Nec-1 ослабляет нейротоксичность, вызванную наноматериалами диоксида титана, на клетки Sh-Sy5y через RIP1

Введение

Благодаря своим великолепным физико-химическим свойствам наноматериалы диоксида титана синтезируются [1] и широко используются в различных целях, таких как косметика [2], промышленность [3, 4] и медицина [5]. Однако такое широкое использование может представлять большую угрозу для здоровья человека [6]. После воздействия большая часть наночастиц диоксида титана (TNP) попадает в организм человека при вдыхании и проглатывании [6]. Дыхательная система [7], пищеварительная система [8] и сердечно-сосудистая система [9] могут быть прерваны абсорбированными TNP. Точно так же мозг как наиболее важная часть центральной нервной системы также может быть нарушен, поскольку циркулирующие TNP могут проникать через гематоэнцефалический барьер, а вдыхаемые НЧ могут транспортироваться в мозг через обонятельный путь [10]. . Как только TNP попадают в мозг, они могут накапливаться там и вызывать повреждение мозга, что приводит к дисфункциям. Повреждение головного мозга обычно необратимо и серьезно, поэтому необходимо расследовать любую потенциальную причину повреждения [11].

Хотя ни одно эпидемиологическое исследование не изучало связь между воздействием TNP и заболеваниями мозга, множество исследований in vivo и in vitro подтвердили нейротоксичность TNP [12]. Более того, основное внимание уделялось исследованиям с целью раскрытия основных механизмов. С этой целью мы ранее рассмотрели известные в настоящее время молекулярные механизмы нейротоксичности TNP и обнаружили, что процессы запрограммированной гибели клеток (PCD), такие как апоптоз и аутофагия, участвуют в нейротоксичности TNP [13].

Некроптоз, также называемый регулируемым некрозом, представляет собой еще один тип PCD. В отличие от апоптоза, который зависит от каспазы, некроптоз зависит от взаимодействующей с рецептором протеинкиназы 1/3 (RIP1 / RIP3). Активированный RIP1 рекрутирует RIP3 для образования некросомы, которая активирует белок, подобный домену киназы смешанного происхождения (MLKL), чтобы инициировать некроптоз [14]. Некроптоз может регулировать гибель клеток и нейровоспаление [15, 16], которые оба участвуют в нейротоксичности TNP. Таким образом, мы предположили, что некроптоз участвует в нейротоксичности, вызванной TNP.

Чтобы проверить нашу гипотезу, мы провели исследование in vitro, чтобы изучить роль некроптоза в нейротоксичности TNP. В этом исследовании жизнеспособность клеток, утечка ЛДГ и воспалительные цитокины (TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-8) измерялись после воздействия TNP. Сначала клетки SH-SY5Y культивировали с различными концентрациями TNP. Во-вторых, клетки подвергались воздействию TNP с Nec-1 или без него, который является мощным ингибитором некроптоза. В-третьих, экспрессию гена RIP1, который может подавляться Nec-1, подавляли с помощью siRNA, после чего мутантные клетки и клетки дикого типа обрабатывали TNP. Это исследование проливает свет на всестороннее понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе нейротоксичности TNP.

Результаты

TNP подавляют жизнеспособность клеток

Чтобы проверить цитотоксичность TNP для клеток SH-SY5Y, мы сначала оценили жизнеспособность клеток с помощью анализа CCK8. Клетки культивировали с концентрациями TNP от 5 до 160 мкг / мл в течение 24, 48 и 72 часов. Как показано на рис. 1, жизнеспособность клеток оставалась неизменной в клетках, обработанных 5, 10, 20 и 40 мкг / мл после 24 часов воздействия. Когда клетки обрабатывали в течение 48 и 72 часов, жизнеспособность клеток оставалась неизменной только в группе 5 мкг / мл ( p =0,4507 через 48 часов и p =0,1002 через 72 ч). Более того, жизнеспособность клеток была значительно ниже в клетках, обработанных 80 мкг / мл TNP после 48 ( p =0,0007) и 72 часа ( p =0,0008). Основываясь на этих результатах, мы пришли к выводу, что TNP снижали жизнеспособность клеток в зависимости от дозы и времени (данные не показаны), что указывает на то, что длительное воздействие было более токсичным.

