Fe (II) и MOF, покрытые дубильной кислотой, в качестве носителя артемизинина для поставки ионов двухвалентного железа для улучшения лечения тройного отрицательного рака молочной железы

Введение

Ферроптоз, недавно открытый подтип гибели клеток, может приводить к накоплению железозависимых гидропероксидов липидов (ПОЛ), что приводит к повреждению структуры и целостности клетки [1,2,3]. Новые данные свидетельствуют о том, что активация ферроптоза несколькими небольшими молекулами является эффективным подходом к подавлению опухоли в различных экспериментальных моделях рака, и породили большие ожидания в отношении потенциала ферроптоза как новой противоопухолевой терапии [4,5,6]. Тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC) является наиболее агрессивным подтипом таргетных методов лечения без рака молочной железы и часто связан с рецидивом опухоли, отдаленными метастазами и резистентностью к терапии [7]. Предыдущие исследования показали, что цистин / глутаматный антипортер xCT высоко экспрессируется во многих клетках TNBC, играя важную роль в поддержании уровней глутатиона (GSH) и окислительно-восстановительного баланса [8]. Снижение внутриклеточного содержания GSH может сделать клетки TNBC чувствительными к ферроптозу, тем самым убивая опухолевые клетки [8]. Примечательно, что ферроптоз также может обходить резистентность TNBC к рутинному запрограммированному апоптозу [9]. Следовательно, стратегии или лекарства, основанные на индукции ферроптоза, могут иметь терапевтический потенциал для клинического лечения рефрактерного TNBC.

Артемизинин (ART), сесквитерпеновый лактон, содержащий пероксидную группу, был выделен из традиционного китайского растения Artemisia annua и продемонстрировал желаемую противоопухолевую активность в нескольких линиях раковых клеток [10, 11]. Все больше данных показывает, что раковые клетки содержат значительно больше внутриклеточного пула железа, чем нормальные клетки, в то время как железо-опосредованное расщепление эндопероксидного мостика позволяет АРТ избирательно вызывать гибель клеток в нескольких линиях раковых клеток [12, 13]. Противоопухолевая активность, зависящая от ионов железа, привлекает все большее внимание в отношении ферроптоза, регулируемого ART [13]. Механически АРТ может вызывать лизосомную деградацию ферритина независимо от аутофагии, повышая клеточные уровни ионов двухвалентного железа и повышая чувствительность клеток к ферроптозу [11].

Однако остается неясным, вызывает ли АРТ ферроптоз TNBC. Кроме того, ряд факторов, таких как плохая растворимость в воде и недостаточная доступность внутриклеточных ионов двухвалентного железа, ограничивают дальнейшее применение АРТ в противоопухолевой терапии [13]. Ожидается, что нанокомплексы АРТ будут успешно использоваться в качестве перспективной системы доставки нанолекарств для противоопухолевых препаратов на основе АРТ [14,15,16]. В последние годы металлоорганические каркасы (MOF), класс пористых полимерных материалов, привлекают внимание благодаря демонстрации их больших размеров пор, большой видимой площади поверхности и избирательного поглощения малых молекул [17,18,19]. Как представитель материалов типа MOF, цеолитный имидазолатный каркас (ZIF-8) широко используется в разработке нанолекарств с характеристиками pH-чувствительности, высокой загрузки лекарственного средства и хорошей биосовместимости [20,21,22,23 ]. Кроме того, возможность включения регулируемой поверхности на MOF позволяет контролировать свойства поверхности и наделить ее многофункциональностью [24, 25]. Супрамолекулярная сборка металл-фенольной координационной оболочки на поверхности MOF недавно привлекла внимание из-за желаемых свойств, таких как разборка в ответ на стимул, коллоидная стабильность и биосовместимость [26, 27]. Металлофенольные координационные материалы на MOF могут быть идеальным носителем для доставки гидрофобного ART.

