Конъюгированные с антителом CKAP4 мицеллы Si в виде квантовых точек для прицельной визуализации рака легкого

Введение

Рак - одно из основных заболеваний, угрожающих здоровью человека во всем мире [1]. Среди них заболеваемость и смертность от рака легких занимают первое место среди всех злокачественных опухолей и ежегодно демонстрируют тенденцию к увеличению [2]. Хирургическая резекция - основное лечение солидных опухолей. Однако методы дифференциации злокачественной ткани от здоровой в основном ограничиваются тактильными и визуальными сигналами и опытом хирурга [3].

В последние годы хирургия под контролем флуоресценции стала популярной в области исследований в области интраоперационного контроля в режиме реального времени при удалении опухоли [4]. С помощью флуоресцентного контрастного вещества и системы флуоресцентной визуализации хирурги могут использовать визуализацию в реальном времени для резекции первичных опухолей и выявления остаточных опухолей в операционной полости. По сравнению с традиционными методами биомедицинской визуализации система флуоресцентной визуализации предлагает несколько преимуществ, таких как отсутствие ионизирующего излучения и высокое пространственное разрешение [3, 5, 6].

В настоящее время исследователи сообщили о различных флуоресцентных наноматериалах для биологической визуализации [7, 8]. Среди них кремниевые квантовые точки (Si QD) стали популярными в области биологической визуализации [9,10,11]. Однако нет сообщений о приготовлении флуоресцентных контрастных веществ для навигации при хирургии рака легкого с использованием Si QD.

В 2014 году Pi et al. сообщили о методе синтеза новых вододисперсных мицелл Si QD [12]. Данные исследования показали, что мицеллы Si QD обладают преимуществами, включая контролируемый размер, высокую квантовую эффективность флуоресценции и отличную светостойкость [12]. Это исследование направлено на улучшение и модификацию водорастворимых мицелл Si QD, о которых сообщили Pi et al. чтобы приготовить новый флуоресцентный контрастный агент, который, как ожидается, будет использоваться в качестве флуоресцентного контрастного агента для навигации в хирургии рака легкого в будущем.

В 2018 году Янагита и др. сообщили, что CKAP4 высоко экспрессируется в сыворотке и раковых тканях пациентов с раком легкого и может быть использован в качестве нового биомаркера для ранней диагностики рака легких [13]. Следовательно, мицеллы Si QD, конъюгированные с антителом CKAP4, могут быть новым флуоресцентным контрастным агентом, который можно использовать в качестве флуоресцентного контрастного агента для навигации в хирургии рака легкого.

В этом исследовании DSPE-PEG-COOH был использован для приготовления мицелл Si QD с карбоксильными группами на их поверхности. Затем мы конъюгировали антитело CKAP4 с мицеллами Si QD с использованием EDC. Результаты показали, что мицеллы Si QD-CKAP4 хорошо диспергируются в водном растворе. Мицеллы Si QD-CKAP4 проявляли сильную красную флуоресценцию при облучении ультрафиолетовым светом при длине волны 365 нм. Благодаря конъюгации антител мицеллы Si QD-CKAP4 показали хорошую способность нацеливания на клетки и ткани рака легкого как in vitro, так и in vivo. Кроме того, мицеллы Si QD-CKAP4 обладают высокой биобезопасностью как in vitro, так и in vivo. В этом исследовании мы подготовили потенциальный флуоресцентный контрастный агент для навигации в хирургии рака легкого.

Методы

Реагенты

Бычий сывороточный альбумин (BSA) был приобретен у Sigma (анализ ≥ 98%; Миссури, США); тетрагидрофуран (THF) из Адамаса-бета (чистота:99,9%; Базель, Швейцария); DSPE-PEG-COOH от Aladdin (Шанхай, Китай); Антитело CKAP4 от Abcam (0,55 мг / мл; Кембридж, Великобритания); Модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM) и фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) от Hyclone (Юта, США); фетальная бычья сыворотка (FBS) и тиризин от Gibco (Нью-Йорк, США); параформальдегид (4%), иммуноокрашивающий буфер для пермеабилизации с Triton X-100 и блокирующий буфер для иммуноокрашивания от Beyotime (Шанхай, Китай); глицерин от Solarbio (чистота ≥ 99%; Пекин, Китай); и трипсин из Кингморна (0,25%; Шанхай, Китай).

Инструменты

Изображения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) получали с использованием электронной микроскопии JEM-2100F (JEOL, Токио, Япония). Гидродиаметр определяли с помощью JEM Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK). Спектры поглощения UV – Vis получали на спектрофотометре Cary 50 (Varian, Пало-Альто, Калифорния, США). Спектр излучения флуоресценции получали на спектрофотометре F-182 4500 (Hitachi Ltd., Токио, Япония). Рентгеновскую фотоэлектронную спектроскопию (XPS) выполняли с использованием системы PHI-5000C ESCA, модернизированной RBD (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Квантовые выходы (QY) фотолюминесценции (ФЛ) оценивали с помощью флуоресцентного спектрометра (FLS1000, Edinburgh Instruments, Ливингстон, Англия). Инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье (FTIR) выполняли с использованием Thermo IS50 (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США). Рентгеновская дифракция (XRD) была протестирована SmartLab (Rigaku Corporation, Токио, Япония).

