Группа комплексов на основе PAMAM и квантовых точек, используемых в клинических иммуноанализах

Введение

Квантовые точки (КТ) широко используются в качестве светильников из-за их высоких квантовых выходов флуоресценции, высокой фотостабильности и низких свойств фотообесцвечивания. Они также широко используются в качестве органических флуорофоров при визуализации клеток и биотехнологии. В частности, кадмийсодержащие КТ (т.е. CdSe и CdTe) имеют значительные преимущества, поскольку при облучении с той же длиной волны в диапазоне 430–660 нм они имеют электромагнитный спектр излучения, зависящий от размера [1, 2]. Следовательно, КТ, конъюгированные с антителами, являются наиболее многообещающими зондами для молекулярной визуализации.

Дендример полиамидоамина (ПАМАМ), как одна из наиболее широко и глубоко изученных дендритных макромолекул, имеет следующие характеристики:огромное количество поверхностных функциональных групп, большое количество полостей внутри молекул, наноразмерный размер и высокая биосовместимость. При конъюгировании с лекарствами и антителами эти дендримеры могут улучшать растворимость лекарства и его системную циркуляцию, но не препятствуют биологической активности лекарства [3]. Поэтому антитела, модифицированные ПАМАМ, часто используются в клинической иммунизации.

Клинические иммуноанализы включают множество методов, таких как WB, ELISA, IHC (иммуногистохимия), ICC (иммуноцитохимия) и FCM (проточная цитометрия). Среди них FCM, использующий зонды специфических антител, выполняет быстрый анализ отдельных клеток или других биологических частиц на клеточном и молекулярном уровне. Таким образом, FCM - один из наиболее широко используемых иммуноанализов. Если проводится скрининг клеток, достаточно использовать соответствующий зонд на антитела; однако, если желателен скрининг малых биологических молекул, таких как скрининг небольшого белка, вируса или цитокина, следует применять метод CBA (цитометрический набор шариков), поскольку FCM не может непосредственно обнаруживать небольшие цитокины. В методе CBA используются меченые красителем шарики, сконструированные со специфическими захватывающими антителами на поверхности. Когда шарики CBA смешиваются с образцом и соответствующими меченными красителем антителами, сэндвич-комплексы образуются, как в ELISA, и небольшой антиген может быть обнаружен с помощью FCM.

В этом исследовании мы представляем группу комплексов, включая PAMAM-конъюгированный козий анти-кроличий IgG и QD-конъюгированный козий антимышиный IgG. Эта группа комплексов может быть использована для FCM, ICC и IHC. Когда добавляются кроличий антиген и мышиный антиген, будет обнаружен соответствующий антиген. Эта модель может обнаруживать многие типы антигенов, включая небольшие белки, вирусы и цитокины, когда присутствуют соответствующие антитела мыши и кролика. На схеме 1 представлены комплексы, используемые в FCM, в качестве примера мы берем HSP27. HSP27 также известен как HSPB1 (семейство белков теплового шока B номер 1), и это важный белок, участвующий в устойчивости к лекарствам, росте клеток, апоптозе, возникновении опухолей, метастазировании и т. Д. [4, 5]. В этой модели PAMAM-конъюгированный козий антикроличий IgG действует как носитель и захват, аналогично бусинкам CBA (цитометрический набор шариков), позволяя детектировать низкомолекулярные антигены с помощью FCM. Козьи антимышиные IgG, конъюгированные с QD, действуют как флуоресцентный зонд. Если антигенами являются мембранные белки или внутриклеточные белки, мы можем использовать традиционный метод FCM для обнаружения антигенов. Нам нужно добавить только QD, а не фрагмент PAMAM. Для внутриклеточных белков и мембранных белков клетки можно рассматривать как мишени, которые могут быть непосредственно обнаружены методом FCM; им не нужен фрагмент PAMAM, чтобы образовать псевдоячейку. Поэтому мы можем разделить комплексы и использовать их по отдельности.

