Графеноксидная доставка TIMP-1 ускоряет регенерацию кожи более чем на 40 дней

Аннотация

Это исследование валидирует гипотезу, что графеноксид (GO) может служить эффективным транспортным средством для устойчивого выпуска тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 (TIMP-1) для ускорения кожего ремонта. Морфологию и термические свойства GO характеризовали сканирующей электронной микроскопией (СЭМ), атомно-силовой микроскопией (АФМ) и термогравиметрическим анализом (TGA). После загрузки TIMP-1 на GO мы сравнили кинетику выпуска варьирующих белковых концентраций. Цитоксичность оценивали анализом цикла клетки фибробластов и а폽тозными анализами. In vivo мы оценили влияние TIMP-1-GO на модель эксцизионной раны у крыс. GO демонстрировал максимальный боковой размер 1140 нм и пиковый объем 10674,1 нм³. TIMP-1 оставался непрерывно выпускаемым в течение не менее 40 дней от GO. Пролиферация и живучесть фибробластов не влияли TIMP-1-GO (p > 0,05). Гистологический и иммуноистохимический анализ показали значительное усиление коллагенового депонирования и сосудистой генерации (p < 0,05). Наши данные демонстрируют, что GO обеспечивает контролируемый, длительный выпуск TIMP-1, значительно улучшая регенерацию кожи.

Введение

Кожные травмы возникают от травм, диабета, ожогов или хирургии, и традиционные аутотрансплантаты или синтетические кожные заменители часто сталкиваются с нехваткой доноров, рисками инфекции и неоптимальной интеграцией.

TIMP-1 связывает матриксные металлопротеиназы (MMP) для защиты целостности внеклеточной матрицы (ВКМ) и модулирует обмен факторов роста, существенных для заживления ран. Дисрегуляция оси TIMP-MMP способствует нарушению заживления, келоидам и фиброзу. Следовательно, точное пространственное и временное доставление TIMP-1 критично для оптимальной реэпителилизации.

Существующие цитокиновые переносчики — PLGA, хитосан, PLGA микросферы и гидрогели — обеспечивают ограниченные профили выпуска. Графеноксид, двумерный углеродный материал с обильными гидрофобными π-доменами и ионизируемыми краями, предлагает высокую загрузочную способность, водную дисперсию и низкую внутреннюю токсичность, делая его перспективной платформой для белковой доставки.

Здесь мы оцениваем рекомбинантный человеческий TIMP-1, загруженный на GO, для контролируемого выпуска и эффективности кожего ремонта in vitro и в модели раны крысы.

Материалы и методы

Клеточная культура

Первичные крысьи фибробласты (Институт биохимии и клеточной биологии, CAS) культивировали в DMEM с 10% ФКС при 37 °C, среду меняли каждые 48 ч.

Характеризация GO

GO хлопья (Chengdu Organic Chemicals Co.) изучали СЭМ (Hitachi S3000N, 15 кВ) и АФМ (VEECO MultiMode). Распределение размеров измеряли динамическим световым рассеянием (Zetasizer 3000 HSA). TGA/DSC (Pyris 1 TGA) оценивали термическую стабильность от 25–1100 °C при 10 °C/мин.

Адсорбция TIMP-1 на GO

GO маркировали DiI (красный, Sigma) и инкубировали с FITC-конъюгированным TIMP-1 (Thermo Scientific) в ФСБ 4 ч при 4 °C (GO:TIMP-1 = 1:1 м/м). Конфокальная микроскопия (Olympus IX81) визуализировала адсорбцию; Фурье-спектроскопия (Nicolet 5700) подтвердила белковое связывание.

Кинетика выпуска TIMP-1 белка

GO, загруженный 10, 20 или 30 мкг/мл TIMP-1, взвешивали в 1,5 мл ФСБ в 60-мм блюдцах и инкубировали при 37 °C. Супернатанты собирали в заданные интервалы, обновляли ФСБ и kvantифицировали TIMP-1 ELISA (R&D Systems).

Биосовместимость GO анализа

Фибробласты экспонировали 20 мкг/мл TIMP-1-GO и мониторили 6–72 ч. Живучесть измеряли CCK-8 (абсорбция 450 нм, n = 5 на группу).

Цитометрическая характеристика

Клетки окрашивали Hoechst 33258 и Annexin-V-FITC/PI, фиксировали и анализировали на BD FACSCanto II для оценки распределения цикла клетки и а폽тоза.

