Разработка дозы гипертермии наночастиц Cs0.33WO3, облученных БИК, для раковых клеток печени HepG2

Введение

Во всем мире в 2018 году свирепые раковые заболевания унесли около 10 миллионов жизней и, по оценкам, привели к 18 миллионам новых случаев заболевания [1]. На сегодняшний день, хотя химиотерапия, лучевая терапия, хирургическое удаление или специально подобранная комбинация этих трех факторов обеспечивают улучшение 5-летней выживаемости чуть более 40% пролеченных онкологических больных [2, 3], токсичность и вредоносность химических веществ и ионных соединений. бомбардировка неизбежно вызывает многочисленные побочные эффекты, такие как выпадение волос, кардиотоксичность, бесплодие, хромосомные аномалии и многие другие [4, 5]. Такие опасные для жизни последствия настоятельно подтолкнули к развитию дружественной пациенту терапевтической медицины, включая соединения, содержащие НЧ.

Нанотехнология на основе особой системы материалов, структур, формы и атомной стехиометрии в масштабе размеров ниже 100 нм дает беспрецедентные химические, физические и биохимические свойства, усиленные явлениями квантования, и уже нашла доклиническое и in vitro применение во многих отраслях медицины. биомедицинская наука [6, 7]. Несмотря на недостатки химиотерапии, НЧ, выступающие в качестве носителей доставки, улучшают селективность высвобождения лекарства в больной опухоли, способствуют поглощению лекарства опухолевыми клетками и в значительной степени снижают кумулятивную токсичность в здоровой ткани [8, 9]. Кроме того, качество изображения, создаваемого множеством методов визуализации на основе NP, значительно улучшается за счет более высокой чувствительности, более точного пространственного разрешения и лучшего проникновения на глубину, чтобы выявить биораспределение, контролировать поглощение лекарств, локализовать опухоль и оценить эффективность лечения [10]. В дополнение к диагностической функции, НЧ при использовании физических свойств, таких как радиочастотная (RF) -абляция или фототермическая гипертермия, могут дополнительно вызывать повреждения в желаемом месте с повышенной эффективностью [11,12,13], из которых второй вариант обычно предпочтительнее его дозирования для конкретного участка, меньшей степени боли, слабых побочных эффектов и гораздо меньшего риска ожога тканей.

До сих пор системы материалов НЧ, способные вызывать гипертермию при фотооблучении, включают золото (Au), вольфрамат цезия (CsWO ₃ ), оксид железа, сульфид меди, графен и углеродная трубка и продемонстрировали применимость нанесения летальных повреждений раковым клеткам за счет повышения внеклеточной или внутриклеточной температуры in situ [14,15,16,17,18]. Как и в случае радиочастотной абляции, усиленной NP, уровень плотности падающей мощности фотонных источников является критическим вопросом для клинической безопасности и комфорта пациента [11], и это проявляется в том, что максимальный предел воздействия на кожу человека в диапазоне видимых и видимых лучей. Длина волны ближнего ИК-диапазона от 400 до 980 нм составляет от 0,2 до 0,726 Вт / см ² по данным Международной комиссии по защите от неионизирующего излучения (ICNIRP), опубликованным в 2013 г. [19]. Тем не менее, большинство плотностей оптической мощности, о которых сообщалось в предыдущих исследованиях раковых клеток in vitro, значительно превышали пределы безопасности для кожной ткани, что может быть серьезным вопросом, когда дело доходит до обработки внутренних биологических тканей с низким порогом фотооблучения для уязвимость. Например, плотность оптической мощности в ближнем инфракрасном диапазоне для наночастиц золота (Au), которые продемонстрировали эффективное разрушение раковых клеток, колеблется от 2 до 80 Вт / см ² при облучении не более 10 мин (мин) [13, 14, 20, 21, 22]. Аналогичным образом, ряд других систем материалов, таких как оксиды графена [18], железо-платина (FePt) [23] и NaYF ₄ :Для нанокристаллов Yb, Er [24] требуется не менее 150 мВт / см ² для инструментального развертывания.

