждение хлорина е ₆ ). Планки погрешностей учитывают шум регистрируемых спектров возбуждения

Таким образом, процессы в растворе гибридных НС ПС-ППО-ПНИПАМ в присутствии хлорина е ₆ сложение можно было бы описать следующим образом. Во-первых, добавление хлорина е ₆ в раствор гибридного НС ПС-ППО-ПНИПАМ в буфере (рис. 10, процесс 1) приводит к проникновению небольшой части хлорина е ₆ в сеть PNIPAM гибридной АС; это привело к EEET от PS и PPO до хлорина e ₆ . Такое проникновение длится около часа, что сопровождается увеличением эффективности EEET (рис. 10, процесс 2). Дальнейший нагрев образца до температуры, превышающей НКТР, приводит к конформационному переходу сети PNIPAM, что приводит к уменьшению расстояния между PS-PPO и хлорином e ₆ молекул, и, таким образом, к еще большему увеличению превращения PS-PPO в хлорин e ₆ Эффективность EEET (рис. 10, процесс 3).

Предлагаемая схема процессов в растворе гибридных НС ПС-ППО-ПНИПАМ в присутствии хлорина е ₆ при добавлении хлорина е ₆ (процесс 1), прохождение около 1 часа (процесс 2) и дальнейшее нагревание от 23 до 39 ° C (процесс 3)

Выводы

Флуоресцентное исследование показало поглощение хлорина е ₆ с помощью гибридных НС ПС-ППО-ПНИПАМ, а также передачи энергии электронного возбуждения от ПС-матрицы через инкапсулированный ППО к хлорину е ₆ ; поглощение достигло насыщения примерно через час.

Нагревание ПС-ППО-ПНИПАМ-хлорин е ₆ NS от 21 до 39 ° C приводит к повышению эффективности EEET; это согласуется с переходом конформации PNIPAM, который уменьшает расстояние между донорами PS-PPO и хлорином e ₆ акцепторы.

Между тем, относительно небольшая часть хлорина е ₆ присутствует в растворе привязан к PNIPAM; Таким образом, необходимы дальнейшие исследования в этом направлении.

Сокращения

EEET:

Электронная передача энергии возбуждения

LCST:

Более низкая критическая температура раствора

NS:

Наносистема

PNIPAM:

Поли-N-изопропилакриламид

PPO:

Дифенилоксазол

PS:

Полистирол

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия