Обнаружение микроРНК-335-5p на поверхности встречно-штыревого электрода для определения степени тяжести аневризм брюшной аорты

Введение

Аневризмы брюшной аорты (АБА) представляют собой опасные для жизни заболевания, которые определяются как брюшная аорта с диаметром> 3 см или больше, чем обычно [1, 2]. Это состояние возникает при атеросклерозе или нарастании бляшек, что ослабляет стенки брюшной аорты и приводит к выпуклости наружу, похожей на баллон. Со временем стенка артерии расширяется, и эта ситуация сравнима со старением садовых шлангов. Давление крови, проходящей через аорту, заставляет эту ослабленную область выпирать наружу, что называется аневризмой. ААА образуется, когда ослабленная часть аорты приводит к осложнениям [3,4,5,6]. AAA может привести к смерти в результате разрыва небольших аневризм. В настоящее время для диагностики этого состояния используются медицинские осмотры, компьютерные ангиограммы осевой томографии, магнитно-резонансная томография и ультразвуковая сонография [7,8,9,10]. Однако не существует методов обнаружения AAA, которая обычно выявляется при анализе других проблем со здоровьем. Эта ситуация приводит к задержке определения AAA, что в конечном итоге вызывает ненужные проблемы со здоровьем. Чтобы преодолеть эту проблему, исследователям необходимо разработать методы раннего обнаружения, и одна из возможных стратегий - это разработка сенсорной системы.

Раннее, быстрое и точное количественное выявление болезни является жизненно важной целью для клинической диагностики. Существующие платформы для биосенсинга удовлетворяют ряду требований и требуют надлежащих лабораторных настроек и обучения. Таким образом, большинство методов непереносимы, что необходимо для идеального обнаружения в месте оказания медицинской помощи [11, 12]. Кроме того, чтобы помочь врачам в принятии точных и быстрых решений, крайне желателен анализ изменений уровней биомаркеров. Циркулирующие биомаркеры, которые экспрессируются в определенных областях, должны быть дополнительно исследованы для диагностики AAA и отслеживания прогресса лечения. Выявление этих типов циркулирующих биомаркеров поможет диагностировать заболевание и провести последующее наблюдение за пациентом после лечения. Чтобы удовлетворить эти потребности, в этом исследовании предлагается создать сенсоры соответствующих биомаркеров для AAA. Сенсор (встречно-штыревой электрод), предложенный в этом исследовании, обладает потенциалом для высокопроизводительного анализа с широким спектром биомаркеров. Это диэлектродная система с чередующимися зазорами и пальцами, которые работают при диэлектрических измерениях [13,14,15].

Биомаркерами могут быть любые биомолекулы, в том числе ДНК, РНК, белки, углеводы, липиды и их модифицированные формы [16, 17]. Кроме того, исследователи предположили, что различные биомаркеры, такие как некодирующие РНК, экспрессируются в клеточной системе, но не транслируются в белки [18]. Некодирующие РНК обычно не транслируются в белки и обычно имеют короткие последовательности [18,19,20,21]. Сообщалось о различных классах некодирующих РНК, таких как микроРНК (миРНК), рибосомные РНК, транспортные РНК, малые ядрышковые РНК, малые ядерные РНК, теломеразные РНК, мяРНК, Xist РНК, сводные РНК и 7SL РНК. miRNAs функционируют в основном в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов и часто приводят к молчанию генов [22]. Недавно исследователи описали важность miRNAs для предсказания AAA и сообщили о снижении экспрессии miRNA-335-5p у пациентов с AAA [23]. Было доказано, что сочетание клинических факторов и экспрессии микроРНК резко улучшило прогнозирование заболеваний и продемонстрировало повышенную точность [24]. Исследователи специально сосредоточили внимание на miRNA-335-5p, диапазон которой у людей с быстрорастущим AAA минимален [2, 23]. Кроме того, снижение уровней miRNA-335-5p повысило уверенность в обнаружении роста AAA. Другими словами, отрицательный выход (более высокие уровни) miR-335-5p указывает на тяжесть AAA и сводит к минимуму трудоемкий скрининг. Этот вывод был продемонстрирован Wanhainen et al. [23] и показали, что miRNA являются полезными биомаркерами для скрининга AAA и устранения риска быстрорастущего AAA. Текущее исследование демонстрирует применение обнаружения miRNA-335-5p датчиком с встречно-штыревым электродом (IDE) для определения степени тяжести AAA у пораженных лиц.

Материалы и методы

Реагенты и биомолекулы

Стрептавидин, 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI) и раствор фосфатного буфера (PBS) были приобретены у Sigma-Aldrich, США. Этаноламин был приобретен в Fisher Scientific, UK. Все олигонуклеотиды были синтезированы коммерчески из Apical Scientific Sdn. Bhd., Малайзия.