Воздействие различных концентраций TiO2-NP на жизнеспособность клеток SH-SY5Y через 24, 48 и 72 часа и утечку ЛДГ через 72 часа. (По сравнению с контрольной группой ^* p <0,05, ^** p <0,01, ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

TNP повреждают целостность мембраны

Nest, мы проанализировали токсическое действие TNP на целостность мембран после 72 ч воздействия. Целостность мембраны оценивали путем измерения утечки ЛДГ. Как показано на фиг. 1b, уровни ЛДГ были значительно увеличены в клетках, обработанных TNP в дозах выше 5 мкг / мл. Повышенная продукция ЛДГ наблюдалась в клетках, обработанных 40, 80 и 160 мкг / мл ( p <0,0001). Эти результаты свидетельствуют о том, что TNP увеличивают уровни ЛДГ дозозависимым образом, что было похоже на анализ CCK8.

Воздействие TNP способствует воспалению

Воспалительный ответ после воздействия TNP анализировали с помощью ELISA. После обработки клеток различными концентрациями TNP в течение 72 часов измеряли уровни TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-8. Как показано на фиг. 2, секреция IL-8 была повышена во всех клетках, обработанных TNP; уровни TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-8 были равномерно повышены в клетках, обработанных дозами выше 5 мкг / мл ( p <0,01). Более того, воспаление было значительно выше в клетках, обработанных дозами выше 10 мкг / мл в группе ( p <0,0001). В целом TNP усиливали воспаление в зависимости от дозы.

Воздействие различных концентраций TiO2-NP (мкг / мл) на воспаление клеток SH-SY5Y через 72 часа. (По сравнению с контрольной группой ^**** p <0,0001)

Наши результаты показали, что TNP индуцировали воспалительное повреждение дозозависимым образом. Мы приняли концентрацию TNP 80 мкг / мл и период воздействия 72 часа в следующих экспериментах, чтобы изучить роль некроптоза в нейротоксичности TNP.

Совместное лечение Nec-1 подавляет нейротоксичность TNP

Чтобы проанализировать роль некроптоза в воспалительном поражении, мы совместно обрабатывали клетки Nec-1 (ингибитор некроптоза) и TNP. Как показано на рис. 3a, клетки SH-SY5Y подвергались воздействию TNP или TNP + Nec-1 (1, 5, 10, 15 или 20 мкМ), и мы обнаружили, что Nec-1 резко улучшал вызванное TNP снижение концентрации жизнеспособность клеток (10, 15, 20 мкМ) ( p <0,0001). Поскольку жизнеспособность клеток в группах, обработанных 15 мкМ и 20 мкМ, была не выше, чем в группах, обработанных 10 мкМ (p =0,6643 и p =0,6292), мы совместно обрабатывали клетки 10 мкМ Nec-1 для анализа влияния на целостность мембраны.

Влияние Nec-1 на жизнеспособность клеток и ЛДГ после воздействия TNP. ( ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

После культивирования клеток с TNP или TNP + Nec-1 мы обнаружили, что уровни ЛДГ в группе TNP + Nec-1 были намного ниже, чем в группе, получавшей только TNP ( p =0,0005). Кроме того, лечение одним только Nec-1 не увеличивало утечку ЛДГ ( p =0,9878).

В итоге 10 мкМ Nec-1 может эффективно ингибировать цитотоксичность TNP и не токсичен для клеток.

Для анализа противовоспалительной способности Nec-1 клетки культивировали с TNP или TNP + Nec-1. Как показано на фиг. 4, производство TNF-α ( p =0,003), ИЛ-1β ( p =0,0013), Ил-6 ( p <0,0001), и Ил-8 ( p =0,0004) был значительно ниже в группе TNP + Nec-1, чем в группе TNP.