Поскольку это относительно менее изученный материал для экспериментов in vitro, в нескольких исследованиях сообщалось об аннигиляции клеток рака шейки матки (Hela) под действием CsWO, облученного ближним инфракрасным излучением ₃ НП с мощностью не менее 0,72 Вт / см ² [15, 25, 26], который находится в непосредственной близости от предела воздействия на кожные ткани длины волны NIR, установленного ICNRP, и может оказывать вредное воздействие на здоровые ткани при длительном воздействии [19]. Более того, температура культуральной среды, обусловленная комбинацией лечебной дозы концентрации NP, продолжительности фотоэкспозиции и оптической интенсивности, в прошлых исследованиях была намного выше 40 ° C, что недопустимо для здоровых клеток человека, и уровень смертности раковых клеток не были описаны подробно.

CsWO ₃ NP исключительно поглощает в диапазоне длин волн ближнего ИК-диапазона от 800 до 2400 нм [27] и функционально подходит для биомедицинского применения. Несмотря на продемонстрированную выдающуюся эффективность в уничтожении раковых клеток, цитотоксичность все еще в значительной степени неизвестна, и обеспечение формулы дозирования с концентрацией NP с низкой цитотоксичностью, короткой продолжительностью облучения и плотностью оптической мощности в пределах безопасного фотоэкспозиции для кожной ткани является все еще не хватает.

В данном исследовании делается попытка оценить in vitro возможность уничтожения клеток рака печени HepG2, культивируемых в чашке Петри диаметром 5,2 см, с использованием нецитотоксической концентрации NP и плотности оптической силы в пределах предела фотоэкспозиции кожной ткани при сохранении температура среды для культивирования клеток при нормальной температуре человеческого тела 36,5 ° C. Подробно Cs _0,33 WO ₃ НЧ со средним размером элемента около 120 нм были синтезированы с использованием последовательности процессов окислительно-восстановительного восстановления, термического отжига и мокрого измельчения и характеризовались морфологией поверхности, кристалличностью, а также оптическими и фототермическими свойствами во времени. Кроме того, были изучены и оценены фототермические эффекты переменных параметров дозы, продолжительности облучения, концентрации НЧ и плотности оптической мощности БИК-излучения, работающего на центральной длине волны 980 нм, на выживаемость раковых клеток HepG2. разработать комбинацию безопасной лечебной дозы.

Методы

В этом исследовании 102-е поколение линии клеток рака печени HepG2, полученной из первичной опухоли человека, культивировали в качестве экспериментальной модели для оценки цитотоксичности, вызываемой самодельным Cs, облученным БИК-излучением _0,33 WO ₃ НЧ и оценить терапевтическую эффективность различных тепловых доз в пределах безопасного предела для воздействия на ткани кожи и при нетоксичной концентрации НЧ.