Создание узора на маске Chrome

Изначально рисунок диэлектрического датчика создавался с помощью программы AutoCAD. Требуемые размеры:длина 7500 мкм, ширина 4100 мкм, 20 пар пальцевых зазоров, размер зазора 85 мкм, размер электрода 100 мкм, толщина электрода 40 нм и длина пальца 4000 мкм. Шаблон был напечатан на пустой фотошаблоне и наклеен на поверхность хромового стекла. Это хромовое стекло было зафиксировано под системой УФ-облучения для процедуры переноса рисунка. Подложку из диоксида кремния, на которую нанесена тонкая алюминиевая пленка, помещали в противоположном направлении от хромового стекла и экспонировали УФ-светом в течение 10 с. Рисунок был перенесен с последующим проявлением с использованием проявителя резиста.

Изготовление встречно-штыревого электрода

Поверхностный электрод был изготовлен с помощью обычного процесса изготовления микроэлектроники для изготовления поверхности следующим образом:(i) была подготовлена ​​4-дюймовая пластина с существующим естественным оксидом. (ii) Пластина была очищена с использованием травления с забуференным оксидом (БОЭ) и раствора пираньи для удаления естественного оксида и неорганических загрязнений. (iii) Слой оксида толщиной 2800 Å был выращен путем влажного термического окисления в течение часа при температуре 1000 ° C. (iv) Пластина с оксидным слоем была разделена на четыре части для лучшего обращения. (v) На металлический слой был нанесен слой l в качестве адгезионного слоя для проводящего слоя. Слой алюминия (40 нм) был получен длиной 3 см и диаметром 0,5 мм с помощью метода физического осаждения на основе термического испарителя, (vi) слой положительного фоторезиста представлял собой центрифужное покрытие на подложке, (vii) пластина была мягкое выпекание при 90 ° C в течение 60 с. (viii) Пластина была совмещена с хромовой маской и экспонирована УФ-светом в течение 10 с. (ix) Пластина была промыта в растворе проявителя RD6 в течение 15 с для удаления неэкспонированной области, в результате чего получился рисунок встречно-штыревого электрода (IDE) с оксидом. (x) Вафля была подвергнута твердой выпечке при 90 ° C в течение 120 с. (xi) Пластина была протравлена ​​с использованием царской водки для удаления открытых участков обоих слоев. (xii) Был получен поверхностный узор, и оставшийся фоторезист был смыт ацетоном. Затем был проведен анализ 3D нанопрофилометрии (Hawk 3D-profilometry, США) для получения четкого изображения зазоров между электродами. Измерения тока (A) были выполнены с помощью прибора Keithley 6487 с линейной разверткой от 0 до 2 В с шагом 0,1 В (при 20 с).

Химическая функционализация поверхности:стратегия четырехвалентного стрептавидина и биотина

Для химической функционализации поверхности поверхность диоксида кремния сначала тщательно промывали 1 М гидроксидом калия (pH 9,0) для активации поверхности. Эта поверхность была дополнительно модифицирована CDI (0,5 M) с инкубационным периодом 1 час для реакции со 100 нМ стрептавидином (в течение 1 часа), разбавленным из исходного раствора в 10 мМ фосфатно-солевом буфере (PBS; pH 7,4). После этого этапа непрореагировавшие пространства блокировали 1 М этаноламином (в течение 1 ч). Затем четырехвалентный стрептавидин подвергали взаимодействию с 1 мкМ биотинилированного зонда miRNA-335-5p (в течение 10 мин) при комнатной температуре. По завершении каждой модификации поверхность тщательно промывалась PBS, если не указано иное.

Разработка последовательностей зонда и мишени из miRNA-335-5p

Полноразмерная miRNA-335-5p (5'-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3 была собрана из банка данных MATO-3). Желаемой областью для этого исследования в качестве мишени является 5'-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3 '. Для захвата целевой области miRNA-335-5p зонд был сконструирован как 5'-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3 '. На 3'-конце биотин был помечен для взаимодействия со стрептавидином, иммобилизованным на сенсорной поверхности. Вторичная структура полноразмерной miRNA-335-5p была предсказана онлайн-программой mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold).

Взаимодействия зонд-цель:последовательности miRNA-335-5p

После связывания биотинилированного зонда с поверхностью стрептавидина, как подробно описано выше, целевая последовательность miRNA-335-5p взаимодействовала (в течение 10 мин) при комнатной температуре от низких фемтомолярных до низких наномолярных концентраций. Эти концентрации варьировались от 1 фМ до 1 нМ при 10-кратных серийных разведениях в PBS. Крепления были протестированы независимо от более низких и более высоких концентраций, и после образования дуплекса поверхность была промыта 5-кратными объемами PBS и были проведены измерения.