Влияние Nec-1 на воспаление после воздействия TNP. ( ^** p <0,01, ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Эти результаты предполагают, что Nec-1 может уменьшать воспалительные реакции, вызванные воздействием TNP.

Отключение звука RIP1 снижает воспалительное поражение, вызванное TNP

Чтобы определить, устраняет ли Nec-1 воспалительное повреждение, вызванное TNP через RIP1, мы эффективно подавляли экспрессию RIP1 в клетках с помощью миРНК (рис. 5, p <0,0001). Затем измеряли воспалительное повреждение после воздействия TNP на мутантные клетки и клетки дикого типа. Рисунок 6a демонстрирует, что жизнеспособность клеток в группе TNPs + si-RIP1 была значительно выше, чем в группе TNPs + si-NC ( p =0,0002). Производство СДГ (рис. 6б, p <0,0001) и уровни TNF-α ( p <0,0001), ИЛ-1β ( p =0,0001), Ил-6 ( p <0,0001), и Ил-8 ( p =0,0001) (рис. 7) в группе TNPs + si-RIP1 были значительно ниже, чем в группе TNPs + si-NC. Эти результаты показали, что TNP способствовали воспалительному повреждению через RIP1.

Экспрессия мРНК после трансфекции клеток SH-SY5Y si-RIP1. ( ^**** p <0,0001)

Жизнеспособность клеток и утечка ЛДГ после воздействия TNP на мутантные клетки и клетки дикого типа. ( ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Воспаление после воздействия TNP на мутантные клетки и клетки дикого типа. ( ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Обсуждение

В этом исследовании мы обнаружили, что воздействие TNP индуцировало цитотоксичность для клеток SH-SY5Y дозозависимым образом и что некроптоз участвовал в нейротоксичности TNP. Чтобы изучить роль некроптоза, мы подвергли клетки воздействию TNP с или без Nec-1 (мощный ингибитор некроптоза) [17, 18] и измерили жизнеспособность клеток, утечку ЛДГ и уровни воспалительных цитокинов. Наши данные предполагают, что совместное лечение Nec-1 может смягчить воспалительное повреждение, вызванное TNP. Поскольку исследования показали, что Nec-1 проявляет свои эффекты, подавляя активность RIP1, мы трансфицировали клетки si-RIP1, чтобы определить, участвует ли RIP1 в защитных эффектах Nec-1. Мутантные клетки и клетки дикого типа обрабатывали TNP и оценивали воспалительное повреждение. Это указывает на то, что жизнеспособность клеток в группе si-RIP1 была выше, чем в группе si-NC, а уровни утечки ЛДГ и воспалительных цитокинов были ниже в группе si-RIP1, чем в группе si-NC после воздействия TNP. . В заключение, настоящее исследование впервые показало, что некроптоз вовлечен в вызванное TNP воспалительное повреждение клеток.

Мы подтвердили нейротоксичность TNP в нашем исследовании in vitro. После того как клетки SH-SY5Y подвергались воздействию различных концентраций TNP в течение разного времени инкубации, жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа CCK8. Как показано на фиг. 1a, воздействие TNP снижает жизнеспособность клеток дозозависимым образом; после 48 и 72 часов воздействия жизнеспособность клеток в группах 80 и 160 TNP резко снизилась по сравнению с контрольной группой ( p <0,001). Чтобы дополнительно подтвердить цитотоксичность, мы также измерили утечку ЛДГ. Данные на рис. 1b показали, что продукция ЛДГ увеличивалась дозозависимым образом после 72 часов воздействия, а уровни ЛДГ в группах 40, 80 и 160 были значительно выше, чем в контрольной группе ( p <0,0001). Поскольку предыдущие исследования показали, что нейровоспаление может стимулироваться воздействием TNP [19], также измерялись уровни TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-8. На рисунке 2 показано, что уровни этих четырех воспалительных цитокинов были значительно повышены по сравнению с контрольной группой и были значительно выше в группах, получавших от 20 до 160 мкг / мл ( p <0,0001). Взятые вместе, наши результаты показали, что TNP могут вызывать нейротоксичность дозозависимым образом, что согласуется с предыдущими исследованиями. TNP могут абсорбироваться нейрональными клетками и ингибировать пролиферацию [20,21,22]. Кроме того, воздействие TNP может снизить жизнеспособность клеток и способствовать утечке ЛДГ дозозависимым образом [23,24,25,26,27].