Синтез C _0,33 WO ₃ НП

На левой панели рис. 1 представлена ​​блок-схема процедуры синтеза оксида цезия-вольфрама (Cs _0,33 WO ₃ ) НП материал. Вкратце, химические вещества-прекурсоры ((NH ₄ ) ₂ WO ₄ ) (Alfa Aesar, чистота 99,9%) и CsCl (Alfa Aesar, чистота 99,9%) растворяли отдельно в 100 мл деионизированной воды и затем смешивали вместе при 25 ° C при постоянном перемешивании со скоростью 250 оборотов в минуту (об / мин), используя вертушка с магнитным приводом на один час (час). После завершения перемешивания температуру стакана, содержащего раствор смеси, доводили до 180 ° C и нагревали до полного испарения воды, содержащейся в растворе. Полученный высушенный белый порошок был конечным предшественником Cs _0,33 Материал WO3. При включенном охладителе кварцевую лодочку, содержащую порошок прекурсора, загружали в центр трубы высокотемпературной печи, и давление внутри трубы печи доводили до 0,08 торр. После этого прекурсор нагревают до температуры 500 ° C с вводом притока комбинации газов H ₂ и N ₂ в соотношении от 90 до 10 стандартных кубических сантиметров в минуту (SCCM) для облегчения окислительно-восстановительной реакции. Через 1 ч вход H ₂ газ отключен, поток N ₂ газ доводят до 100 SCCM, а температуру печи повышают до 800 ° C для термического отжига в течение одного часа. После завершения процессов охладитель и печь с регулируемой температурой были выключены, а кварцевая лодочка была охлаждена до температуры окружающей среды и удалена из трубы печи. Получаемый темно-синий порошок, полученный из кварцевой лодочки, имеет размер Cs _0,33 в микронах (µ). WO ₃ пудра. Чтобы еще больше уменьшить размер гранул порошка, 150 г смешанного раствора, состоящего из 15 г микропорошка, 3,8 г диспергатора на основе сополимера для предотвращения агрегации частиц, 10 мкл пеногасителя и DI. Приготовили воду, налили ее в чашу для образца, содержащую 600 г циркониевых шариков, и поместили в камеру оборудования для измельчения нанометров (Justnanotech Co., Тайвань). При скорости и температуре, установленных на 2400 об / мин и температуре 15 ° C, наночастицы получают путем измельчения микропорошка с 0,1 мм ZrO2 ₂ . шарики на 4 часа и с 0,05 мм ZrO ₂ бисера еще 4 ч. Общая продолжительность каждого процесса измельчения не превышает 4 часов, чтобы избежать чрезмерной вязкости жидкости, а также любых случайных изменений физических размеров материала. Конечный раствор после процесса измельчения был просеян через фильтр с размером пор 0,22 мкм для всех последующих исследований и экспериментов. Флуоресцентная версия Cs _0.33 WO ₃ NPs (fNPs) были сделаны с использованием следующего протокола. Раствор из 2 мл флуоресцеина с концентрацией 28 мг / мл и 2 мл Cs _0,33 WO ₃ Раствор НП с концентрацией 1,5 мг / мл готовили в химическом стакане и помещали в чашу ультразвукового шейкера на 15 мин. Затем раствор НЧ и диспергатор смешивали в соотношении 1:1,25 и подвергали ультразвуковому встряхиванию в течение 15 мин. Полученный раствор затем промывали D.I. воды и центрифугировали при 10000 об / мин в течение 15 мин. и повторяется дважды перед использованием.

Схематическая иллюстрация экспериментальных процедур синтеза материалов, инкубации клеток с НЧ и фототермического анализа раковых клеток. BCL, TEn и PD - это аббревиатуры, обозначающие двояковогнутую линзу, тепловую оболочку и чашку Петри соответственно; красная стрелка указывает место измерения профиля пучка

Характеристика материала

После этого характеристика Cs _0,33 WO ₃ НЧ, включая статистические размеры НЧ, кристаллическую структуру, структурную морфологию, форму контура, оптическую плотность в видимой и ИК-области спектра, проводили с использованием анализа дзета-потенциала (ZS90, Малверн, Великобритания), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Германия), SEM (SU-5000, Hitachi, Япония) в сочетании со встроенной энергодисперсионной спектрометрией (EDS), TEM (JEM-2100F, JEOL, Япония), динамическим рассеянием света (DLS) (Delsa Nano C, Beckman Coulter, США) , UV – VIS – NIR спектрометр (V-750, Jasco, Япония) соответственно. Спектры XRD получали сканированием рентгеновских лучей на образцах в диапазоне углов от 20 ° до 80 ° со скоростью сканирования 4 ° в минуту. Сигнал дифракции от образца, зависящей от угла сканирования, был определен и сравнен со стандартным спектром XRD Cs _0,32 WO ₃ из карты Объединенного комитета по порошковым дифракционным стандартам (JCPDS) № 83-1334. Чтобы подтвердить временную зависимость фототермических свойств наночастиц, было установлено простое экспериментальное устройство, состоящее из лазера ближнего инфракрасного диапазона с длиной волны 980 нм и датчика для измерения температуры, чтобы исследовать состояние температуры, создаваемое раствором, облученным ближним инфракрасным излучением. В число исследуемых решений входит система D.I. водоразбавленный раствор НЧ и смесь раствора НЧ в среде для культивирования клеток. Диаметр оптического луча для образцов в чашках Петри был увеличен, чтобы покрыть всю поверхность чашки Петри, создавая 0,05 Вт / см ² по расчетной плотности оптической мощности, в противном случае осталась неизменной на уровне 2 Вт / см ² . Оптическая установка, показанная на правой панели рис. 1, используется для выполнения БИК-облучения. В основе оптической системы лежит луч лазера ближнего ИК-диапазона, направленный на двояковогнутую линзу, которая увеличивает диаметр луча с 4 мм до 5,2 см, что эквивалентно диаметру поверхности чашки Петри, помещенной на горячую пластину, установленную на 36,8 °. C - физиологическая температура для роста клеток; Кроме того, чашка Петри окружена пластиковым цилиндрическим корпусом, который помогает уравновесить температуру окружающей среды и среды. Дополнительный файл 1:Рис. S1 иллюстрирует отображение оптической интенсивности луча NIR-лазера, измеренного на выходе из апертуры луча, которая обозначена красной стрелкой рядом с лазерным лучом на фиг. 1. Профиль луча представляет трехмерное распределение оптической интенсивности и проверяет однородность светового поля по всему отверстию чашки Петри.

