Эффективное поглощение хлорина e6 и усиленный перенос энергии в гибридных наночастицах PS-PPO-PNIPAM

Аннотация

Полистироловые (PS) наночастицы, легированные дифенилоксазолом (PPO) и покрытые перекрестно-связанной поли-N-изопропилакриламидной (PNIPAM) оболочкой, образуют PS-PPO-PNIPAM гибридные наносистемы (NS). Флуоресцентные исследования хлорина e₆, добавленного к этим NS, демонстрируют эффективный электронный возбуждающий перенос энергии (EEET) как от PS ядра, так и от встроенного PPO к хлорину e₆ акцептору. Эффективность EEET резко возрастает в первый час после добавления хлорина e₆, указывая на то, что PNIPAM продолжает включать сенсибилизатор в течение этого времени. Нагревание PS-PPO-PNIPAM-хлорин e₆ NS от 21 °C до 39 °C дополнительно усиливает EEET, согласуясь с термически индуцированным коллапсом PNIPAM сети, который сокращает донор-акцепторные расстояния. Тем не менее, только скромная доля свободного хлорина e₆ ассоциируется с PNIPAM, предполагая, что дополнительная оптимизация необходима.

Введение

Первичное ограничение фото динамической терапии (PDT) для рака — поверхностное проникновение возбуждающего света в ткань. Рентгеновская фото динамическая терапия (X-PDT) предлагает решение, так как рентгеновские лучи глубоко проникают и могут активировать сенсибилизаторы, генерирующие одиночный кислород при рентгеновском возбуждении. Ключ к X-PDT — эффективный электронный возбуждающий перенос энергии (EEET) между сцинтиллирующим компонентом и сенсибилизатором. Стратегии поддержания оптимальной донор-акцепторной близости включают химическое конъюгирование, электростатическое притяжение, поверхностно-активные слои или полимерные оболочки. В предыдущей работе мы изучали EEET в PS-PPO-хлорин e₆ наночастицах, где хлорин e₆ был присоединен к PS-PPO через додецилсульфат натрия оболочку.

Поли-N-изопропилакриламид (PNIPAM) — стимуло-чувствительный полимер, проходящий конформационный переход выше своей нижней критической температуры растворимости (LCST) 32 °C, становясь более гидрофобным и сжимающимся. Для перекрестно-связанного PNIPAM LCST выше, позволяя температурно-управляемые размерные изменения при физиологических температурах. Мы фабриковали PS-PPO наночастицы, обернутые перекрестно-связанной PNIPAM оболочкой, давая PS-PPO-PNIPAM гибридные NS. Мы исследовали, может ли эта оболочка привязать хлорин e₆ и может ли температурно-зависимый коллапс PNIPAM уменьшить донор-акцепторные расстояния, тем самым усиливая EEET и эффективность уничтожения опухолевых клеток.

Экспериментальная

Материалы

Стирол (ST, Украина) качества п.а. очищали стандартными методами перед полимеризацией. N-Изопропилакриламид (NIPAM, Sigma-Aldrich Inc.), N,N'-метиленбисакрилламид (BIS, Sigma-Aldrich Inc.), персульфат калия (K₂S₂O₈, KPS, Украина), моноосновной натрий фосфат дигидрат (NaH₂PO₄ × 2H₂O, Украина) и анионный поверхностно-активный додецилсульфат натрия (SDS, Sigma-Aldrich Inc.) были реактивного класса и использованы без дальнейшей очистки. Хлорин e₆ (Frontier Scientific Inc.) любезно предоставлен T.Y. Ohulchanskyy (Институт лазеров, фотоники и биофотоники, Государственный университет Нью-Йорка в Буффало). 50 мМ Tris-HCl буфер (pH 7.2) служил растворителем.

Синтез и характеристика наносистем

PS-ко-PNIPAM ядерные наночастицы, легированные PPO, сначала готовили микроэмульсионной полимеризацией. Кратко: 0,2 г NIPAM, 0,2 г SDS и 0,01 г NaH₂PO₄ × H₂O растворяли в 90 г H₂O. Затем 0,09 г PPO растворяли в 1,8 г стирола и добавляли капельно за 30 мин. Смесь перемешивали при 700 об/мин, очищали Ar 30 мин, затем нагревали до 70 °C. 0,01 г K₂S₂O₈ растворенное в 1 мл H₂O инициировало полимеризацию. Через 4 ч при 70 °C шаг перекрестного связывания выполняли добавлением 0,69 г NIPAM и 0,06 г BIS в водном растворе, за которым следовали 3 ч при 70 °C и 1 ч при 90 °C. Продукт остывали до комнатной температуры и диализировали 48 ч против целлюлозной мембраны (MWCO 3500 Да).

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) изображения (Рис. 2) подтверждают, что гибридные NS состоят из нескольких PS-PPO ядер, связанных перекрестно-связанной PNIPAM сетью.

Спектральные измерения и подготовка образцов

Поглощения спектры записывали на Specord M40 спектрофотометре (Carl Zeiss, Германия). Флуоресцентные возбуждения и излучения спектры получали на Cary Eclipse флуориметре (Varian, Австралия). Все измерения выполняли в 1 × 1 см кварцевых кюветах при комнатной температуре. PS-PPO-PNIPAM раствор разбавляли 100-кратно в Tris-HCl буфере. 10 мМ хлорин e₆ сток в DMF разбавляли до 1 мМ в буфере, и 2 мкМ конечная концентрация хлорина e₆ добавляли к NS раствору (DMF ≤ 0,02%). Флуоресцентные возбуждения и излучения спектры собирали при 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 и 100 мин после добавления, с насыщением после ≈80 мин.