Ячейки

Линии Т-клеток A549 и 293 были приобретены в Шанхайском институте клеточной биологии (Шанхай, Китай).

Приготовление мицелл Si QD

Во-первых, квантовые точки додекли-Si были приготовлены реакцией гидросилилирования и растворены в ТГФ для приготовления раствора квантовых точек додекли-Si (15 мг / мл) в соответствии с ранее описанным методом [12]. Затем 20 мг DSPE-PEG-COOH растворяли и смешивали с 10 мл деионизированной воды для приготовления раствора DSPE-PEG-COOH (2 мг / мл, 10 мл). Затем раствор квантовых точек додекли-Si (15 мг / мл, 66 мкл) медленно по каплям добавляли к 10 мл раствора DSPE-PEG-COOH. После ультразвукового перемешивания в течение 3 мин получали прозрачный и прозрачный раствор. Затем раствор помещали в вытяжной шкаф и перемешивали в течение 12 ч в темноте. Затем раствор диализовали в течение 24 часов, а затем лиофилизировали в течение 3 дней для получения мицелл Si QD.

Приготовление Si QD Micelles-CKAP4

В этом исследовании антитело CKAP4 конъюгировали с мицеллами Si QD путем активации карбоксильной группы с помощью EDC [14]. Метод был следующим:4 мг мицелл Si QD диспергировали в 900 мкл PBS для приготовления раствора мицелл Si QD. EDC (10 мг) добавляли к 100 мкл PBS для приготовления раствора EDC. Затем 100 мкл раствора EDC медленно добавляли к 900 мкл мицелл Si QD при ультразвуковом перемешивании в течение 5 мин. Кроме того, медленно добавляли 20 мкл антитела CKAP4 и смесь раствора перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Затем продукт подвергали ультрафильтрации при 4000 об / мин в течение 15 минут. После трехкратной промывки PBS продукт обозначили как мицеллы Si QD-CKAP4.

Тест на цитотоксичность

В этом исследовании трипановый синий использовался для проверки биобезопасности наноматериалов [15]. Т-клетки A549 и 293 инкубировали в 24-луночном планшете (1 × 10 ⁶ / лунку) при 37 ° C в течение 12 ч. После удаления среды серию концентраций мицелл Si QD или мицелл Si QD-CKAP4 (концентрация Si:0–152 мкг / мл) добавляли в 24-луночный планшет и инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов. После удаления среды клетки собирали и дважды промывали PBS. Трипановый синий смешивали с суспензией клеток в соотношении 1:1. Количество живых и мертвых клеток определяли и регистрировали с помощью Countstar. Жизнеспособность клеток (%) =количество живых клеток / (количество живых клеток + количество мертвых клеток) × 100. Использовали три биологических повтора. Для статистического анализа использовали программное обеспечение Prism (версия 7.01; GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Данные были проанализированы с использованием двустороннего дисперсионного анализа с пост-тестом Даннета. Статистическая значимость была установлена ​​на уровне P . <0,05. * P <0,05; ** P <0,01; и *** P <0,001.

Наноматериалы нацелены на раковые клетки легкого in vitro

Направляющая способность мицелл Si QD и мицелл Si QD-CKAP4 к клеткам рака легкого in vitro определялась следующим образом:сначала клетки A549 инкубировали в лазерных конфокальных чашках (3 × 10 ⁵ клеток / чашку) при 37 ° C в течение 12 часов. После удаления среды клетки трижды промывали PBS. Затем к клеткам добавляли 1 мл параформальдегида (4%) и инкубировали при 25 ° C в течение 10 мин. После удаления параформальдегида клетки трижды промывали PBS. Затем к клеткам добавляли 1 мл иммуноокрашивающего буфера для пермеабилизации с Triton X-100 и инкубировали при 25 ° C в течение 10 мин. После удаления иммуноокрашивающего буфера для пермеабилизации с Triton X-100 клетки промывали трижды PBS. Затем к клеткам добавляли 1 мл блокирующего буфера для иммуноокрашивания и инкубировали при 25 ° C в течение 10 мин. После удаления блокирующего буфера для иммуноокрашивания клетки трижды промывали PBS. Затем к клеткам добавляли 200 мкл мицелл Si QD или мицелл Si QD-CKAP4 (концентрация Si 150 мкг / мл) и инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов. После удаления наноматериалов клетки трижды промывали PBS. Фотографии были сделаны с помощью лазерного конфокального микроскопа (Leica, Wetzlar, Германия). Свет возбуждения был установлен на 405 нм, а длина волны излучения была установлена ​​на 630 нм.