Цитотоксичность и фототермические анализы

Чтобы начать циклы культивирования клеток, 500 мл раствора среды, состоящего из 440 мл питательной смеси F-12 Хэма и модифицированной по Дульбекко эссенциальной среды Игла (HDMEM), 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл L-глутамина. и приготовили 5 мл P / S (пенициллин-стрептомицин), который стерилизовали сетчатым фильтром с размером пор 0,22 мкм. Содержащие клетки чашки Петри диаметром 10 см или 5,2 см, соответственно заполненные 8 мл и 2 мл среды, использовали для первичного и субкультивирования и инкубировали в инкубаторе, кондиционированном 5% CO ₂ и при температуре 37 ̊ ° C. Наблюдение за ростом клеток и обновлением культуральной среды проводилось каждые два дня.

Чтобы получить показатели выживаемости для случаев клеточных анализов, которые включают (1) контроль без внешнего входа, (2) единственное БИК-облучение, (3) инкубацию с НЧ и (4) инкубацию с НЧ вместе с последующим БИК-облучением, Культуральную среду из культуральной чашки отсасывают, в культуральную чашку добавляют 0,4 мл трипсина и помещают в инкубатор примерно на 10 мин. После подтверждения отделения клеток от стенок чашки 10 мкл среды, содержащей клетки, были взяты из чашки для культивирования и добавлены к 10 мкл раствора трипанового синего в микроцентрифужной пробирке, и удаление остатков плавающих НЧ было выполнено с помощью нескольких время отмывки фосфатным буферным раствором (PBS). После этого подсчет клеток производился путем заполнения счетной чашки 10 мкл раствора окрашенных клеток через отверстие для инъекции, и клетки можно было наблюдать в фокальной плоскости стереомикроскопа и подсчитывать с помощью ручного счетчика; каждая точка данных, представленная на всех рисунках относительно выживаемости клеток, была средним значением трех экспериментальных испытаний ( N =3) плюс предел стандартного отклонения.

Чтобы подготовиться к оценке цитотоксичности NP и его фототермического воздействия на выживаемость клеток, среду в 5,2-см чашке удалили, снова наполнили нужным количеством раствора NP в новой среде, чтобы получить набор тестируемых концентраций. 2 мг / мл, 1,5 мг / мл, 1 мг / мл и 0,5 мг / мл, а затем инкубировали в течение одного дня перед экспериментом.

Перед фототермическим анализом была проведена оценка цитотоксичности для изучения ответа клеток на набор концентраций NP, и ее проводили следующим образом. Среду, содержащую клетки и НЧ, вынимали из инкубатора и аспирировали. Один миллилитр предварительно нагретого PBS использовали для промывки раковых клеток и высасывания остатков плавающего CsWO ₃ НЧ, которые не подверглись эндоцитозу, процедура повторяется несколько раз, чтобы гарантировать, что любая потенциальная клеточная гибель не вызвана индуцированным НЧ повышением температуры в новой среде. После фототермической обработки была проведена процедура подсчета цитотоксичности и фототермического анализа клеток.