In vivo эксперимент

Все процедуры соблюдали руководящие принципы NIH и одобрение Этического комитета Чжэцзянского университета. Четырехнедельные самцы Sprague-Dawley крысы получали 10×10 мм эксцизионные раны. Четырнадцать дней после операции крысы рандомизировали в четыре группы: ФСБ, GO, TIMP-1 или TIMP-1-GO (1:1 об./м.). Лечения подкожно инъецировали (1 мл на место, четыре места, раз в неделю две недели). Животных эвтаназировали 28 дней после операции для гистологического анализа.

Гистологический и иммуноистохимический анализ

Ткани фиксировали в 4% формалине, декальцинировали, дегидратировали и вкладывали в парафин. Гемоксилиновое-эозиновое и Массоновское трихромное окрашивание оценочно коллагеновую архитектуру. CD34 иммунохромирование (Abcam) квантифицировало неоваскуляризацию; секции обрабатывали DAB визуализацией и оценивали тремя слепыми наблюдателями.

Статистический анализ

Данные представляют среднее ± SD из трех независимых экспериментов. Односторонний ANOVA с постук-тестом Стьюдента-Ньюмана-Кейлса определяли значимость (p < 0,05 = значимо; p < 0,01 = высоко значимо). Анализы выполняли SPSS 17.0.

Результаты

Характеризация GO

АФМ раскрыл 2D листовидные GO структуры (Рис. 1a). СЭМ подтвердил неправильно оформленные хлопья (Рис. 1b). Динамическое световое рассеяние указало модный размер 1140 нм и объемный пик при 10674,1 нм³ (Рис. 2a).

Адсорбция TIMP-1 на GO

Конфокальное изображения подтвердило 75 ± 1,2% загрузку TIMP-1 на GO через 4 ч (Рис. 1c). Фурье-спектры показали отдельные пики для TIMP-1-GO против голого GO, подтверждая белковое присоединение. TGA кривые перекрывались, указывая на сохранение термической стабильности (Рис. 2d).

Выпуск TIMP-1

Загрузка 2, 10 или 30 мкг/мл TIMP-1 на GO давала устойчивый выпуск. Доза 2 мкг/мл достигла 50% кумулятивного выпуска быстрее, чем более высокие дозы, однако все формулировки поддерживали детектируемый TIMP-1 в течение ~40 дней (Рис. 2c).

Пролиферация и живучесть клеток на TIMP-1-GO

Живучесть фибробластов, прогрессия цикла клетки и скорости а폽тоза были сопоставимы между контрольной, GO, TIMP-1 и TIMP-1-GO группами (p > 0,05) (Рис. 3a-c).

Эффективность TIMP-1-GO в модели эксцизионной кожной раны

Через 28 дней лечение TIMP-1-GO давало превосходные гистологические оценки, увеличенную плотность коллагена и усиленную регенерацию волосяных фолликулов по сравнению с ФСБ, GO и TIMP-1 в одиночку (p < 0,05) (Рис. 4b-c).

Гистологический и иммуноистохимический анализ

Контрольные раны показывали фрагментированные коллагеновые волокна через 4 недели, тогда как TIMP-1-GO обработанные раны демонстрировали непрерывные, плотные коллаген и обильные CD34+ эндотелиальные клетки, подтверждая усиленную ангиогенез (p < 0,05) (Рис. 4c).

Обсуждение

Наши результаты устанавливают GO как безопасную, высокоемкую платформу для продолжительной доставки TIMP-1, поддерживающей терапевтический белковый выпуск до 40 дней. Устойчивое воздействие TIMP-1 поддерживает сбалансированную MMP активность, способствует ВКМ депонированию и облегчает неоваскуляризацию — ключевые драйверы эффективного замыкания раны.

По сравнению с конвенциональными переносчиками, быстро выпускающими цитокины, π-π стакинг и электростатические взаимодействия GO обеспечивают контролируемый, расширенный профиль выпуска. Это снижает потребность в повторном дозировании и уменьшает потенциальные локальные побочные эффекты.

Хотя высокие концентрации углеродных наноматериалов могут вызывать воспаление, наши in vitro и in vivo данные не показывают детектируемого GO депонирования или неблагоприятных клеточных ответов при тестируемой дозе (20 мкг/мл). Тем не менее, долгосрочные исследования безопасности остаются необходимыми для клинического перевода.

Заключение

Графеноксид обеспечивает устойчивую, биосовместимую доставку рекомбинантного TIMP-1, улучшая коллагеновое формирование и ангиогенез в модели кожной раны крысы. Эта платформа предлагает перспективную стратегию для управления хроническими ранами и может информировать дизайн биоматериальных терапевтиков следующего поколения.