Представление того, как комплексы образуются и используются FCM для обнаружения HSP27. Во-первых, амино-ПАМАМ G5 должен реагировать с янтарным ангидридом с образованием нейтрального ПАМАМ

Результаты и обсуждение

Группа комплексов включает две части:часть ПАМАМ и часть КТ. Часть PAMAM представляет собой конъюгированный с PAMAM козий антикроличий IgG. Мы использовали дендримеры PAMAM пятого поколения с концевыми аминогруппами (G5 PAMAM) в качестве стабилизатора поверхности для обеспечения характеристик растворимости, идеальных для водных сред, но этот дендример имеет сильный положительный заряд, который вреден для связывания антител. Чтобы нейтрализовать положительный заряд, мы растворили ПАМАМ в ДМСО и добавили янтарный ангидрид (дигидро-2,5-дикетотетрагидрофуран) для нейтрализации аминогруппы ПАМАМ. Аминогруппа в PAMAM реагирует с янтарным ангидридом с образованием амидных связей [6,7,8,9,10]. После реакции продукт диализовали, лиофилизировали, взвешивали и повторно растворяли, продукция почти нейтральна, и мы назвали продукт «N-PAMAM», который способен конъюгировать с козьим анти-кроличьим IgG. PAMAM, особенно G5 PAMAM, содержит большое количество полостей, и IgG может быть инкапсулирован в пустотах G5 PAMAM [11]. Козий антикроличий IgG сначала растворяли в буфере MES (0,1 моль / л, pH 6,0), затем добавляли EDC и сульфо-NHS ​​(в молярном соотношении 1:1) и смесь инкубировали в течение 15 мин. Наконец, добавляли N-PAMAM (нейтральный PAMAM) с последующей инкубацией при 4 ° C на шейкере в течение ночи. Этот полимер самособирается в водном растворе с образованием полимерных мицелл, которые инкапсулируют нерастворимых в других случаях низкомолекулярных гостей [12]; после реакции требовался диализ для удаления непрореагировавших материалов. Затем продукцию лиофилизировали, взвешивали и повторно растворяли в консервирующем буфере, и, наконец, получали конъюгированный с N-PAMAM козий антикроличий IgG.

Спектры флуоресценции и УФ-видимого излучения N-PAMAM-IgG (козий антикроличий) в MES показаны на рис. 1. По сравнению с N-PAMAM (нейтральный PAMAM) и IgG пик флуоресценции N-PAMAM-IgG была самой низкой интенсивности. УФ-видимый спектр показывает, что по сравнению с IgG, буфером MES, PAMAM и N-PAMAM только N-PAMAM-IgG имеет пик поглощения на длине волны 200 нм. Независимо от спектра флуоресценции или УФ-видимого спектра, N-PAMAM-IgG демонстрирует различные характеристики по сравнению с N-PAMAM и IgG, что косвенно доказывает, что N-PAMAM и IgG были объединены, а не просто смешаны. Для определения активности антител к N-PAMAM-IgG был проведен ELISA. Как показано на рис. 2, устойчивость к антителам IgG (козьи антикроличьи) не терялась при связывании с N-PAMAM.

а Спектры флуоресценции PAMAM-IgG (козий антикроличий) в MES. Длина волны возбуждения 548 нм. б УФ-видимые спектры PAMAM-IgG (козьи антикроличьи) в MES и спектры излучения в диапазоне длин волн

Метод ELISA для определения устойчивости к антителам N-PAMAM-IgG (козьи антикроличьи). N-PAMAM-IgG использовали в качестве антигена и разводили до различных концентраций. Кроличий IgG-HRP использовали в качестве зонда антител для определения устойчивости к N-PAMAM-IgG. Измерение оптической плотности проводилось при длине волны 450 нм