Результаты

Оптическое поглощение и фототермические свойства Cs _0,33 WO ₃ наноматериалы сильно зависят от кристаллической структуры, температуры после отжига, атомной стехиометрии и размеров частиц [28, 29].

Для характеристики морфологии поверхности Cs _0,33 WO ₃ Для визуального подтверждения иконической структуры столбчатого шестиугольника, обозначенного красной стрелкой на рис. 2а, были получены СЭМ-изображения с увеличением 10,000X. Кроме того, изображения ПЭМ демонстрируют форму контура и размеры элементов гранулы микропорошка на фиг. 2b, где размер элемента составляет около 1 мкм или меньше. Стержневая геометрия наночастиц и гистограмма распределения DLS для наноразмерных элементов с центром около 120 нм также были проверены и представлены на рис. 2с и соответствующем вставленном ПЭМ-изображении. Кроме того, кристаллические характеристики микропорошка и наночастиц с помощью XRD представлены на рис. 2d. Как видно из спектра XRD микропорошка на верхней панели, пиктограммы плоскости кристаллизации вдоль (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220) ), (222), (204), (400) и (224) хорошо совпадают со стандартным спектром Cs _0,32 WO ₃ из карты Объединенного комитета по порошковым дифракционным стандартам (JCPDS) № 83-1334. Когда размер микропорошка уменьшается до 120 нм, интенсивности всех дифракционных пиков монотонно снижаются, а некоторые характерные пики, указывающие на сильное поглощение в ближнем ИК-диапазоне, такие как плоскости (102) и (220), становятся невидимыми в спектре. Точно так же идентификация атомных составляющих цезия (Cs), вольфрама (W) и кислорода (O), показанных на рис. 2e, не только подтверждает его атомное присутствие, но также подтверждает соотношение атомных процентов Cs к W, 0,315 , что очень похоже на первоначально разработанную стехиометрию.

Физические и материальные характеристики. а SEM и b ПЭМ-изображения микропорошка, c Гистограмма распределения DLS размера объекта NP, d Спектры XRD микропорошка и 120 нм НЧ и e Представлен спектр ЭДС с процентным содержанием атомного состава. Масштабные линейки в a , b , c равны 1,5 мкм, 200 нм и 100 нм соответственно

Поверх характеристики материала были измерены спектры оптического поглощения наночастиц и временная фототермическая модуляция температуры, которые представлены на рис. 3. На (a, b) зависимость поглощения в ближнем ИК-диапазоне и профили повышения температуры, вызванного ближним ИК-диапазоном. -облученный раствор НЧ в зависимости от концентрации НЧ, где график зависимости температуры от времени, например, 1 мг / мл, превышает 40 ° C и остается стабильным в течение не менее 1 часа, подтверждая фототермическую стабильность и долговечность материалов. . Аналогичным образом, график изменения температуры на фиг. 3c иллюстрирует 5 повторяющихся циклов в течение 190 мин, подтверждая фототермическую чувствительность материала NP. На рис. 3d временные профили температуры культуральной среды и культуральной среды с включенными NP, взятых из инкубатора, помещенных на плиту и подвергнутых БИК-облучению, стабилизируются при температуре около 37 ° C в течение 10 минут, и температура раствора чистого НЧ, облученного БИК, повышается с 24,6 ° C до 33,6 ° C через 10 мин. Таким образом, принимая во внимание фототермическую функциональность НЧ, для следующего эксперимента было проведено БИК-облучение в течение 10, 30 и 60 мин, поддерживая надежность НЧ во время экспериментального сеанса и потенциально применимо к доклиническим исследованиям. / P>