Для температурно-зависимых исследований раствор NS с хлорином e₆ помещали в термостатированный держатель (T = 23 °C). После ≈88 мин насыщения образец нагревали до 39 °C (выше LCST перекрестно-связанного PNIPAM). Флуоресцентные возбуждения спектры (хлорин e₆ излучение при 680 нм) записывали через интервалы после нагрева. Конформационный переход PNIPAM начинался ≈3 мин после нагрева, с коагуляцией после ≈18 мин — обратимым при охлаждении. Эксперименты повторяли три раза с согласованными результатами.

Результаты и обсуждение

Поглощения, флуоресцентные возбуждения и излучения спектры PS-PPO-PNIPAM NS в 50 мМ Tris-HCl буфере (pH 7.2) показаны на Рис. 3. Поглощающий профиль демонстрирует стирол (~260 нм) и PPO (~307 нм) полосы. Флуоресцентное возбуждение при 250 нм (стирол поглощение) дает PPO излучение при 367 нм, подтверждая почти полный EEET от стирола к PPO. Возбуждающий спектр PPO (380 нм излучение) дополнительно иллюстрирует вклад стирольной полосы. Вибрационная структура в PPO излучении, отсутствующая в водном PPO, подтверждает его включение в PS матрицу.

При добавлении хлорина e₆ (2 мкМ), его поглощающий спектр остается в значительной степени неизменным (Рис. 4), за исключением незначительного снижения пиковой оптической плотности. В противовес, добавление хлорина e₆ индуцирует выраженное гашение PPO флуоресценции, которое интенсивируется примерно за один час (Рис. 5). Это гашение результатирует как из EEET (донор-акцептор перенос энергии), так и из ресорбции (перекрытие донорского излучения с акцепторным поглощением). Изначально ресорбция доминирует, но по мере времени EEET становится основным вкладчиком.

Хлорин e₆ излучение появляется при PS возбуждении при 250 нм, смещаясь к более длинным длинам волн со временем и достигая насыщения после ≈60 мин (Рис. 6). Этот красный сдвиг указывает на влияние среды PNIPAM на связанные хлорин e₆ молекулы. Возбуждение собственной Сорэ полосой хлорина e₆ (400 нм) производит только незначительные изменения в излучении, подчеркивая, что малая доля хлорина e₆ остается свободной в растворе.

Возбуждающий спектр хлорина e₆ (излучение при 680 нм) показывает слабую PS-PPO полосу изначально, которая интенсивируется со временем (Рис. 7), отражая увеличенный EEET от донора к акцептору. PS-PPO полоса остается слабой в возбуждающем спектре, записанном при хлорине e₆ излучении (660 нм) даже после 100 мин, подтверждая, что большинство переноса энергии происходит через PS-PPO донор.

В совокупности эти результаты демонстрируют, что хлорин e₆ проникает в PNIPAM сеть, позволяя EEET от PS и PPO к сенсибилизатору. Эффективность EEET растет в течение первого часа инкубации и может быть дополнительно усилена нагреванием системы выше LCST перекрестно-связанного PNIPAM, который сжимает полимерную сеть и сокращает донор-акцепторные расстояния.

Предыдущие исследования показали, что PS-PPO наночастицы излучают PPO флуоресценцию под рентгеновским возбуждением, предполагая, что EEET, наблюдаемый здесь под УФ освещением, также бы работал под рентгеновским облучением. Однако обнаружение рентгеновски-индуцированного излучения обычно требует высоких концентраций NP; включение тяжелоатомных фрагментов могло бы увеличить рентгеновское поглощение и улучшить чувствительность.

В температурно-зависимом эксперименте (Рис. 8-9), нагревание от 23 °C до 39 °C (после насыщения) сначала вызывало незначительное падение отношения I_ex320/I_ex404 (от 0,90 до 0,85), возможно отражая сниженную аффинность хлорина e₆-PNIPAM. Впоследствии отношение поднималось до 1,02, совпадая с увеличенным рассеянием света — указывающим на коллапс PNIPAM и более близкую донор-акцепторную близость, тем самым усиливая EEET.

В резюме, PS-PPO-PNIPAM гибридные NS облегчают поглощение хлорина e₆ и EEET, с эффективностью, увеличивающейся за ~1 ч инкубации и дальнейшим ростом при нагревании выше LCST. Тем не менее, только ограниченная доля хлорина e₆ связывается с PNIPAM, подчеркивая необходимость будущей оптимизации.

Заключение

Флуоресцентный анализ подтверждает, что хлорин e₆ включен в PS-PPO-PNIPAM гибридные NS и что EEET от PS матрицы и встроенного PPO к хлорину e₆ происходит. Поглощение насыщается примерно через один час. Нагревание системы от 21 °C до 39 °C дополнительно усиливает EEET, согласуясь с термически движимым коллапсом перекрестно-связанной PNIPAM оболочки, который сближает донор и акцептор. Хотя только скромное количество хлорина e₆ остается связанным с PNIPAM, эти находки поддерживают потенциал таких гибридных NS в рентгеновски-движимой фото динамической терапии и оправдывают дальнейшие исследования для усиления загрузки сенсибилизатора.

Аббревиатуры

EEET:

Электронный возбуждающий перенос энергии

LCST:

Нижняя критическая температура растворимости

NS:

Наносистема

PNIPAM:

Поли-N-изопропилакриламид

PPO:

Дифенилоксазол

PS:

Полистирол

TEM:

Трансмиссионная электронная микроскопия