Часть QD представляет собой конъюгированный с QD козий антимышиный IgG. КТ, конъюгированные с антителами, обычно образуются в результате реакций перекрестного связывания, в которых молекулы антител связываются с функциональными группами, такими как карбоксильные группы или аминогруппы на поверхности КТ [13, 14]. В этом исследовании мы использовали водорастворимые квантовые точки CdSe / ZnS ядро ​​/ оболочка, стабилизированные карбоксильными лигандами, и реакцию карбодиимидного сочетания с использованием EDC (1-этил-3- (3-диметиламинопропил) -карбодиимида гидрохлорид). Этот метод является одним из самых популярных методов конъюгирования антител с поверхностью КТ [15,16,17]. Мицеллы CdSe / ZnS QD сначала инкубировали в присутствии EDC и сульфо-NHS ​​в боратном буфере (5 мМ BS, pH 7,2). Затем добавляли козий антимышиный IgG и смесь инкубировали при 4 ° C на шейкере в течение ночи в темноте. Наконец, добавляли 10% БСА (бычий сывороточный альбумин) для блокирования непрореагировавших квантовых точек, и продукцию очищали путем последовательного центрифугирования и повторного растворения для удаления непрореагировавших материалов. Активность антител к QD-конъюгированным IgG (козьи антимышиные) может сохраняться в течение 3 месяцев после хранения при 4 ° C в темноте.

Размер частиц QDs-IgG (козьи антимышиные) и QD в консервирующем буфере (2,5 мМ BS, pH 8,0, 0,1% BSA) показан на фиг. 3a. После реакции сочетания диаметр продуктов, очевидно, увеличился, и продукты имели хорошую гомогенность и стабильность. Эти характеристики являются ключом к их использованию в качестве детектора. Спектры флуоресценции QDs-IgG и QD показаны на фиг. 3b, и, как показано на фиг. 3a, увеличенный диаметр продукции показывает, что IgG были объединены с QD, но пик эмиссии флуоресценции QDs-IgG был таким же. как квантовые точки. Этот результат означает, что связывание IgG и QD не изменило оптических характеристик QD, что полезно для их применения в иммуноанализах. Чтобы определить активность антител QDs-IgG, мы использовали метод ELISA с мембраной PVDF. Мышиные антитела против AKT разводили до концентраций 1 мкг / мл, 10 мкг / мл, 100 мкг / мл и 200 мкг / мл, и четыре антигена градиента концентрации гибридизировали с QDs-IgG (козьи антимышиные). при той же концентрации 0,1 мг / мл. После гибридизации в течение 40 минут при 37 ° C в темноте мембрану из PVDF промывали PBST (pH 6,0, 0,1% Tween 20) 3 раза и мембрану из PVDF облучали УФ-светом. Интенсивность флуоресценции показана на рис. 3c, интенсивность флуоресценции увеличивается с увеличением концентрации антигена, что указывает на то, что QDs-IgG обладает высокой активностью антител.

а Распределение гидродинамического диаметра QD и QD-конъюгированного IgG (козий антимышиный). ( а ) Диаметров КТ и ( b ) QD-конъюгированный IgG (козий антимышиный). Средний диаметр QD составляет 64,87 нм, а QDs-IgG - 211,4 нм, обнаруженный методом DLS. б Спектры флуоресценции QDs-IgG (козьи антимышиные), QD и консервирующего буфера (2,5 мМ BS, pH 8,0, 0,1% BSA). Пик флуоресценции QDs-IgG был таким же, как и пик флуоресценции QD, что указывает на то, что связывание IgG с QD не изменило оптических характеристик QD. c Метод ELISA для определения устойчивости к антителам QDs-IgG (козьи антимышиные), мембрану PVDF оценивали с помощью УФ