Направляющая способность мицелл Si QD и мицелл Si QD-CKAP4 к нормальным клеткам in vitro определялась следующим образом:сначала 293 Т-клетки были собраны в пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл при плотности 1 × 10 ⁶ ячеек / пробирка. После центрифугирования при 1000 об / мин в течение 5 мин супернатант отбрасывали. Затем к клеткам добавляли 1 мл параформальдегида (4%) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. После центрифугирования при 1000 об / мин в течение 5 мин супернатант отбрасывали. Затем клетки трижды промывали PBS. Затем к клеткам добавляли 1 мл иммуноокрашивающего буфера для пермеабилизации с Triton X-100 и инкубировали при 25 ° C в течение 10 мин. Затем клетки центрифугировали при 1000 об / мин в течение 5 мин. После удаления супернатанта клетки трижды промывали PBS. Затем к клеткам добавляли 1 мл блокирующего буфера для иммуноокрашивания и инкубировали при 25 ° C в течение 10 мин. Затем клетки центрифугировали при 1000 об / мин в течение 5 мин. После удаления супернатанта клетки трижды промывали PBS. Затем к клеткам добавляли 200 мкл мицелл Si QD или мицелл Si QD-CKAP4 (концентрация Si 150 мкг / мл) и инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов. После центрифугирования при 1000 об / мин в течение 5 минут супернатант сливали, а осадок трижды промывали PBS. Клетки собирали и готовили предметные стекла. Микроскопию проводили с помощью лазерного конфокального микроскопа. Свет возбуждения был установлен на 405 нм, а длина волны излучения была установлена ​​на 630 нм.

Было проведено три независимых эксперимента. Количественный анализ средней интенсивности флуоресценции проводили с использованием программного обеспечения ImageJ (Bethesda, MD, США). Для статистического анализа использовалось программное обеспечение Prism (версия 7.01). Данные были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа с пост-тестом Даннета. Статистическая значимость была установлена ​​на уровне P . <0,05. *** P <0,001.

Модель мышей, несущих опухоль

Десять голых мышей-самцов (возраст 5-6 недель) были приобретены у Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Всех мышей содержали в условиях, свободных от специфических патогенов (SPF), в Центре экспериментальных животных Университета Тунцзи (Шанхай, Китай). Для создания модели мышей с опухолью мышам подкожно вводили 1 × 10 ⁶ А549 ячеек. В эксперименте использовали мышей с опухолями, когда диаметр опухоли достигал 6 мм. Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с установленными правилами и были одобрены Комитетом по использованию и уходу за животными Университета Тунцзи.

Нацеливание Si QD Micelles-CKAP4 на ткани рака легкого in vitro

Мышей с опухолями умерщвляли под анестезией. Опухоль и нормальную ткань легкого собирали для приготовления парафиновых срезов. После дегидратации, извлечения антигена и блокировки сыворотки мицеллы Si QD или мицеллы Si QD-CKAP4 (концентрация Si 150 мкг / мл) добавляли к тканям и инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов. После удаления наноматериалов ткани трижды промывали PBS. Ткани окрашивали 4 ', 6-диамидино-2-фенилин-долом (DAPI) в течение 10 мин. После трехкратной промывки PBS к тканям добавляли антифадную среду и инкубировали при 25 ° C в течение 5 мин. После удаления антифадной среды ткани трижды промывали PBS. Фотографии были сделаны с использованием флуоресцентного микроскопа (Nikon, Токио, Япония) с длиной волны возбуждения 405 нм и длиной волны излучения 630 нм. Было проведено три независимых эксперимента. Количественный анализ средней интенсивности красной флуоресценции был выполнен с использованием программного обеспечения ImageJ. Для статистического анализа использовалось программное обеспечение Prism (версия 7.01). Данные были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа с пост-тестом Даннета. Статистическая значимость была установлена ​​на уровне P . <0,05. *** P <0,001.