Вдохновленные этим, мы разработали покрытую координацией ионов железа и дубильной кислоты наносистему ZIF-8, инкапсулирующую ART (TA-Fe / ART @ ZIF) для регулирования ферроптоза в клетках TNBC, что показано на рис. 1. ZIF-8 был выбран в качестве наноносителя для инкапсуляции АРТ из-за его хорошей биосовместимости и чувствительного к pH высвобождения. Координационное покрытие ион двухвалентного железа и ТА было иммобилизовано на поверхности ART @ ZIF с целью обеспечения стабильности дисперсии и подачи ионов двухвалентного железа (Fe (II)). После интернализации свежеприготовленной наносистемы в клетки кислотная деградация носителей будет способствовать высвобождению ART и накоплению Fe (II). Повышение уровня Fe (II) в клетках разлагало бы ART на радикалы через расщепление железо-опосредованного эндопероксидного мостика, заметно усиливая эффекты ферроптоза. В конечном итоге открытие ферроптоза, опосредованного TA-Fe / ART @ ZIF, может открыть новые перспективы для разработки новых методов лечения TNBC.

Схематическое изображение получения наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF и синергетической индукции апоптоза / ферроптоза в опухолевых клетках

Материалы и методы

Реагенты

Артемизинин (99%), 2-метилимидазол (98%), нитрат цинка (ZnNO ₃ ; 98%), Ta (98%), сульфат железа (FeSO ₄ ; 98%) и безводный метанол предоставлены Aladdin-Reagent Co. Ltd. (Шанхай, Китай).

Изготовление наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF

Для приготовления наночастиц ART @ ZIF 200 мг ART растворяли в 1 мл безводного метанола и к полученному раствору ART медленно добавляли 2 г 2-метилимидазола (растворитель - 8 мл абсолютного метанола). При перемешивании магнитной мешалкой медленно добавляли 0,2 г нитрата цинка (растворитель - 1 мл абсолютного метанола). Наконец, объем раствора доводили до 15 мл и перемешивали в течение 10 минут с получением светло-белого раствора. После центрифугирования при 10000 об / мин образец трижды промывали метанолом. Надосадочная жидкость предназначалась для измерения содержания ART, а осадок сушили вымораживанием для получения твердого состояния для дальнейшего использования.

Для приготовления наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF раствор TA (40 мг / мл в деионизированной воде, 2 мл) медленно добавляли к раствору ART @ ZIF (10 мг / мл, 4 мл). После перемешивания в течение 20 минут 5 мг / мл FeSO ₄ медленно добавляли к вышеуказанному раствору. После повторного перемешивания в течение 30 мин получали раствор темно-пурпурного цвета. Наконец, осадок собирали центрифугированием при 10000 об / мин. Осадок трижды промывали деионизированной водой и лиофилизировали, чтобы получить TA-Fe / ART @ ZIF для дальнейшего использования.

Характеристика

ТЕМ (JEM-1230; JEOL, Токио, Япония) использовали для определения морфологического и элементного состава каждой части наночастицы. Динамическое рассеяние света и дзета-потенциал (DLS; Zetasizer Nano system Malvern Instruments, Малверн, Великобритания) использовали для оценки размера частиц и электрической стабильности наночастиц. Для анализа состава компонентов наночастиц использовали инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье (VERTEX 70; Bruker, Бремен, Германия) и термогравиметрический анализ. Рентгеновские фотоэлектронные спектроскопические (XPS) измерения были выполнены с использованием PHI 5000 Versa Probe III (Physical Electronics). Элементный состав материала TA-Fe / ART @ ZIF был выполнен с использованием EDX (модель Carl Zeiss:Neon-40).

Измерение эффективности инкапсуляции и емкости загрузки

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (Agilent 1200; Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) использовали для измерения количества АРТ в супернатанте. Скорость загрузки лекарственного средства и инкапсуляции АРТ можно рассчитать следующим образом:

Высвобождение in vitro и pH-реакция наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF

Обработанную диализную мембрану, обернутую 2 мг наночастиц, помещали в 50 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) с pH 7,4 и 5,0, соответственно, и непрерывно встряхивали при 37 ° C. Раствор вне диализной мембраны отбирали через 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов и 10 часов после начала эксперимента. Содержание АРТ в буферном растворе измеряли с помощью ВЭЖХ.