Оптические и фототермические свойства. а Спектры оптического поглощения и профили изменения температуры раствора НЧ, облученного БИК, в b , c кювета и в d изображена чашка Петри. Ex символизирует профили коробок, расширенных балкой; Концентрация НЧ 1,5 мг / мл и плотность оптической мощности 50 мВт / см ² использовались в ( d ); продолжительность БИК-облучения на цикл в c 15 минут

Затем определяли нетоксичную дозу экспериментальных параметров, включая продолжительность БИК-облучения и концентрацию НЧ, путем облучения клеток в течение 1 и 2 часов при 50 мВт / см ² и посредством прямого взаимодействия с НЧ концентрацией 0,5 мг / мл, 1 мг / мл, 1,5 мг / мл и 2 мг / мл, которые изображены на фиг. 4a, b, соответственно. Уровень выживаемости клеток остается значительно выше 95% в течение 2 часов NIR-облучения, что подтверждает нетоксичность клеток при длительном воздействии фотона 980 нм, а также концентрацию нетоксичных NP ниже 1,5 мг. / мл.

Анализ цитотоксичности экспериментальных параметров. Выживаемость клеток HepG2 при дозировании a продолжительность БИК-излучения, b Представлены 120-нм НЧ различной концентрации. Продолжительность инкубации NP составляла один день; стандартное отклонение трех экспериментальных испытаний ( N =3) для каждой точки данных указывается

Целью дозирования раковых клеток в концентрации 1,5 мг / мл или ниже, которая практически не оказывает повреждающего воздействия на клетки HepG2, является изучение эффектов фототермической дозы на раковые клетки без учета токсичности, присущей NP. Чтобы проверить, могут ли НЧ, облученные БИК, быть жизнеспособным решением для устранения раковых клеток, клетки инкубировали с НЧ при 1,5 мг / мл в течение дня, а затем подвергали воздействию БИК-излучения в течение 1 часа. Как видно из оптических изображений в светлом поле (BF) на рис. 5d – f, количество клеток явно уменьшается, когда время экспозиции длится 1 час (e) или 2 часа (f). Количественно выживаемость монотонно снижается с 84,2% до 58,4% по мере увеличения продолжительности облучения с 10 мин. до 1 часа, и линейная линия тренда хорошо вписывается в разбросанные точки данных, что предсказывает 20% выживаемости, когда облучение длится 2 часа. Кроме того, на рис. 5h показано, что за 1 час облучения выживаемость снижается с 73 до 58% по мере увеличения плотности оптической мощности с 12,5 до 50 мВт / см ² . , выясняя функциональность облученных БИК НЧ в качестве фототермического триггера в разрушении раковых клеток.

Фототермический анализ. Выживаемость клеток HepG2 при дозировке 1,5 мг / мл NP вместе с NIR-облучением. Соответствующие масштабные линейки на a - c вверху и d - е нижние ряды оптических изображений BF составляют 200 мкм и 100 мкм. Стандартное отклонение трех экспериментальных испытаний ( N =3) для каждой точки данных указывается

Кроме того, неуверенность в том, происходит ли такое фототермическое действие внутриклеточным или внеклеточным способом, решалась путем приготовления fNP, проведения той же процедуры промывки и инкубации и наблюдения за любым внутриклеточным присутствием fNP. На рисунке 6 показаны конфокальные изображения BF (b, e) и флуоресценции (a, d) и их наложенные друг на друга композиты (c, f) клеток, инкубированных с fNP и без них. Очевидно, клетки без инкубации fNP в качестве контроля демонстрируют незначительную зеленую флуоресценцию, которая в основном приписывается клеточной аутофлуоресценции, что резко контрастирует с экспериментом, где распределение зеленой флуоресценции присутствует повсеместно во всей цитоплазме, обнаруженной на изображении. Средние интенсивности флуоресценции на изображениях контрольных и экспериментальных образцов также были определены количественно и представлены на гистограмме на рис. 6g, где флуоресценция fNP, подвергшихся эндоцитозу, по крайней мере в девять раз сильнее, чем в контроле.