Мы совместно обрабатывали клетки Nec-1, чтобы выяснить, участвует ли некроптоз в нейротоксичности, вызванной TNP. После обработки клеток указанными концентрациями TNP с Nec-1 или без него оценивали жизнеспособность клеток, утечку ЛДГ и воспаление. На рис. 3а показано, что снижение жизнеспособности клеток после воздействия TNP значительно ингибировалось совместной обработкой 10 мкМ Nec-1. Между тем, фиг. 3b показывает, что обработка 10 мкМ Nec-1 не увеличивала уровни ЛДГ, а уровни ЛДГ в клетках, обработанных группой TNP + Nec-1, были значительно ниже, чем в группе, получавшей только TNP. Затем мы измерили эффекты совместного лечения с Nec-1 на воспаление, вызванное TNP. На фигуре 4 показано, что уровни TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-8 были значительно ниже в клетках, обработанных TNP + Nec-1. Эти результаты подтвердили, что Nec-1 может защищать клетки от гибели и воспалительных процессов [28, 29].

Наконец, поскольку RIP1 является мишенью Nec-1, мы оценили, может ли RIP1 регулировать нейротоксичность TNP. Мы сконструировали мутантные клетки, подавив экспрессию RIP1 (рис. 5). Данные фиг.6 и фиг.7 показали, что после воздействия TNP жизнеспособность клеток была выше, а уровни ЛДГ, TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-8 были ниже в группе si-RIP1, чем что в si-NC, что указывает на то, что TNP усиливают цитотоксичность через RIP1. Аналогичным образом, несколько исследований показали, что RIP1 может регулировать гибель клеток и воспалительные процессы [30, 31].

Хотя мы впервые сообщаем, что Nec-1 может снижать нейротоксичность TNP путем подавления сигнального пути некроптоза, наше исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, цитотоксичность наноразмерных материалов отличается от их объемных и может в значительной степени зависеть от свойств поверхности [32], что может объяснить обратный результат повышения жизнеспособности клеток, обнаруженный Sebastián et al. [33]. Следовательно, важно всесторонне оценить нанотоксичность у субъектов по множеству аспектов, таких как пролиферация клеток, целостность мембран, окислительный стресс, воспаление, функция митохондрий, клеточный цикл, цитоскелет и эпигенетика. Во-вторых, RIP1 может рекрутировать RIP3 для формирования функциональной некросомы, жизненно важного активатора MLKL, чтобы инициировать некроптоз [34]. Мы предполагаем, что RIP3 / MLKL может участвовать в нейротоксичности TNP, что должно быть изучено в будущих исследованиях. Кроме того, следует также оценить связь RIP3 / MLKL с нейротоксичностью TNP. В-третьих, активные формы кислорода (ROS) как основные механизмы, лежащие в основе нейротоксичности TNPs [35, 36], как сообщалось, являются восходящим сигналом RIP1 [37]. Следовательно, следует обсудить, являются ли ROS выше RIP1 в нейротоксичности TNP. В-четвертых, для оценки хронической цитотоксичности клетки должны подвергаться воздействию нетоксичных концентраций (TNP <5 мкг / мл) в течение длительного периода (более 72 часов). В-пятых, мы должны оценить роль некроптоза в нейротоксичности TNP в большем количестве линий нейрональных клеток и первичных нейрональных клетках человека и животных.