В этом разделе рассказывается, как использовать эту группу комплексов в FCM. Как упоминалось выше, мы можем обнаруживать многие типы антигенов, такие как небольшие белки, вирусы и цитокины [18], и мы использовали белок HSP27 в качестве примера, теперь давайте подробно рассмотрим процесс. HSP27 расположен в цитоплазме и в больших количествах секретируется опухолевыми клетками, особенно при раке легких, раке поджелудочной железы, эпителиальном раке мочевыводящих путей, раке почек, раке груди и раке кожи меланоме. Так как небольшая часть HSP27 секретируется внеклеточными тканями, нам необходимо лизировать клетку, чтобы извлечь белок. В этом эксперименте мы выбрали две клеточные линии, MCF-7 (клетки рака груди человека) в качестве тестовой группы и L02 (нормальные клетки печени человека) в качестве контрольной группы. Клетки лизировали для извлечения внутриклеточных белков. Все белки собирали, затем добавляли кроличьи анти-HSP27 и мышиные анти-HSP27 в соответствии с концентрацией белка с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 50 минут. Затем к смеси добавляли N-PAMAM-IgG, смесь инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин, а затем делили на две равные группы:тестовую группу и группу PAMAM. Наконец, к тестируемой группе добавляли QDs-IgG и инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут в темноте. На рис. 4 показан флуоресцентный анализ двух групп клеток с помощью проточной цитометрии. Интенсивность флуоресценции тестовой кривой была намного выше, чем у кривой PAMAM в группе MCF-7, в то время как в группе L02 две кривые почти перекрывались. Когда HSP27 присутствует в клеточных экстрактах, N-PAMAM-IgG и QDs-IgG будут косвенно связываться вместе с образованием сэндвич-комбинации в присутствии кроличьих анти-HSP27 и мышиных анти-HSP27. Если HSP27 не существует, только небольшое количество QDs-IgG будет связываться с N-PAMAM-IgG путем неспецифической адсорбции. Следовательно, если интенсивность флуоресценции тестовой кривой выше, чем у контрольной кривой PAMAM, в образце содержится HSP27. На рисунке 4 показано, что клетки MCF-7 секретировали больше белка HSP27, чем клетки L02.

Флуоресцентный анализ HSP27 методом проточной цитометрии. а L02 клетки. б Клетки MCF-7. Испытуемую группу инкубировали с N-PAMAM-IgG и QDs-IgG, группу PAMAM в качестве контроля, которую инкубировали только с N-PAMAM-IgG, чтобы сформировать псевдоклетку для белка микромолекул, обнаруженного с помощью FCM. Когда две кривые почти перекрываются, можно определить, что в образце нет HSP27; поэтому, независимо от того, добавлены ли QDs-IgG или нет, интенсивность флуоресценции не изменится

Как упоминалось выше, эти комплексы могут обнаруживать секретируемые внутриклеточные белки с помощью FCM; в принципе, эти комплексы можно применять к любому виду антигена. Кроме того, две части комбинации можно использовать отдельно. Если антиген, который мы хотим обнаружить, находится в клетке или на поверхности клетки, мы можем использовать только часть квантовых точек. Например, β-актин является одним из основных компонентов цитоскелета, расположенного в клетках, и широко присутствует в эукариотических клетках. На рис. 5а показан флуоресцентный анализ только использованной части QD для β-актина в клетках HeLa с помощью FCM. Клетки HeLa промывали и обрабатывали метанолом для усиления проникновения через клеточную мембрану, а затем делили на две равные группы. Группу β-актина инкубировали с мышиным анти-β-актином при 37 ° C в течение 30 мин, а контрольную группу инкубировали с BSA. После промывания PBS обе группы инкубировали с QDs-IgG (козьи антимышиные) при 37 ° C в течение 30 минут. После двукратной промывки PBS обе группы были обнаружены с помощью FCM. Интенсивность флуоресценции кривой β-актина была намного выше, чем у контрольной кривой, что указывает на то, что клетки HeLa содержат белок β-актина.

а Флуоресцентный анализ β-актина в клетках HeLa. Группу β-актина инкубировали с мышиным анти-β-актином и QDs-IgG (козий антимышиный), а контрольную группу инкубировали с BSA и QDs-IgG. Контрольная группа может позволить исключить фоновую флуоресценцию, вызванную неспецифической адсорбцией QDs-IgG. б Изображения клеток HeLa под УФ-видимым излучением, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа. DAPI окрашивал ядра клеток и излучал синюю флуоресценцию; QDs-IgG косвенно объединяется с β-актином и излучает красную флуоресценцию. Масштабная линейка 20 мкм