Оптические конфокальные изображения. а , d флуоресценция, b , e BF и c , f Составные оптические изображения клеток HepG2, инкубированных с fNP и без них, в качестве соответствующих экспериментальных и контрольных групп, представлены в a - c вверху и d - е нижние строки рядом с g гистограмма средней интенсивности флуоресценции. Масштабные линейки представляют 20 мкм; длина волны лазерного возбуждения 488 нм

Обсуждение

Концепция терапевтической гипертермии с использованием электромагнитных волн для лечения онкологических заболеваний возникла еще в начале 1900-х годов и позволила сдержать некоторые формы злокачественных новообразований, но, тем не менее, была ослаблена из-за полезности вызывающих лихорадку антибактериальных средств и отсутствия точных доступность к локальной опухоли интересов in situ [30]. Лишь в 1980-х годах интерес возродился благодаря нескольким исследованиям in vitro, в которых были обнаружены многие аспекты метаболических изменений, нарушения микроциркуляции опухоли и ацидолиза после лечения гипертермией, оказывающего летальное воздействие на раковые клетки [31]. С механической точки зрения, помимо прямой цитотоксичности, при которой раковые клетки подвергаются некрозу с уменьшением апоптоза, когда применяемая температура> 42 ° C, снижение скорости кровотока в сочетании с более низкой охлаждающей способностью и низким pH (<6,8) делает раковые клетки более восприимчивыми к действию. нагревание и, как следствие, более высокая скорость уничтожения клеток [32, 33]. Однако клинически из-за векового недостатка неточной неспецифической локализации гипертермия обнаруживает повышенную терапевтическую эффективность только при одновременном применении с химио- или лучевой терапией [34, 35].

Материалы на основе NP, которые обеспечивают точное нацеливание и мониторинг, и обладают широким спектром физических свойств, таких как поверхностный заряд, флуоресценция, фототермическое преобразование, прекрасно вписываются в нишу такой неточности при применении гипертермии. Однако, несмотря на доказанную полезность многих материалов НЧ, облученных БИК, в исследованиях раковых клеток, предел безопасности фотоэкспозиции часто недостаточно изучен, как в случае CsWO ₃ НП. CsWO ₃ Однако НЧ, как показано на рис. 4b, обладают относительно низкой цитотоксичностью при 1,5 мг / мл по сравнению с некоторыми популярными материалами НЧ, такими как Ag, Au, графен, пороговые значения которых лежат в масштабе 1 мкг / мл [ 18, 36, 37], по-прежнему требуется 0,7 Вт / см ² для эффективного разрушения клеток Hela, несмотря на сильное поглощение в ближнем ИК-диапазоне в диапазоне длин волн от 800 до 2400 нм [15, 25, 26].

Это исследование направлено на разработку эффективного запускаемого БИК-облучением, Cs _0,33 WO ₃ Формула термического дозирования на основе NP для раковых клеток HepG2 in vitro в зависимости от концентрации NP, продолжительности облучения и плотности оптической мощности находится в пределах предела воздействия NIR для кожной ткани.

Эксперимент начинается с синтеза НЧ, где пошаговая процедура синтеза, включающая окислительно-восстановительную реакцию, процесс отжига и метод мокрого измельчения, представлена ​​на рис. 1. Окислительно-восстановительная реакция включает в себя большие тройные элементы, в данном случае Cs, в кольца октаэдрической структуры WO ₆ в подходящей физической среде, позволяющей формировать своеобразную кристаллическую структуру и встраивать свободный электрон в металлическое молекулярное соединение, что является внутренней причиной сильной фототермической конверсии при поглощении в ближнем инфракрасном диапазоне [26, 27]. Кроме того, последующие процессы отжига и мокрого измельчения помогли улучшить кристаллическое образование и уменьшить размер частиц, что еще больше повысило фототермическое преобразование в ближнем инфракрасном диапазоне. После этого синтезированный раствор NP прошел серию физических характеристик и характеристик материала, которые подтверждают средний размер элемента 120 нм, критическую оптимизацию поглощения NIR и аутентифицируют атомный состав (рис. 2). Кроме того, соответствующие измерения дзета-потенциала для 0,5 мг / мл, 1 мг / мл и 1,5 мг / мл составляют -53,2 мВ, -54,3 мВ, -60,1 мВ. Как правило, процесс эндоцитоза является основным путем входа для большинства типов НЧ, а скорость поглощения как катионных, так и ионных НЧ нефагоцитарными клетками выше, чем у нейтральных единиц, хотя первые работают лучше, чем более поздние [38]. Also, many previous reports found negatively charged NPs less toxic to non-phagocytic cells [39, 40], which is a beneficial merit when an excessive intracellular NP accumulation for photothermal dose accompanied with a low toxicity is considered.

