Флуоресцентные SnO₂/SiO₂ наноадсорбенты для высокоэффективного захвата GST-маркированных белков

Аннотация

Мы сообщаем о простом, гидротермально синтезированном тиол-функционализированном силице наносфере (SiO₂-SH) платформе, которая последующе декорируется SnO₂ квантовыми точками (QDs). Полученные SnO₂/SiO₂ композитные наносферы (NS) демонстрируют сильную, видимое-свет-ответную флуоресценцию, позволяя отслеживание захвата белка в реальном времени. Функционализация восстановленным глутатионом (GSH) конвертирует NS в SnO₂/SiO₂-GSH, который специфически связывает глутатион S-трансферазу (GST)-маркированные белки. При применении к E. coli лизатам, наноадсорбенты демонстрируют пренебрежимую неспецифическую адсорбцию, способность связывания белка 7,4 мг г⁻¹ и сохраняют редосковое состояние и пероксидазную активность изолированной глутатион пероксидазы 3 (GPX3). Эти свойства позиционируют SnO₂/SiO₂-GSH NS как перспективный инструмент для быстрой, высокой-выходной очистки GST-маркированных белков.

Введение

Эффективная очистка белков подкрепляет прогресс в обмене лекарств, структурной биологии и разработке вакцин. Традиционные хроматографические и осадочные методы трудоемки и часто компрометируют целостность белка. Аффинная очистка, эксплуатирующая естественное взаимодействие между GST и его лигандом, остается золотым стандартом для рекомбинантных белков с GST тегом. Однако обычные GST-аффинные смолы (например, Glutathione Sepharose 4B) страдают от ограниченной способности связывания, высокой стоимости и отсутствия внутреннего визуального отчета.

Наноматериалы могут преодолеть эти ограничения, предлагая высокую удельную поверхность, настраиваемую химию и, когда должным образом спроектированные, оптические сигнатуры. SnO₂ QDs привлекательны для био-применений: они химически стабильны, биосовместимы и демонстрируют дефект-индуцированную флуоресценцию, которую можно использовать для визуализации. Якоряя SnO₂ QDs на силице наносферах, мы создали двухфункциональную платформу, связывающую аффинный захват с флуоресцентным мониторингом.

Экспериментальная

Материалы и общие процедуры

Все реактивы аналитического класса и использованы без дальнейшей очистки. Ключевые реактивы включают CTAB, SnCl₄·5H₂O, TEOS, MPS и GSH. SnO₂ QDs готовились гидротермальным методом, за которым следовало поверхностное крепление к SiO₂-SH NS и последующая GSH конъюгация.

Синтез SnO₂ квантовых точек

SnCl₄·5H₂O (3,5 г) растворяли в 50 мл H₂O; аммиак (5 мл) добавляли для выпадения Sn(OH)₄, который вымывали и редиспергировали в 30 мл H₂О. pH настраивали до 12 с 2 М NH₄OH, затем переносили в тефлон-оборудованную автоклав и нагревали при 150 °C 24 ч. Полученный продукт собирали, вымывали этанол-изопропанол (1:1) и сушили для получения SnO₂ QDs (~5 нм диаметр).

Фабрикация SnO₂/SiO₂-SH наносфер

SnO₂ QDs (0,2 г) и CTAB (0,09 г) диспергировали в водно-этаноловой смеси (42,5 мл + 7 мл). TEA (2,7 мл) добавляли, затем TEOS (3,5 мл) и MPS (0,35 мл) под перемешиванием при 60 °C 5 ч. Смесь центрифугировали, вымывали HCl-этанол и водой, и редиспергировали для производства SnO₂/SiO₂-SH NS (~460 нм диаметр).

GSH функционализация

SnO₂/SiO₂-SH NS (4 мл, 0,12 г/мл) инкубировали с GSH (16,7 мг/мл) в PBS (pH 7,4) при 37 °C 24 ч. После центрифугирования и вымывания SnO₂/SiO₂-GSH NS хранили в 25% этаноле при 4 °C.

Аффинный захват GST-маркированных белков

GST-маркированные GPX3, OST1 и ABI2 экспрессировали в E. coli BL21(DE3) из pGEX-6p1 конструкций. Клеточные лизаты (pH 7,4, 0,01 М) смешивали с SnO₂/SiO₂-GSH NS (1 мл) и вращали при 4 °C 2 ч. После центрифугирования и вымывания связанные белки элюировали 0,5 М GSH, количественно определяли BCA анализом и анализировали SDS-PAGE.

GPX3 активность анализ

Очищенный GPX3 де-тегировали PreScission протеазой и анализировали пероксидазную активность мониторингом потребления NADPH при 340 нм в присутствии тиоредоксина, тиоредоксина редуктазы и H₂O₂.