Флуоресцентная визуализация in vivo

В эксперименте девять мышей с опухолями были разделены на три группы (группа инъекции мицелл Si QD-CKAP4, группа инъекций мицелл Si QD и группа инъекций физиологического раствора). Мышам в группе инъекции мицелл Si QD-CKAP4 внутривенно вводили 200 мкл мицелл Si QD-CKAP4 (Si:4 мг / кг). Мышам в группе инъекции мицелл Si QD внутривенно вводили 200 мкл мицелл Si QD (Si:4 мг / кг). Мышам в группе инъекции физиологического раствора внутривенно вводили 200 мкл физиологического раствора. Флуоресцентные изображения получали в разные моменты времени (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 и 4 ч). Мышей в группе инъекции мицелл Si QD-CKAP4 анестезировали и умерщвляли через 4 часа для обнаружения сигнала флуоресценции в их сердце, печени, селезенке, легких, почках и опухоли. В этом исследовании флюоресцентная визуализация выполнялась с использованием VISQUE Invivo Smart-LF (VIEWORKS, Gyeonggi-do, Корея) с набором полиэтиленовых фильтров ( λ _{возбуждение} 450–500 нм, λ _выброс 600–650 нм). Для статистического анализа использовалось программное обеспечение Prism (версия 7.01). Данные были проанализированы с использованием одностороннего дисперсионного анализа с пост-тестом Даннета. Статистическая значимость была установлена ​​на уровне P . <0,05. * P <0,05; ** P <0,01.

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

В этом исследовании 12 мышам с опухолями вводили физиологический раствор (200 мкл), мицеллы Si QD (Si:4 мг / кг, 200 мкл) или мицеллы Si QD-CKAP4 (Si:4 мг / кг, 200 мкл). через хвостовую вену. Через 24 ч мышей умерщвляли. Окрашивание H&E проводилось на их сердцах, печени, селезенке, легких и почках. Патологические изменения наблюдали с помощью оптической микроскопии [14, 16].

Результаты

Получение и характеристика мицелл Si QD

Во-первых, КТ додецил-Si были получены гидросилилированием в соответствии с ранее опубликованным отчетом (схема 1, стадия 1) [12]. Аналогично представленным данным, КТ додецил-Si, синтезированные нашей группой, хорошо диспергировались в метилбензоле [12]. ПЭМ показал, что квантовые точки додецил-Si имеют сферическую форму с относительно однородными размерами. Размеры квантовых точек додецил-Si на изображениях ПЭМ измерялись с помощью программы ImageJ. Данные показали, что диаметр квантовых точек додецил-Si составлял от 4,1 до 5,3 нм, а средний диаметр составлял около 4,7 нм (рис. 1а). На увеличенных изображениях квантовых точек додецил-Si видны явные полосы решетки (рис. 1а). В этом исследовании расстояние решетки до плоскости измерялось с помощью программы ImageJ. Данные показали, что среднее расстояние между полосами решетки составляет примерно 0,35 нм, что почти такое же, как у ранее описанных квантовых точек додецил-Si (0,34 нм). Таким образом, синтезированные в данной работе квантовые точки додецил-Si показали хорошую кристалличность [12]. Динамическое рассеяние света (DLS) показало гидродинамический диаметр квантовых точек додецил-Si в диапазоне от 4,8 до 13,5 нм со средним значением 6,5 нм (рис. 1b).

Схема получения мицелл Si QD-CKAP4 и направленной биологической визуализации в тканях рака легкого

а ПЭМ-изображения квантовых точек додецил-Si; б распределение квантовых точек додецил-Si по диаметрам; c ПЭМ-изображения мицелл Si QD; г распределение мицелл Si QD по гидро диаметрам; е ПЭМ-изображения мицелл Si QD-CKAP4; е распределение мицелл Si QD по гидродиаметру - CKAP4; г C1s-спектры рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) мицелл Si QD; ч C1s XPS-спектры мицелл Si QD-CKAP4

Для получения вододисперсных мицелл Si QD, додецил-Si QD модифицировали путем самосборки из DSPE-PEG-COOH (схема 1, шаг 2) [12]. Здесь DSPE-PEG-COOH был использован вместо F127 для получения мицелл Si QD с карбоксильными группами на поверхности. Результаты показали, что мицеллы Si QD хорошо диспергируются в воде. Изображения ПЭМ показали, что мицеллы Si QD представляют собой сферические частицы со вставленными Si QD. Диаметр мицелл Si QD составлял от 22,7 до 54,6 нм, а средний диаметр составлял приблизительно 34,3 нм (рис. 1c). DLS показал, что гидродинамические диаметры мицелл Si QD находятся в диапазоне от 43,8 до 615,9 нм, в среднем 58,7 нм (рис. 1d). Средний дзета-потенциал мицелл Si QD составлял примерно -20,7 мВ. В этом исследовании FTIR была проведена для изучения состава мицелл Si QD (дополнительный файл 1:рисунок S1A). Данные показали, что пики поглощения валентных колебаний N – H, C – H, O – H и C =O находятся при 3430, 2920, 2850 и 1640 см ⁻¹ , соответственно; пики поглощения изгибных колебаний C – H и O – H были при 1460 и 1400 см ⁻¹ , соответственно; пики поглощения валентных колебаний Si – C, C – O и P – O – C находились при 1250, 1100 и 951 см ⁻¹ , соответственно; пики поглощения изгибных колебаний Si – H и O =C – N находились при 850 и 526 см ⁻¹ , соответственно. Эти данные показывают, что характеристические группы DSPE-PEG-COOH (такие как N – H, O – H, C =O, C – O, P – O – C и O =C – N) и характеристические группы КТ додецил-Si (такие как Si-C и Si-H) могут быть обнаружены в спектре FTIR мицелл Si QD, что указывает на то, что квантовые точки додецил-Si были успешно инкапсулированы в мицеллы, самоорганизованные с помощью DSPE-PEG-COOH. Кроме того, мицеллы Si QD были охарактеризованы методом XRD (дополнительный файл 1:рисунок S1B). Пик дифракции мицелл Si QD был резким, что свидетельствовало о хорошей кристалличности мицелл Si QD. На рентгеновской дифрактограмме максимумы при 2 θ 27.073, 28.451, 56.598 и 73.145 соответствуют плоскостям кристалла кремния (100), (002), (112) и (203) (PDF № 80-0005), что указывает на успешную инкапсуляцию квантовых точек Si в Мицеллы Si QD. Пики при 2 θ 31.692, 45.431, 66.200, 75.260 и 83.955 соответствуют плоскостям кристалла NaCl (200), (220), (400), (420) и (422) (PDF # 77-2064). Рациональное объяснение присутствия NaCl в мицеллах Si QD может быть следующим:после приготовления мицелл Si QD мы растворили мицеллы Si QD в PBS, что привело к присутствию NaCl в мицеллах Si QD.