Культура клеток

Клеточные линии MDA ‐ MB ‐ 231 и L929 были приобретены из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA). Клетки культивировали при 37 ° C и 5% CO ₂ . влажности в среде RPMI-1640 (Solarbio, Пекин, Китай) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Cyclone, Юта, США), 100 мкг / мл пирувата натрия, пенициллина и стрептомицина (Solarbio, Пекин, Китай).

Тест на клеточную токсичность in vitro

Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) в соответствии с литературными методами [28, 29].

Клетки MDA-MB-231 и клетки L929 культивировали в стандартной клеточной среде в 96-луночных планшетах (5000 клеток на лунку) и инкубировали в 5% CO ₂ при 37 ° C в течение 24 часов. Жидкость в лунке была слита, и 100 мкл на лунку бессывороточной среды с PBS и различными концентрациями ART, TA-Fe / ZIF, TA-Fe / ART @ ZIF, дефероксамин (DFO, MedChemExpress, Шанхай, Китай) ), N-бензилоксикарбонил-Val-Ala-Asp (O-Me) фторметилкетон (Z-VAD-FMK, MedChemExpress, Шанхай, Китай) и ферростатин-1 (Fer1, MedChemExpress, Шанхай, Китай) были добавлены к 96 -луночные планшеты. Через 48 часов добавляли 10 мкл МТТ (5 мг / мл) и инкубировали еще 4 часа. Наконец, автоматический маркер фермента (BioTek Instruments Inc., США) использовали для измерения оптической плотности в каждой лунке. Результаты выражали как процент жизнеспособности клеток.

Анализ окрашивания кальцеином-ацетоксиметилом (кальцеин-AM)

Клетки MDA-MB-231 культивировали в 24-луночных планшетах (2 × 10 ⁴ клеток на лунку) и инкубировали в течение 24 часов. Впоследствии клетки обрабатывали различными концентрациями наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF в течение 24 часов. После удаления среды клетки окрашивали кальцеином-AM (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай) в темноте при 4 ° C в течение 20 мин и наблюдали под флуоресцентно-инвертированным микроскопом (Olympus, Токио, Япония).>

Проточная цитометрия для апоптоза

Клетки MDA-MB-231 помещали в шестилуночный планшет с плотностью 2,5 × 10 ⁵ . клеток на лунку при тех же условиях. После обработки PBS применяли ART, TA-Fe / ZIF и TA-Fe / ART @ ZIF в течение 24 часов. Затем клетки центрифугировали и собирали из шестилуночного планшета. После двойного окрашивания пропидием йодидом и аннексином-V (набор Annexin V-FITC; Beckman Coulter, Марсель, Франция) для обнаружения использовали проточную цитометрию.

Анализ определения активных форм кислорода (АФК) in vitro

Содержание АФК в клетках определяли с помощью флуоресцентного зонда АФК (диацетат дихлор-дигидрофлуоресцеина (DCFH-DA, Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай). Клетки MDA-MB-231 культивировали в шестилуночных планшетах (2,5 × 10 ⁵ клеток на лунку) и инкубировали в 5% CO ₂ при 37 ° C в течение 24 часов. Жидкость из лунок удаляли, и клетки обрабатывали следующим образом:контрольная группа (без сыворотки), группа положительного контроля и экспериментальная группа (различные концентрации наночастиц). После инкубации в течение 8 часов при 37 ° C в каждую лунку добавляли 0,1% DCFH-DA и клетки инкубировали в течение 30 минут. Клетки, нечувствительные к DCFH-DA, удаляли с помощью PBS и наблюдали под флуоресцентно-инвертированным микроскопом (Olympus, Токио, Япония).