Кроме того, эти комплексы можно применять и для МКК. Однако для ICC необходимо, чтобы антиген-мишень располагался в клетке или на поверхности клетки и присутствовал в больших количествах [19]; в противном случае экспериментальную цель будет сложно отличить от фона. Мы взяли, например, белок β-актин, высевали клетки HeLa в 10-сантиметровую клеточную пластину и поместили в нее покровное стекло микроскопа, используя метанол для иммобилизации клеток. Затем клетки инкубировали с мышиным анти-β-актином (PBS, 1% BSA) при 37 ° C в течение 1 ч, дважды промывали PBST и инкубировали с QDs-IgG (козий антимышиный) при 37 ° C в темно на 1 ч. После двукратной промывки PBST и окрашивания ядра клетки DAPI флуоресценцию регистрировали с помощью флуоресцентного микроскопа [20, 21]. На рис. 5b показаны изображения клеток HeLa, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа. Преимущество КТ как флуоресцентного красителя состоит в том, что сигнал КТ и сигнал DAPI можно одновременно наблюдать при облучении ультрафиолетового канала; следовательно, по ядру мишень, очевидно, может быть локализована. В этом эксперименте β-актин представляет собой белки цитоскелета вокруг ядра клетки, и его, очевидно, можно наблюдать.

Выводы

В заключение мы продемонстрировали применение комплексов, используемых в клинических иммуноанализах, таких как FCM и ICC. Группа комплексов включает конъюгированный с PAMAM козий анти-кроличий IgG и QD-конъюгированный козий антимышиный IgG. Когда добавляли кроличий антиген и мышиный антиантиген, был обнаружен соответствующий антиген. Эти комплексы выгодны благодаря их широкому спектру, высокой биосовместимости, высокой светостойкости и низкой биологической токсичности. Этот комплекс является универсальной моделью, требующей замены только соответствующих первичных антител. В этой статье мы использовали комплексы для обнаружения HSP27 и β-актина, но теоретически этот процесс можно применить к любому типу антигена. Более того, мы можем выбрать метод обнаружения в соответствии с характеристиками антигенов, а также можем разделить комплексы и использовать их индивидуально в соответствии с реальными потребностями. Этот метод также позволяет обнаруживать небольшие молекулы, такие как небольшие белки и вирусы, с помощью проточной цитометрии. Мы полагаем, что при соответствующем улучшении его также можно будет применить к другим методам, таким как иммунофлюресценция (IF), вестерн-блоттинг (WB) и иммунохроматографическая полоска с боковым потоком (LCS).

Методы / экспериментальные

Материалы

Квантовые точки CdSe / ZnS (водорастворимые КТ с карбоксильными группами, номер cas N / A) были приобретены в NEPQD, Китай. ПАМАМ (пятое поколение с концевыми аминогруппами, лот № CYD-150A) был приобретен у CYD, Китай. Козий анти-кроличий IgG (ab6702) и мышиный анти-β-актин (ab8226) были приобретены в Abcam, UK; мышиные анти-HSP27 (BF0624) и кроличьи анти-HSP27 (AF6082) были приобретены в Affinity, США; козий антимышиный IgG (bs0296G) был приобретен в Bioss, Китай; EDC и сульфо-NHS ​​были приобретены у Thermo Fisher; DMEM и фетальная бычья сыворотка были приобретены у Gibco; и мембраны из ПВДФ (0,2 мкм) были приобретены у Millipore. Все остальные химические реагенты были чистыми для аналитических реагентов.

Приготовление N-PAMAM-IgG (козий антикроличий)

1. а)

   Получение N-PAMAM (нейтральный PAMAM):PAMAM (G5 с амино-концевыми группами, средняя молекулярная масса 28826) (60 мг, 2,081 мМ) растворяли в ДМСО (2 мл) и янтарном ангидриде (дигидро-2,5-дикетотетрагидрофуран) (0,266 г, 2,66 мМ) для нейтрализации аминогрупп. Поскольку один моль макромолекул G5 PAMAM имеет 128 моль аминогрупп, 60 мг PAMAM содержит 0,266 мМ аминогрупп, а молярное соотношение аминогрупп PAMAM и янтарного ангидрида составляет приблизительно 1:10. Затем смесь перемешивали в шейкере со скоростью 100 об / мин в течение 4 часов, после чего раствор подвергали диализу через диализную мембрану 3500 MWCO в течение 24 часов, и после лиофилизации получали N-PAMAM.