Выводы

Наше исследование выявило некроптоз как еще один механизм запрограммированной гибели клеток, участвующий в нейротоксичности, вызванной TNP. В этом исследовании мы обнаружили, что TNP могут вызывать воспалительное повреждение в клетках SH-SY5Y дозозависимым образом и что совместное лечение Nec-1 (мощный ингибитор некроптоза) может уменьшить эти вредные эффекты. RIP1, мишень Nec-1, подавлялся si-РНК, которая эффективно смягчала воспалительное повреждение, вызванное воздействием TNP. В заключение, Nec-1 ингибировал воспалительное повреждение клеток SH-SY5Y, вызванное воздействием TNP, путем воздействия на путь RIP1. Следует дополнительно оценить вышестоящие и нижележащие сигнальные пути RIP1, участвующие в нейротоксичности TNP.

Материалы и методы

Подготовка TNP и культура клеток

Мы ранее охарактеризовали TNP и приготовили их в соответствии с нашей ранее опубликованной методикой [38]. Вкратце, TNP растворяли в RPMI 1640 до различных концентраций 5, 10, 20, 40, 80 и 160 мкг / мл. Раствор TNP стерилизовали и обрабатывали ультразвуком (300 Вт, 10 мин) при комнатной температуре для предотвращения агрегации частиц перед обработкой. Клетки в культуральной среде, не подвергнутые действию TNP, служили контрольной группой. Клетки SH-SY5Y, купленные в банке клеток Шанхайского института наук о жизни Китайской академии наук, культивировали в среде RPMI 1640 (HyClone, Логан, Юта, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, продукт линии Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ .

Анализ жизнеспособности клеток и утечки LDH

Жизнеспособность клеток измеряли с использованием набора для подсчета клеток-8 (CCK8. Dojindo, каталожный номер СК04). Вкратце, 1 × 10 ⁴ Клетки SH-SY5Y помещали в 96-луночный планшет и культивировали в инкубаторе при 37 ° C (5% CO ₂ ) за 24 ч до воздействия ТНП. Затем клетки инкубировали с TNP в различных концентрациях (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 и 80 мкг / мл) в течение еще 24 часов. После обработки клетки инкубировали с CCK-8 еще 2 часа. Затем измеряли оптическую плотность (OD) при 450 нм, помещая 96-луночный планшет в считывающее устройство для микропланшетов (BioTek, Winooski, VT, USA). Жизнеспособность клеток каждой группы, выраженная в процентах, рассчитывалась как (ODtreated - ODblank) / (ODcontrol - ODblank) × 100%.

Целостность мембран измеряли с помощью коммерческого набора (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Китай). После того как клетки SH-SY5Y подвергались воздействию TNP в различных концентрациях в течение 72 часов, секрецию ЛДГ анализировали в соответствии с инструкциями производителя.

Воспалительный ответ

ELISA применяли для измерения уровней TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-8, продуцируемых клетками SH-SY5Y. Вкратце, клетки SH-SY5Y подвергали воздействию TNP в течение 72 часов, и супернатант собирали для анализа в соответствии с инструкциями производителя (Elabscience Biotechnology Co., Ltd.).

Трансфекция миРНК

Следуя протоколу производителя, si-RIP1 или миРНК отрицательного контроля (si-NC) в концентрации 100 нМ трансфицировали в клетки с помощью липофектамина 2000. Эффективность подавления генов с помощью миРНК оценивалась с помощью ПЦР в реальном времени.

ПЦР в реальном времени

РНК клеток, подвергшихся воздействию различных концентраций TNP, выделяли с использованием набора для водной РНК (Ambion Inc., Остин, Техас, США) в соответствии с инструкциями производителя. Относительную экспрессию RIP1 измеряли с помощью ПЦР в реальном времени. Относительные уровни мРНК RIP1 были нормализованы по экспрессии β-актина.

Статистический анализ

Для анализа данных использовали программное обеспечение SPSS 11.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Для сравнения средних значений групп использовали односторонний дисперсионный анализ. p <0,05 считалось статистически значимым.

Доступность данных и материалов

Имеется в рукописи.

Сокращения

TNP:

Наночастицы диоксида титана

Nec-1:

Некростатин-1

RIP:

Рецептор взаимодействующая протеинкиназа

MLKL:

Белок, подобный домену киназы смешанного происхождения

ROS:

Активные формы кислорода