Определение содержания малонового диальдегида (MDA) и GSH

Набор для анализа MDA (метод TBA; Jiancheng Bioengineering, Нанкин, Китай) и набор для анализа GSH (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай) использовали для измерения внутриклеточных уровней MDA и GSH. После обработки PBS, ART, TA-Fe / ZIF и TA-Fe / ART @ ZIF собирали и подсчитывали клетки MDA-MB-231. Внутриклеточное содержание MDA и GSH определяли в соответствии с инструкциями, предоставленными в наборах.

Вестерн-блоттинг

Клетки MDA-MB-231, обработанные различными наночастицами, лизировали лизисным буфером RIPA. После определения концентрации белка белки разных образцов разделяли с использованием 10% геля SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Нитроцеллюлозную мембрану, загруженную образцами белков, блокировали 0,5% раствором белка BSA в течение 1 часа, а нитроцеллюлозную мембрану и первичные антитела инкубировали в течение 24 часов при 4 ° C. Мы смывали первичные антитела с нитроцеллюлозной мембраны с помощью TBST и продолжали помещать его с соответствующими вторичными антителами при обычной температуре в течение 2 часов. После отмывания вторичных антител на целлюлозной мембране для нитроцеллюлозной мембраны использовали хемилюминесцентный раствор и наблюдали под гелевой системой визуализации.

Противоопухолевый эксперимент in vivo

Все эксперименты на животных были одобрены этическим комитетом Медицинского университета Вэйфана. Здоровым самкам голых мышей (возраст:4 недели; вес:13–17 г; Vital River, Пекин, Китай) вводили 5 × 10 ⁶ Клетки MDA-MB-231 в 150 мкл фосфатно-солевого буфера. Когда объем опухоли увеличился до 70–120 мм ³ , мышей случайным образом разделили на четыре группы. Каждую группу мышей отдельно лечили PBS, ART (20 мг / кг), TA-Fe / ZIF (80 мг / кг) и TA-Fe / ART @ ZIF (100 мг / кг). Каждой мыши вводили внутрибрюшинную инъекцию каждые три дня. Через 14 дней всех мышей умерщвляли. Ткани опухоли и важные органы собирали для окрашивания гематоксилином и эозином.

Статистический анализ

Все эксперименты повторяли не менее трех раз. Все данные были статистически проанализированы с использованием программного обеспечения SPSS версии 22.0 (IBM Corp., Армонк, США). Результаты выражали как среднее значение ± стандартное отклонение. P значения <0,05 обозначают статистическую значимость.

Результаты и обсуждение

Характеристики наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF

Во-первых, наночастицы ART @ ZIF были синтезированы при комнатной температуре из метанола, ацетата цинка, 2-метилимидазола и АРТ согласно литературным методикам [30]. Стабильные супрамолекулярные пленки металл-полифенол затем быстро формировались вокруг шаблонов ART @ ZIF путем встряхивания ТА и ионов двухвалентного железа. По сравнению с описанными магнитными наночастицами [31,32,33], TA-Fe / ART @ ZIF был приготовлен методом самосборки, форматирующим мембрану TA-Fe на поверхности MOF, без участия жестких химических или гидротермальных реакций. Что еще более важно, наноноситель TA-Fe / ART @ ZIF может запускаться из-за низкого pH, чтобы высвобождать ART и Fe (II), что дополнительно катализируется эндопероксидом ART для генерации C-центрированных свободных радикалов, заметно усиливая ферроптоз. . Эффективность инкапсуляции, которую измеряли с помощью ВЭЖХ с использованием супернатанта от первого центрифугирования, составляла 66,7%. Супернатант получали с помощью наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF, и расчетная лекарственная нагрузка ART составляла 11,4%. Согласно FTIR-спектроскопии (рис. 2a), характерные пики поглощения ART, а именно карбонильная связь при 1,738 см ^-1 и пероксимостик на 724 см ^-1 [34], наблюдались в наночастицах TA-Fe / ART @ ZIF, что указывает на успешную инкапсуляцию ART в наночастицы. Затем результаты термогравиметрического анализа показали, что АРТ полностью отменяется при повышении температуры примерно до 400 ° C (рис. 2b). По сравнению с наночастицами TA-Fe / ZIF было обнаружено, что ART составляет 7,1% от общей массы наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF, что в основном согласуется с результатами анализа ВЭЖХ.