2. б)

   Приготовление N-PAMAM-IgG (козий антикроличий):составленный буфер MES (100 мМ, pH 6,0), затем 100 мкл буфера MES в пробирку, добавление 20 мкМ EDC и 20 мкМ сульфо-NHS, затем перемешивание с использованием вихрь на низкой скорости. Добавьте 35,7 мкл IgG (pH 0,5 мкМ) и встряхивайте на вортексе, после этого добавьте 19 мкг N-PAMAM и инкубируйте при 4 ° C в течение ночи, наконец, раствор будет диализован через диализную мембрану 3500MWCO и 8000MWCO в течение 3 дней. после лиофилизации будет увеличиваться N-PAMAM-IgG.

Приготовление QDs-IgG (козьи антимышиные)

1. а)

   Состав буфера BS:

1. 1.

   Приготовьте буфер буры (50 мМ):взвесьте 19,07 г буры и растворите в 1 л сверхчистой воды.

2. 2.

   Приготовьте буфер борной кислоты (50 мМ):взвесьте 3,09 г борной кислоты и растворите в 1 л сверхчистой воды.

3. 3.

   Буфер BS с pH 8,0 и буфер BS с pH 7,2 были приготовлены путем смешивания двух вышеуказанных растворов.

4. 4.

   Промывочный буфер, также используемый в качестве консервирующего буфера, был приготовлен разбавлением BS-буфера с pH 8,0 до концентрации 5 мМ и добавлением 0,1% твина 20.

5. 5.

   Активационный раствор был приготовлен путем разбавления буфера BS с pH 7,2 до концентрации 5 мМ и добавления 0,1% твина 20.

6. 6.

   Буфер EDC получали растворением 0,27 г EDC в 5 мл активационного раствора, а буфер сульфо-NHS ​​получали растворением 0,378 г сульфо-NHS ​​в 5 мл раствора активации.

1. б)

   Приготовление QDs-IgG (козьи антимышиные):

Сначала 450 мкл КТ (CdSe / ZnS, 5 мг / мл) растворяли в 2,25 мл активационного раствора, затем добавляли 150 мкл буфера EDC и 150 мкл буфера сульфо-NHS, и раствор обрабатывали ультразвуком на льду в течение 5 дней. мин. Во-вторых, раствор центрифугировали при 12000 об / мин в течение 5 минут для удаления супернатанта, и осадок растворяли в 1,2 мл промывочного буфера. После 30 мин ультразвукового перемешивания добавляли 100 мкг антитела IgG, затем раствор инкубировали в течение ночи на шейкере при температуре 4 ° C. В-третьих, добавляли 150 мкл 10% BSA с последующей инкубацией при 30 ° C в течение 30 минут и центрифугированием при 12000 об / мин в течение 2 минут для удаления супернатанта. Осадок повторно растворяли в 1 мл промывочного буфера, затем центрифугировали при 12000 об / мин в течение 2 минут, этот этап повторяли и, наконец, осадок растворяли в 1 мл консервирующего буфера. В конце был добавлен 10% BSA; смесь перемешивали при полном ультразвуковом шоковом перемешивании и центрифугировали при 820 г / мин для удаления осадка с супернатантом, содержащим QDs-IgG. QDs-IgG следует хранить при температуре 4 ° C в темноте в течение 3 месяцев. Следует отметить, что образцы можно хранить только при 4 ° C, и их нельзя замораживать даже с глицерином; в противном случае это приведет к тому, что большое количество квантовых точек соберется в кластеры, образуя осадки, которые невозможно смыть с помощью PBST, что приведет к серьезной фоновой флуоресценции.

Анализ FCM на белок HSP27

HSP27 находится в цитоплазме и в больших количествах секретируется опухолевыми клетками. В этом эксперименте мы выбрали две клеточные линии, MCF-7 (клетки рака груди человека) в качестве тестовой группы и L02 (нормальные клетки печени человека) в качестве контрольной группы. Две группы клеток высевали в 10-сантиметровую культуральную чашку и инкубировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) при 37 ° C. Когда клетки покрывали 80% планшета, клетки переваривали трипсином и дважды промывали PBS. Затем клетки ресуспендировали в 1 мл PBS. Подсчитывали клетки с помощью гемоцитометра, добавляли буфер для лизиса клеток T-PER в соответствии с концентрацией клеток, после чего внутриклеточный белок экстрагировали из клеточного лизата. Затем клеточный лизат центрифугировали при 14000 об / мин в течение 10 минут для сбора супернатанта, и концентрацию белка измеряли методом BCA, в соответствии с концентрацией белка добавляли кроличьи анти-HSP27 и мышиные анти-HSP27 и инкубировали при 37 ° C в течение 50 мин. В этом эксперименте концентрация белка L02 составляла приблизительно 0,2 мг / мл, а MCF-7 - 0,25 мг / мл, а объем обоих составлял 500 мкл. Два антитела, кроличьи анти-HSP27 и мышиные анти-HSP27, были добавлены к клеткам (0,625 мкл к MCF-7 и 0,5 мкл к клеткам L02).