Спектр поглощения УФ – видимой области показал, что поглощение мицелл Si КТ составляет от 200 до 500 нм (рис. 2а). При длине волны возбуждения 330 нм в спектрах излучения флуоресценции мицелл Si QD наблюдалась сильная флуоресценция на длине волны 650 нм (рис. 2b). Водный раствор мицелл Si QD (концентрация Si:80 мкг / мл) был прозрачным и прозрачным при естественном освещении; однако он излучал сильную красную флуоресценцию в УФ-свете 365 нм (рис. 2c). В этом исследовании абсолютные QY PL были проверены с помощью флуоресцентного спектрометра (FLS1000). Длина волны возбуждения 365 нм. Данные показали, что абсолютная PL QY мицелл Si QD составляла приблизительно 14,49%.

а УФ – видимый спектр поглощения мицелл Si QD и мицелл Si QD-CKAP4; б флуоресцентный спектр излучения мицелл Si QD и мицелл Si QD-CKAP4; c изображения мицелл Si QD и мицелл Si QD-CKAP4, экспонированных в естественном свете (слева) и 365 нм УФ-свете (справа)

Получение и характеристика Si QD Micelles-CKAP4

Мы конъюгировали антитело CKAP4 с мицеллами Si QD с помощью EDC (схема 1, шаг 3) [14]. Изображения ПЭМ показали, что мицеллы Si QD-CKAP4 были сферическими частицами со вставленными Si QD. Диаметр мицелл Si QD-CKAP4 составлял от 24,4 до 67,7 нм, при среднем диаметре примерно 35,5 нм (рис. 1e). DLS показал, что гидродинамический диаметр мицелл Si QD-CKAP4 находится в диапазоне от 58,7 до 824,9 нм, в среднем 78,8 нм, что немного больше, чем у мицелл Si QD (рис. 1f). Это увеличение может быть связано с конъюгацией антитела CKAP4. Спектры РФЭС C1s показали шесть типов атомов углерода в области C1s:C (O) O (288,81 эВ), C =O (286,5 эВ), C – O (285,76 эВ), C – N (285,25 эВ), C –C (284,88 эВ) и C – H (284,34 эВ) (рис. 1ж). Однако пик C (O) O почти исчез в XPS-спектрах мицелл Si QD-CKAP4, указывая на то, что конъюгация между карбоксильными группами и первичными аминами была успешной; следовательно, антитело CKAP4 было успешно конъюгировано с мицеллами Si QD (рис. 1h). Средний дзета-потенциал мицелл Si QD-CKAP4 был приблизительно -10,7 мВ, что выше, чем у мицелл Si QD. Объяснение вышеупомянутого явления может быть следующим:на поверхности мицелл Si QD имеется много карбоксильных групп; Таким образом, мицеллы Si QD обладают сильным отрицательным электричеством. Однако в мицеллах Si QD-CKAP4 связывание антитела CKAP4 привело к уменьшению количества карбоксильных групп на поверхности мицелл Si QD-CKAP4; следовательно, средний дзета-потенциал мицелл Si QD-CKAP4 увеличился.