а FTIR ART, ZIF-8 и TA-Fe / ART @ ZIF; б Термогравиметрический анализ (ТГА) ART, TA-Fe / ZIF и TA-Fe / ART @ ZIF

Результаты ПЭМ показали, что ZIF-8 и ART @ ZIF демонстрируют аналогичную однородную конфигурацию шестиугольника, и распределение частиц по размерам было определено примерно при 100 нм (фиг. 3a, b). Наночастицы TA-Fe / ART @ ZIF имели сферическую конфигурацию, а распределение частиц по размерам составляло 150 нм. По сравнению с полным ART @ ZIF, TA-Fe / ART @ ZIF, покрытый Fe (II) и TA, продемонстрировал очевидную обычную структуру ядро-оболочка, а размер мембраны TA-Fe составлял приблизительно 30 нм (рис. 3a). Кроме того, мы выполнили элементный анализ площади сформированных наночастиц. Картирование элементарных площадей подтвердило, что периферия наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF была окружена элементом Fe, что указывает на то, что Fe (II) и TA были успешно замаскированы (рис. 3b). Измерения XPS были проведены для изучения элементного состава поверхности и взаимодействия в композите TA-Fe / ART @ ZIF. Спектр XPS с широким сканированием TA-Fe / ART @ ZIF показан в Дополнительном файле 1:Рис. 1s. Основные пики, появляющиеся при примерно 285, 408, 531, 737 и 1036 эВ, были связаны с C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p и Zn 2p соответственно, демонстрируя образование нанокомпозита TA-Fe / ART @ ZIF. . Кроме того, изображения отображения EDS TA-Fe / ART @ ZIF показаны в Дополнительном файле 1:Рис. 2s. Очевидно, что пики, соответствующие таким элементам, как углерод (C), азот (N), кислород (O), железо (Fe) и цинк (Zn), хорошо согласуются со спектром РФЭС. За счет увеличения количества Fe (II) мы обнаружили, что гидродинамический диаметр наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF был увеличен (дополнительный файл 1:рис. 3s). Чтобы подтвердить покрытие, мы измерили дзета-потенциал различных наночастиц. Слой TA – Fe (II) на частицах ART @ ZIF сдвинул дзета поверхности от потенциала + 21 мВ до –19,5 мВ из-за кислотной природы TA (дополнительный файл 1:рис. 4s). Как сообщалось в предыдущей литературе [30], обильные полифенольные группы в структуре ТА не только обеспечивают способность покрытия подложки, но также способны координироваться с ионами переходных металлов (Fe, Zn) с образованием металл-фенольного комплекса. Когда Zn ²⁺ и Hmim смешиваются с образованием раствора, масса Zn ²⁺ ионы будут координироваться на поверхности частиц ART @ ZIF; таким образом, дзета-потенциал ART @ ZIF составляет + 21 мВ. Фенольные группы ТА (pKa 8.5) депротонированы отрицательно и поэтому могут взаимодействовать с положительно заряженным Zn ²⁺ , способствуя росту пленки TA – Fe на поверхности ART @ ZIF. Поскольку доставка лекарств благоприятствует носителям, стабильность является важным фактором для их применения в медицине. Стабильность наночастиц была продемонстрирована путем диспергирования в PBS в течение одной недели. Как показано в Дополнительном файле 1:Рис. 5s, размер частиц показал желаемый размер и стабильность с течением времени исследования.