Редосковое состояние анализ

GPX3 образцы обрабатывали H₂O₂ и DTT, затем разделяли на невосстанавливающем 15% SDS-PAGE для дифференциации окисленной и восстановленной форм.

Характеристика

Морфология и состав изучали ТЭМ (JEM-2010) и SEM (JSM 5600LV). XRD паттерны записывали на X'Pert Philips дифрактометре. Флуоресцентные спектры измеряли на FluoroSENS спектрометре (возбуждение 260 нм). Белковая чистота оценивали SDS-PAGE (Power PAC 300). BCA анализы выполняли с Beijing CoWin набором.

Результаты и обсуждение

Морфология, кристалличность и флуоресценция наноадсорбентов

SnO₂ QDs демонстрировали монодисперсную, ~5 нм сферическую морфологию с решетковым интервалом 0,29 нм (110) плоскость, подтверждая их высокую кристалличность (Рис. 1). XRD соответствовал касситеритовой фазе (JCPDS 41-1445). Композитные SnO₂/SiO₂-GSH NS сохраняли сферическую форму (~430 нм) с умеренно шероховатой поверхностью, как видно на SEM и ТЭМ изображениях (Рис. 2). Наличие SnO₂ QDs на SiO₂ подтверждается ТЭМ (Рис. 2в,г).

Флуоресцентный анализ раскрыл сильный излучающий пик при 368 нм, атрибутируемый кислородно-вакантным дефектам в SnO₂ (Рис. 3б). Флуоресцентная визуализация NS после захвата белка (Рис. 3в) продемонстрировала сохраненную люминесценцию, позволяя визуальное отслеживание связанных комплексов.

Эффективность захвата белка

SDS-PAGE GST-GPX3, захваченного SnO₂/SiO₂-GSH NS, показал четкое обогащение целевого белка (Рис. 4а). Увеличение концентрации элюирующего GSH (10–100 мМ) постепенно высвобождало связанный белок, подтверждая специфичность GSH-GST взаимодействия. Наноадсорбенты демонстрировали пренебрежимую неспецифическую связь с массой E. coli лизата.

Тесты на повторное использование раскрыли, что NS сохраняют свою способность связывания за три последовательных цикла захвата (Рис. 4б), подчеркивая их надежность.

Расширение подхода к другим GST-маркированным белкам (OST1, ABI2) дало сравнимые результаты (Рис. 5). Способности связывания составляли 7,4 мг г⁻¹ (GPX3), 7,1 мг г⁻¹ (OST1) и 6,8 мг г⁻¹ (ABI2), превосходя коммерческий Glutathione Sepharose 4B (7,1, 6,9, 5,6 мг мл⁻¹ соответственно).

Сохранение редоскового состояния и активности GPX3

После удаления GST, GPX3 сохранял как окисленную, так и восстановленную формы, как свидетельствует отдельная миграция на невосстанавливающем SDS-PAGE (Рис. 6а). Анализ пероксидазной активности (Рис. 6б) продемонстрировал, что GPX3, изолированный через SnO₂/SiO₂-GSH NS, проявил активность, сравнимую с коммерческой смолой, подтверждая, что наноадсорбент сохраняет ферментативную функцию.

Заключение

Мы разработали флуоресцентный, силице-защищенный SnO₂ квантово-точечный наноадсорбент, который захватывает GST-маркированные белки с высокой специфичностью и способностью при сохранении их родного редоскового состояния и ферментативной активности. Надежное повторное использование платформы, превосходная связывающая производительность и внутренняя флуоресценция делают ее привлекательной альтернативой обычным аффинным смолам для быстрой очистки белков.

Аббревиатуры

ABI2:

ABA нечувствительный 2

CTAB:

Гексадецилтриметил аммоний бромид

DTT:

Дитиotreитол

GPX3:

Глутатион пероксидаза 3

GSH:

Восстановленный глутатион

GST-тег:

Глутатион S-трансфераза-тег

MPS:

3-Меркаптопропил-триметоксисилан

NADPH:

Дигидрониктинамид аденин динуклеотид фосфат

OST1:

Открытые стомы 1

QDs:

Квантовые точки

SDS-PAGE:

Натрий додэцилсульфат полиакриламид гель электрофорез

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

SiO₂-SH NS:

Тиол-функционализированные силица наносферы

SnCl₄:

Хлорид олова (IV)

TEA:

Триэтиламин

TEM:

Трансмиссионная электронная микроскопия

TEOS:

Тетраэтил ортосиликат

XRD:

Рентгеновская дифракция