Затем к смесям добавляли 1 мг / мл N-PAMAM-IgG с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 30 минут; 6,25 мкл добавляли к группе MCF-7 и 5 мкл добавляли к группе L02. После инкубации продукция была разделена на две равные группы:тестовую группу и группу PAMAM. Наконец, к тестовой группе добавляли QDs-IgG, которую инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут в темноте. Затем две группы клеток были проанализированы методом проточной цитометрии.

Анализ FCM на белок β-актина

β-актин - это внутриклеточный белок, который является одним из основных компонентов цитоскелета и широко присутствует в эукариотических клетках. Клетки HeLa высевали в 10-сантиметровую культуральную чашку и инкубировали в DMEM с 10% FBS при 37 ° C в течение 2 дней, затем супернатант удаляли и клетки дважды промывали PBS. Клетки переваривали трипсином, после чего клетки центрифугировали при 800 об / мин в течение 3 минут для удаления супернатанта и добавляли 1 мл холодного метанола для ресуспендирования клеток. Через 5 минут клетки центрифугировали при 800 об / мин в течение 3 минут для удаления супернатанта, и клетки ресуспендировали в 1 мл PBS. Этот шаг был повторен, и клетки HeLa были разделены на две равные группы. Испытуемую группу инкубировали с мышиным анти-β-актином при 37 ° C в течение 30 минут, а контрольную группу инкубировали с BSA (бычий сывороточный альбумин). В этом эксперименте мышиный анти-β-актин растворяли в PBST (1% BSA, 5 мкг / мл), и 100 мкл IgG добавляли к 300 мкл тестируемой группы, и эквивалентное количество BSA добавляли к контрольная группа. Через полчаса инкубации обе группы инкубировали с QDs-IgG (козьи антимышиные) при 37 ° C в течение 30 минут. После двукратной промывки PBS обе группы были оценены с помощью FCM.

Анализ ICC для белка β-актина

Клетки HeLa высевали в 10-сантиметровую культуральную чашку и инкубировали в среде DMEM с 10% FBS при 37 ° C в течение 1 дня. Затем в чашку для клеток помещали несколько стерилизованных покровных стекол, и клетки дополнительно культивировали в течение 2 дней. Покровные стекла удаляли и дважды промывали PBS, затем покровные стекла инкубировали в 400 мкл метанола в течение 20 минут при комнатной температуре. Покровные стекла промывали 3 раза PBS. Затем готовили блокирующий буфер с PBST (0,1% Tween 20), 22,52 мг / мл глицина и 10% BSA. Покровное стекло помещали в блокирующий буфер и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем блокирующий буфер удаляли, и покровное стекло инкубировали с мышиным анти-β-актином (PBS, 1% BSA) при 37 ° C в течение 1 ч, дважды промывали PBST и инкубировали с QDs-IgG (козий анти- мышь) при 37 ° C в течение 1 ч в темноте. После двукратной промывки PBST и окрашивания ядра клетки DAPI в течение 2 минут покровное стекло промывали один раз PBS и один раз водой для визуализации под флуоресцентным микроскопом.

Доступность данных и материалов

Все данные полностью доступны без ограничений.

Сокращения

CBA:

Цитометрический набор шариков

DMEM:

Модифицированный носитель Орла, созданный Дульбекко

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FCM:

Проточная цитометрия

ICC:

Иммуноцитохимия

N-PAMAM:

Нейтральный ПАМАМ

ПАМАМ:

Дендример полиамидоамина

QD:

Квантовые точки