а ПЭМ-изображения и распределение наночастиц ZIF-8, ART @ ZIF и TA-Fe / ART @ ZIF по размерам. Шкала шкалы:100 нм; б распределение углерода и элемента железа в наночастицах TA-Fe / ART @ ZIF. Шкала:100 нм

а Высвобождение АРТ in vitro из наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF при pH 7,4 и 5,0. б Цитотоксичность наночастиц ART, TA-Fe / ZIF и TA-Fe / ART @ ZIF в клетках MDA-MB-231 при 0, 12,5, 25, 50 и 100 мкг / мл. c Жизнеспособность клеток L929, обработанных TA-Fe / ART @ ZIF в различных концентрациях. г Окрашивание кальцеином-AM клеток MDA-MB-231, обработанных наночастицами TA-Fe / ART @ ZIF в концентрациях 0, 25, 50 и 100 мкг / мл

Производство АФК определяется по флуоресценции DCFH-DA в клетках MDA-MB-231, обработанных наночастицами ART, TA-Fe / ZIF и TA-Fe / ART @ ZIF

Высвобождение и цитотоксичность TA-Fe / ART @ ZIF in vitro

Затем, чтобы изучить, обладает ли TA-Fe / ART @ ZIF чувствительным к pH поведением разложения, мы исследовали высвобождение ART из наночастиц в нейтральных и кислых условиях. Как показано на рис. 4а, в кислых условиях наночастицы могут быстро высвободить примерно 58% АРТ в течение 1 часа. Однако в нейтральных условиях наночастицы могут высвобождать лишь незначительное количество АРТ. Кроме того, во время обработки внешнего раствора диализной мембраны гидроксидом натрия раствор с группой pH =5,0 реагировал с гидроксидом натрия с образованием значительного белого осадка. Однако этого явления не наблюдалось в группе с pH =7,4.

Согласно нашей гипотезе, белый осадок представляет собой осадок гидроксида цинка, образовавшийся в результате диссоциации ионов цинка и щелочи от наночастиц в кислых условиях. В совокупности это свидетельство успешно показывает, что наши наночастицы обладают способностью диссоциировать в кислых условиях.

При разработке наносистемы TA-Fe / ART @ ZIF структуры TA-Fe (II) и ZIF удаляются для высвобождения заключенного в оболочку ART и Fe (II) в кислых условиях микросреды опухоли. Повышение уровня Fe (II) в клетках разлагало бы ART на радикалы через расщепление железо-опосредованного эндопероксидного мостика, заметно усиливая эффекты ферроптоза. Соответственно, тесты МТТ были проведены для изучения цитотоксичности наносистемы по отношению к клеткам MDA-MB-231 и клеткам L929. По сравнению с ART, наночастицы TA-Fe / ART @ ZIF показали большую цитотоксичность по отношению к клеткам MDA-MB-231 (фиг. 4b) и низкую цитотоксичность по отношению к нормальным клеткам (фиг. 4c). Наночастицы TA-Fe / ART @ ZIF подавляли активность клеток MDA-MB-231 на 53,9%, тогда как ART при той же концентрации подавлял только 24,1% целых клеток. Экспериментальные результаты окрашивания кальцеином-AM подтвердили, что количество жизнеспособных клеток MDA-MB-231 постепенно снижалось с увеличением концентрации наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF (рис. 4d).