Спектр поглощения в УФ-видимой области показал, что поглощение мицелл Si QD-CKAP4 находится в диапазоне от 200 до 500 нм, аналогично результату мицелл Si QD (рис. 2а). При длине волны возбуждения 330 нм сильная флуоресценция при 640 нм наблюдалась от мицелл Si QD-CKAP4 в спектрах излучения флуоресценции (рис. 2b). Эти результаты показали, что конъюгация антител не оказывала значительного влияния на флуоресцентные свойства мицелл Si QD-CKAP4. Водный раствор мицелл Si QD-CKAP4 (концентрация Si:80 мкг / мл) был прозрачным и прозрачным при естественном освещении. Под УФ-светом 365 нм он мог излучать сильную красную флуоресценцию, что согласуется с результатами для мицелл Si QD (рис. 2c). Тесты PL QY показали, что абсолютный PL QY мицелл Si QD-CKAP4 составлял приблизительно 16,96%.

Тест на цитотоксичность Si QD Micelles-CKAP4 in vitro

Клеточная линия рака легких человека А549 и линия клеток эпителия почек человека 293Т были использованы в качестве клеток-мишеней для исследования биобезопасности мицелл Si QD и мицелл Si QD-CKAP4. В этом исследовании различные концентрации мицелл Si QD и мицелл Si QD-CKAP4 (концентрация Si 0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76 и 152 мкг / мл) сначала инкубировали с Т-клетками A549 или 293 при 37 ° С. ° C в течение 2 ч. Жизнеспособность клеток определяли с помощью трипанового синего (рис. 3) [15]. ID50 мицелл Si QD и мицелл Si QD-CKAP4 получали с использованием программного обеспечения GraphPad. Данные показали, что ID50 мицелл Si QD был больше 152 мкг / мл в Т-клетках A549 и 293. ID50 мицелл Si QD-CKAP4 составлял 25,94 мкг / мл в клетках A549 и 72,69 мкг / мл в 293 Т-клетках. Эти результаты показали, что цитотоксичность мицелл Si QD-CKAP4 была значительно выше, чем цитотоксичность мицелл Si QD-CKAP4, а цитотоксичность мицелл Si QD-CKAP4 в клетках A549 была значительно выше, чем у 293 Т-клеток. Это явление может быть связано с комплемент-зависимой цитотоксичностью [17]. Кроме того, эти результаты также показали, что мицеллы Si QD-CKAP4 показали более высокую биологическую безопасность в нормальных клетках, чем в клетках рака легких, что заложило основу для его применения in vivo.

Жизнеспособность клеток A549 a и 293 Т b инкубировали с различными концентрациями мицелл Si QD и мицелл Si QD-CKAP4 (концентрация Si:0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76 и 152 мкг / мл) в течение 2 ч ( n =3; среднее ± стандартное отклонение; двусторонний дисперсионный анализ с пост-тестом Даннета; * P <0,05; ** P <0,01; и *** P <0,001)

Нацеливание Si QD Micelles-CKAP4 на раковые клетки легкого in vitro

Для дальнейшего исследования нацеливающей функции мицелл Si QD-CKAP4 в клетках рака легкого in vitro в качестве клеток-мишеней использовали Т-клетки A549 и 293. Мицеллы Si QD и мицеллы Si QD-CKAP4 сначала инкубировали с Т-клетками A549 и 293 при 37 ° C в течение 2 часов. Эффект нацеливания был обнаружен с помощью лазерной конфокальной микроскопии (рис. 4). Результаты показали, что красная флуоресценция в мицеллах Si QD-CKAP4, инкубированных A549, была значительно выше, чем у мицелл Si QD-CKAP4 и 293 T, совместно инкубирующей группы, мицелл Si QD и группы совместной инкубации A549, а также мицелл Si QD. и группа совместного инкубирования 293 T. Эти результаты показали, что мицеллы Si QD-CKAP4 могут специфически нацеливаться на клетки A549 in vitro.

Обнаружение способности мицелл Si QD-CKAP4 нацеливаться на клетки A549 in vitro. а A549 и 293 T инкубировали с мицеллами Si QD-CKAP4 и мицеллами Si QD (концентрация Si 150 мкг / мл) при 37 ℃ в течение 2 часов. После удаления супернатанта и двукратной промывки клетки фотографировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (полоса, 25 мкм). б Количественный анализ средней интенсивности флуоресценции был измерен ImageJ ( n =3; среднее ± стандартное отклонение; односторонний дисперсионный анализ с пост-тестом Даннета; *** P <0,001)