To set up a tone for the photothermal assay upon the HepG2 cells, the assessment of the NPs' robustness as a photothermal heater, its long-term stability at saturated temperature in equilibrium with the ambient environment over an hour and the repeatability for 5 consecutive cycles within 3 h were demonstrated (Fig. 3b, c). Also, to quantify the effectiveness of the NP's hyperthermia per se in dosing the cancer cells by ruling out the influence of ambient temperature (nominally at 25 °C), a calibration of the experimental apparatus was implemented by setting a hotplate to 37 °C, atop which all cell assays were carried out, and the temporally photothermal characteristics of the pure culture medium and NP-incorporated culture medium remained at 37.1 °C (Fig. 3d). Thereafter, the dependence of cytotoxicity on the duration of irradiation and NP concentration was examined separately and is presented in Fig. 4 indicating less than 5% of cell killing for over 2 h of NIR-irradiation and 1.5 mg/ml as the pivotal point toward lethal concentration. By fixing the NP concentration at 1.5 mg/ml, which was used throughout the rest of photothermal assay, the thermal dose for medical hyperthermia was defined as functions of variable dosing duration and optical power density. Figure 5 illustrates the action of cell killing with low (a–c) and high (d–f) magnification when NIR-irradiation for 0 h, 1 h and 2 h was implemented, the seemingly reduced number in the cells reflects well the quantitative analysis of cell survival rate as shown in (g), and the linear trend line predicts 80% of cell death for 2 h of irradiation. Likewise, the decrease in cell survival rate upon the incremental optical power density is also demonstrated in (h). Lastly, as clearly depicted by the BF, fluorescence and superimposed composite images in Fig. 6, in which a histogram of fluorescence analysis was presented, the endocytosis of the fNPs was verified.

Conclusion

In summary, this study presents material synthesis and characterization of Cs_0.33 WO₃ NPs, examines in vitro cytotoxicity assays of the direct NPs interaction, and separately, with NIR irradiation, and proves the endocytosis of the NPs as well as effectiveness of the NIR-irradiated NPs upon destructing the HepG2 cancer cells. Moreover, this study suggests a combinative dose of the NIR-irradiated Cs_0.33 WO₃ NPs solution for the HepG2 cancer cells, 1.5 mg/ml of NP concentration, the duration of irradiation between 30 min. to 1 h, and optical power densities of NIR irradiation under 50 mW/cm ² which is well below the safety NIR exposure limit for skin tissue while allowing cancer cell mortality rate close to 40% and may be potentially applicable to the development of patient-friendly and personalized medicine. Such studies in a clinical setting will require additional measures like surface modification with molecules that recognize surface receptors of specific cancer cell types.

Доступность данных и материалов

All data are fully available without any restriction.

Сокращения

НП:

Наночастицы

fNPs:

Fluorescence version of Cs_0.33 WO₃ nanoparticles

NIR:

Ближний инфракрасный порт

UV–VIS–NIR:

Ultraviolet–visible–near-infrared

REDOX:

Oxidation-reduction

DLS:

Динамическое рассеяние света

XRD:

Рентгеновская дифракция

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

EDS:

Energy-dispersive X-ray spectroscopy

RF:

Radiofrequency

ICNRP:

International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection

MIN:

Minutes

SCCM:

Standard cubic centimeter per minute

μ:

Micron

RPM:

Round per minute

JCPDS:

Joint Committee on Powder Diffraction Standards

DI:

Деионизированный

BF:

Bright field