Расширенное создание ROS TA-Fe / ART @ ZIF в ячейках MDA-MB-231

Известно, что АРТ проявляет свою противораковую активность за счет генерации АФК, продуцируемых железо-опосредованным расщеплением эндопероксидного мостика [35, 36]. Таким образом, мы исследовали эффективность TA-Fe / ART @ ZIF для индукции генерации ROS с помощью зонда 2 ', 7'-дихлородигидрофлуоресцеина диацетата (DCHF-DA) [37]. Как показано на фиг. 5, немного более сильный сигнал флуоресценции наблюдался в клетках, обработанных ART и TA-Fe / ZIF, по сравнению с необработанными группами, что указывает на то, что ионы ART и Fe (II) могут индуцировать генерацию ROS. Напротив, воздействие нанолекарства TA-Fe / ART @ ZIF с сильным сигналом флуоресценции обнаруживается в клетках как свидетельство желаемого выхода ROS, который генерируется расщеплением опосредованного Fe (II) эндопероксида ART. Приготовленная наносистема в клетках будет разрушаться и накапливать Fe (II), что значительно увеличивает генерацию АФК. Противоопухолевый эффект АРТ и ее производных объясняется их способностью вызывать апоптоз посредством различных клеточных процессов, начиная от реакции на повреждение ДНК, опосредованной лизосомами макроаутофагии катаболических процессов и окислительного стресса [13, 35, 38]. Также сообщалось, что железо-опосредованное расщепление эндопероксидного мостика при АРТ может влиять на внутриклеточный окислительный баланс ферроптоза во многих типах раковых клеток [11]. Эта индукция ферроптоза, основанная на окислительном дисбалансе, может быть дополнительно усилена добавлением Fe (II). Хотя Fe (II) активирует АРТ, он также может реагировать с внутриклеточной перекисью водорода с образованием гидроксильных свободных радикалов посредством реакции Фентона, которая усиливает индуцирующий апоптоз эффект АРТ в опухолевых клетках.

TA-Fe / ART @ ZIF индуцированный апоптоз и ферроптоз в клетках MDA-MB-231

Между тем, чтобы исследовать гибель клеток и роль Fe (II), мы использовали хелатор железа дефероксамин, ингибитор апоптоза Z-VAD-FMK и ингибитор ферроптоза ферростатин-1 для спасения этих клеток. Как и предполагалось, дефероксамин, поглотитель Fe (II), очевидно, может блокировать гибель клеток, что свидетельствует о важной роли Fe (II). Более того, выживаемость клеток MDA-MB-231 была значительно улучшена с помощью ингибитора апоптоза и ферроптоза с 31,4% до 56,3% и 76,0% соответственно (рис. 6a), что подчеркивает важность апоптоза и ферроптоза в TA-Fe / ART. Наночастицы @ZIF опосредуют гибель клеток. Кроме того, мы использовали анализ на основе аннексина V-FITC с помощью проточной цитометрии для количественного определения степени апоптоза. Результаты показывают, что наночастицы TA-Fe / ART @ ZIF могут вызывать апоптоз в 21,8% клеток MDA-MB-231 (дополнительный файл 1:рис. 6s). Этот процент был выше, чем зарегистрированный для АРТ, что означает, что апоптоз опосредован наночастицами TA-Fe / ART @ ZIF, но это не основная причина.

а Ингибиторы DFO (дефероксамин), Fer-1 (Ферростатин-1) и Z-VAD-FMK спасали жизнеспособность клеток MDA-MB-231 при обработке наночастицами TA-Fe / ART @ ZIF 100 мкг / мл соответственно. б Наночастицы ART, TA-Fe / ZIF и TA-Fe / ART @ ZIF способствовали избыточному количеству MDA в клетках MDA-MB-231. c Наночастицы ART, TA-Fe / ZIF и TA-Fe / ART @ ZIF потребляли внутриклеточный GSH. г Уровни экспрессии белков GPX4 в клетках MDA ‐ MB ‐ 231, обработанных наночастицами ART, TA-Fe / ZIF и TA-Fe / ART @ ZIF

Общей чертой ферроптоза является эндогенное перекисное окисление липидов [39]. MDA, продукт перекисного окисления липидов [40], был исследован для оценки степени ферроптоза. Результаты показали, что наночастицы TA-Fe / ART @ ZIF имели примерно в 2,5 раза более высокие уровни МДА, чем контрольная группа (рис. 6b). Это предполагалось из-за присутствия Fe (II), обогащенного наноносителями, и соответствующего повышения уровней липидных радикалов. Как один из основных антиоксидантных компонентов в клетках, внутриклеточный GSH снижается, что сопровождается ферроптозом [41]. Учитывая важную роль GSH в ферроптозе, мы оценили внутриклеточный уровень GSH после обработки наночастицами TA-Fe / ART @ ZIF. GSH был значительно снижен по сравнению с клетками, обработанными носителем (фиг. 6c). Это предоставило убедительные доказательства истощения GSH и дисбаланса окисления, который был основан на опосредованной Fe (II) активации ART наночастицами TA-Fe / ART @ ZIF. Затем был проведен вестерн-блоттинг, чтобы понять влияние наночастиц TA-Fe / ART @ ZIF на активность GPX4 [42]. Мы наблюдали, что наночастицы TA-Fe / ART @ ZIF вызывали более значительное ингибирование активности GPX4, чем ART (рис. 6d). Эти данные также хорошо согласуются с максимальной степенью истощения GSH.