Нацеливание Si QD Micelles-CKAP4 на ткани рака легкого in vitro

Чтобы изучить возможность нацеливания мицелл Si QD-CKAP4 на ткани рака легкого, мы разработали эксперимент in vitro для проверки свойства нацеливания мицелл Si QD-CKAP4 на ткани A549. В этом исследовании клетки A549 были привиты мышам подкожно. После образования опухоли ткани опухоли A549 и нормальные ткани легких собирали и инкубировали с мицеллами Si QD и мицеллами Si QD-CKAP4 при 37 ° C в течение 2 часов. Эффект нацеливания был обнаружен с помощью лазерной конфокальной микроскопии (рис. 5). Результаты показали, что ткань A549, инкубированная мицеллами Si QD и CKAP4, могла излучать сильную красную флуоресценцию при длине волны возбуждения 405 нм. Однако только слабая красная флуоресценция наблюдалась в тканях A549, инкубированных с мицеллами Si QD, в нормальных тканях легких, инкубированных мицеллами Si QD-CKAP4, и в нормальных тканях легких, инкубированных с мицеллами Si QD. Красная флуоресценция в ткани A549, инкубированной мицеллами Si QD и CKAP4, была значительно выше, чем у тканей A549, инкубированных мицеллами Si QD, нормальной легочной ткани, инкубированной мицеллами Si QD-CKAP4, и нормальной тканью легких, инкубированных мицеллами Si QD. Эти данные показывают, что мицеллы Si QD-CKAP4 могут эффективно воздействовать на ткани рака легких in vitro, что, как предполагается, является потенциальным флуоресцентным контрастным агентом при раке легких.

Обнаружение способности мицелл Si QD-CKAP4 нацеливаться на ткань A549 in vitro. а Ткань A549 и нормальную ткань легкого культивировали с мицеллами Si QD-CKAP4 и мицеллами Si QD (концентрация Si:150 мкг / мл) при 37 ° C в течение 2 часов. После двукратного промывания ткани окрашивали DAPI для визуализации ядра. Ткани фотографировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (штанга, 200 мкм). б Количественный анализ средней интенсивности красной флуоресценции был измерен ImageJ ( n =3; среднее ± стандартное отклонение; односторонний дисперсионный анализ с пост-тестом Даннета; *** P <0,001)

Флуоресцентная визуализация in vivo

Nine tumor-bearing mice were divided into three groups (Si QD micelles-CKAP4 injection group, Si QD micelles injection group, and saline injection group). Mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were intravenously injected with 200 µL Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg). Mice in the Si QD micelle injection group were intravenously injected with 200 µL of Si QD micelles (Si:4 mg/kg). Mice in the saline injection group were intravenously injected with 200 µL saline. Fluorescence images were acquired at different time points (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, and 4 h). The significant fluorescence signals were not observed in lung cancer tissues among all the mice in the three groups (data not shown). This might be because of the weak fluorescence penetration of the Si QD micelles-CKAP4 and Si QD micelles.

The mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were anesthetized and euthanized at 4 h to detect the fluorescence signal in their heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor. Data showed that a significant fluorescence signal could be observed in the liver, kidney, and tumor tissues. However, there was no significant fluorescence signal in the heart, spleen, or healthy lung tissues (Fig. 6). The significant fluorescence signal in the liver and kidney indicated that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. In addition, the fluorescence signal in A549 tumor tissues was significantly higher than that in healthy lung tissues. This phenomenon contributed to the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer tissues. These results indicate that Si QD micelles-CKAP4 specifically targets lung cancer tissue, which is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

а Bright photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. б Fluorescence photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. c Relative fluorescence intensities of heart, liver, spleen, lung, kidney and tumor tissue (n = 3; mean ± SD; one-way ANOVA with Dunnett’s post test; * P  < 0.05; **P  < 0.01)

Biosafety Evaluation of Si QD Micelles-CKAP4 In Vivo

Finally, we investigated the acute toxicity of the Si QD micelles-CKAP4 in vivo. In this study, tumor-bearing mice (n  = 12) were intravenously injected with saline (200 µL), Si QD micelles (Si:4 mg/kg, 200 µL), or Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg, 200 µL) and then euthanized 24 h later. H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys are shown in Fig. 7. Compared with saline-injected mice, there were no evident pathological changes in the major organs of Si QD micelles-injected mice and Si QD micelles-CKAP4-injected mice. The above data indicated that Si QD micelles (Si:4 mg/kg) and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) showed no significant toxicity in vivo.

H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys in tumor-bearing mice injected with saline, Si QD micelles (Si:4 mg/kg), and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) for 24 h (magnification:200×)

Discussion

At present, various fluorescent nanomaterials have been designed and synthesized as optical contrast agents for surgical navigation [3, 4]. In 2020, On et al. prepared fluorophore [indocyanine green (ICG) or cyanine 5.5 (Cy5.5)]-conjugated glycol chitosan nanoparticles (CNPs) as a fluorescent contrast agent in lung cancer surgery navigation [18]. However, there are no reports on the preparation of fluorescent contrast agents for lung cancer surgery navigation using Si QDs.