Противоопухолевый эксперимент in vivo

Мы оценили противоопухолевую эффективность наших наночастиц по отношению к клеткам MDA-MB-231 in vivo по ингибированию подкожных опухолей ксенотрансплантата у голых мышей с опухолями. Во время 14-дневного лечения, по сравнению с другими группами, наночастицы TA-Fe / ART @ ZIF могут значительно ингибировать рост опухолей ксенотрансплантата MDA-MB-231 в результате обильной генерации ROS посредством реакции Fe (II) -ART (рис. . 7а). Кроме того, не было значительного различия массы тела во всех экспериментальных группах (рис. 7b), что свидетельствует о незначительных побочных эффектах TA-Fe / ART @ ZIF. To further study the therapeutic effect, the tumor and other normal tissues were examined by H&E staining after being treated for 14 d. As shown in Fig. 8, TA-Fe/ART@ZIF caused the largest region of cell death in the tumor tissue, while there was no obvious damage and apoptosis in the normal tissues. Overall, these results demonstrated that the TA-Fe/ART@ZIF-mediated therapy not only led to anticancer efficacy, but also have a low level of acute systematic toxicity in the SFT-MB-mediated therapy.

а Relative tumor volume after treated with treated with PBS, ART, TA-Fe/ZIF, and TA-Fe/ART@ZIF nanoparticles. б Relative mice body weight of various groups

H&E stains of organs and tumors from various mice groups. Scale bar:50 μm

Conclusion

In summary, ferroptosis provides a potential remedy for TNBC treatments, since it has exclusive advantages to overcome inevitable barriers of the currently prevalent therapy. Here, we designed a ferrous-supply nanocarrier for ART based on TA–Fe(II) coated on the ZIF nanoparticles with ART encapsulated via coordination-driven self-assembly for enhanced ferroptosis. The nano-carrier could be dissolved in the weak acidic microenvironment to release ART and Fe(II), which is further caused a high level of intracellular ROS and MDA, accompanied with decreasing of GSH and GPX4, leading to potent tumor growth inhibition and anticancer efficacy in vitro and in vivo. This work provides a novel approach to enhance the potency of ferroptotic nano-medicine and new directions for TBNC therapy. Biocompatibility and comprehensive mechanisms of TA-Fe/ART@ZIF-induced ferroptosis should be ensured for further investigation.

Доступность данных и материалов

Все данные полностью доступны без ограничений.

Сокращения

MOF:

Metal–organic frameworks

TNBC:

Triple-negative breast cancer

ART:

Artemisinin

TA:

Tannic acid

ZIF:

Zeolitic imidazolate framework-8

TA-Fe/ART@ZIF:

Tannic acid and ferrous ion coated on the zeolitic imidazolate framework-8 with artemisinin encapsulated

ROS:

Активные формы кислорода

LPO:

Lipid hydroperoxides

GSH:

Glutathione

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

FTIR:

Fourier transform infrared spectroscopy

HPLC:

High-performance liquid chromatography

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

DFO:

Deferoxamine

Fer-1:

Ferrostatin-1

Z-VAD-FMK:

N-Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) fluoromethyl ketone

Calcein-AM:

Calcein-acetoxymethyl

DCFH-DA:

Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate

MDA:

Malondialdehyde

BSA:

Bovine serum albumin

TBST:

Tris-buffered saline Tween

SDS-PAGE:

Polyacrylamide gel electrophoresis

GPX4:

Glutathione peroxidase 4