This study successfully synthesized Si QD micelles-CKAP4, which could target the imaging of lung cancer tissues. Si QD micelles-CKAP4 is expected to be used as an optical contrast agent for navigation in lung cancer surgery in the future. The advantages of Si QD micelles-CKAP4 are as follows:(1) We synthesized a fluorescent contrast agent for lung cancer surgery navigation using Si QDs for the first time, which expands the toolbox of the lung cancer surgery navigation tool library. (2) This study optimized water-dispersible Si QD micelles reported by Pi et al. to add targeting ability to Si QD micelles [12]. Thus, it provides a new possibility for applying Si QDs in the biomedical field. (3) The principle of Si QD micelles-CKAP4 targeting lung cancer is based on the high expression of CKAP4 protein in lung cancer tissue. Owing to the conjugation of CKAP4 antibody, Si QD micelles-CKAP4 could actively target lung cancer tissue. Compared with the nanomaterials that passively target tumors via the EPR effect, Si QD micelles-CKAP4 showed stronger specificity to lung cancer tissue. (4) Si QD micelles-CKAP4 showed selective toxicity to tumor cells in a specific range of concentrations. Therefore, Si QD micelles-CKAP4 showed high biological safety in the range of rational drug concentrations, which exhibited its potential clinical application value.

In this study, PL QY tests showed that the absolute PL QY of Si QD micelles was approximately 14.49% and the absolute PL QY of the Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%. A study by Pi et al. showed that the PL QY of dodecyl-Si QDs was approximately 26%, which was very high for Si QDs that emit red light with a PL peak at less than 700 nm [12, 19, 20]. However, the PL QY of the Si QD micelles in this study was approximately 14.49%, which was lower than that of dodecyl-Si QDs. This might be because of the surface defects introduced during the emulsion process, which was nearly consistent with the decrease in PL QY in Si-QD micelles (dodecyl-passivated Si QDs were encapsulated in the micelles self-assembled from F127 in the emulsion) in the study reported by Pi et al. [12, 21]. In this study, the PL QY of Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%, which was slightly higher than that of Si QD micelles (14.49%). This could be because in the Si QD micelles-CKAP4, the coupling of the CKAP4 antibody repaired some surface defects of the Si QD micelles, leading to a slight enhancement of the PL QY.

As we all know, there is a challenge in Si QDs biological imaging applications:Although Si exhibits little cytotoxicity, Si particles may exhibit cytotoxicity as the size decrease to a certain extent. In this study, cytotoxicity tests showed that Si QD micelles-CKAP4 exhibited selective cytotoxicity to lung cancer cells at 9.5–19 µg/mL. Therefore, as a result of CKAP4 antibody conjugation, the cytotoxicity of Si QD micelles-CKAP4 to normal cells was significantly less than that of lung cancer cells, which provides a powerful condition for the biological application of Si QD micelles-CKAP4.

In this study, human lung cancer cell line A549 and human renal epithelial cell line 293 T were used as target cells to investigate the targeting ability of Si QD micelles and Si QD micelles-CKAP4. A549 and 293 T cells were adherent and semi-adherent, respectively. During the experiment, the number of 293 T cells decreased because of repeated centrifugation and washing. Therefore, as shown in Fig. 4, the number of 293 T cells was lower than that of A549 cells.

In addition, it should be noted that A549 cells belong to the p53 wild-type lung cancer cell line. Therefore, only A549 cells cannot fully reflect the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer. Further studies will be conducted to test the targeting ability and imaging effect of Si QD micelles-CKAP4 on p53-negative cell lines (such as H1299) to provide a solid experimental basis for the clinical application of Si QD micelles-CKAP4 [22].

Conclusions

This study improved and modified the Si QD micelles reported by Pi et al. to prepare water-dispersible Si QD micelles-CKAP4. Si QD micelles-CKAP4 were spherical particles with a mean hydrodiameter of approximately 78.8 nm. UV–visible absorption of the Si QD micelles-CKAP4 ranged from 200 to 500 nm. With an excitation wavelength of 330 nm, strong fluorescence at 640 nm was observed in the fluorescence emission spectra. Si QD micelles-CKAP4 exhibited good targeting ability to lung cancer cells and lung cancer tissues both in vitro and in vivo. In addition, the in vivo fluorescence-imaging assay further showed that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. Cytotoxicity and H&E staining assays showed that the Si QD micelles-CKAP4 exhibited high biosafety both in vitro and in vivo. Si QD micelles-CKAP4 is a specifically targeted imaging agent for lung cancer and is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

Доступность данных и материалов

The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.

Сокращения

Si QD:

Si quantum dot

Si QD micelles-CKAP4:

CKAP4 antibody-conjugated Si quantum dot micelles

Dodecyl-Si QDs:

Dodecyl-passivated Si QDs

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

THF:

Тетрагидрофуран

DMEM:

Dulbecco’s modified eagle’s medium

PBS:

Phosphate buffer saline

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

DLS:

Динамическое рассеяние света

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

FTIR:

Fourier transform infrared spectroscopy

XRD:

Рентгеновская дифракция

SPF:

Specific pathogen free

DAPI:

4′, 6-Diamidino-2-phenylin-dole

H&E:

Hematoxylin and eosin