Измерения ВА

Электрические характеристики были выполнены путем измерения ВАХ с использованием пикоамперметра Keithley 6487 с источником напряжения / тока. Измерения были записаны при вышеупомянутых вольтах на голой поверхности с последующей химической модификацией каждой поверхности. Аналогичным образом, для интерактивного анализа между зондом и мишенью miRNA-335-5p при каждой концентрации измерение выполняли после стадии промывки с 10 реакционными объемами. Все модификации, взаимодействия и измерения проводились во влажных условиях, если не указано иное.

Результаты и обсуждение

Изготовление датчика IDE и анализ поверхности

В текущем исследовании miRNA-335-5p использовалась в качестве инструмента для выяснения степени тяжести AAA с помощью интерактивного анализа на датчике с встречно-штыревым электродом (IDE) (рис. 1). Для интерактивного анализа с зондом и мишенью, созданной из полной длины miRNA-335-5p, поверхность IDE была разработана и изготовлена ​​с использованием обычных фотолитографических методов. Поэтапные модификации поверхности проводились и измерялись амперметром (рис. 2б, в). Выравнивание маски, предназначенной для изготовления IDE, и однородность были подтверждены анализом 3D нанопрофилометрии с высоким разрешением. Это наблюдение подтвердило, что изготовление и расстояние между каждым пальцем были хорошо выровнены (рис. 2d). IDE имеют размер электрода ~ 100 мкм с интервалом ~ 85 мкм, и образуется большая интеркалированная сеть с миллионами биомаркеров, включенных последовательно / параллельно. Чтобы гарантировать успех изготовленных IDE, мы использовали различные голые устройства для определения воспроизводимости в диэлектрической системе. Эта система измеряет колебания молекул между диэлектродами, вызванные дипольным моментом (рис. 2в). Эта диэлектрическая ИДЭ - хорошо зарекомендовавшая себя система, которая широко используется для различных биомолекулярных и химических анализов [15, 25, 26, 27, 28]. В этом исследовании все химические модификации поверхности и интерактивные анализы были измерены в режиме I-V.

Представление обнаружения miRNA-335-5p на IDE. Разработанный зонд и цель показаны вместе с образованием дуплекса на поверхности IDE

Измерения поверхности на IDE. а Шаги измерения. б Режим измерения. Показаны шаблон IDE и система подключения. Также отображается измерение диэлектрической проницаемости. c Поверхностный механизм во время измерения. Показан дипольный момент. г Трехмерный профиль профилометрии изготовленной IDE

Поверхностная молекулярная сборка высокой плотности:стратегия стрептавидин-биотин

Было показано, что прикрепление молекул с высокой плотностью к сенсорной поверхности или биочипам имеет решающее значение и сильно зависит от функционализации поверхности [29, 30]. Это исследование было направлено на определение подходящей поверхности, необходимой для большого количества молекулярных аккомодаций, что является обязательным для экспрессии генов, открытия и молекулярного анализа. Для этих потенциальных приложений создание поверхностей аналитической системы требует правильного связывания молекул, чтобы иммобилизовать их в соответствующих форматах. Поверхности этих материалов были изучены для изучения механизма взаимодействия поверхностей, поскольку они дешевы и обеспечивают различную степень плотности упаковки, морфологии и толщины. Это открытие облегчит правильное прикрепление молекул и предотвратит потерю биомолекулярной активности. Кроме того, правильная ориентация биомолекулярной иммобилизации сохраняется с надлежащим вторичным структурным подтверждением.

Чтобы добиться высокой плотности молекул на поверхности, мы сначала тщательно промыли поверхность кремнезема раствором щелочи и модифицировали ее CDI. Чтобы зафиксировать высокие уровни зондов биотинилирования на поверхности CDI, мы иммобилизовали зонд стрептавидином. Стрептавидин - четырехвалентный белок с четырьмя сайтами связывания биотина, который в биологических науках считается молекулой с высоким сродством [31, 32]. Поверхность IDE имела текущий уровень 2,08E-10 A, а после присоединения CDI он был увеличен до 9,2E-06 A. Это открытие ясно указывает на то, что поверхность IDE, модифицированная CDI, подходит для наших анализов. Когда был добавлен стрептавидин, текущий уровень был дополнительно увеличен до 2,36E-05 A. Используя эту стратегию, мы иммобилизовали большее количество биотинилированных зондов, сконструированных из полноразмерной miRNA-335-5p на поверхности IDE (рис. 3a). Взаимодействие с биотином осуществлялось после этапа блокирования на поверхности IDE, чтобы замаскировать непрореагировавшие области. При каждой модификации поверхности определялись изменения тока (рис. 3б). Как показано на рис. 3c, после добавления этаноламина изменения тока составили 2,53E-05 A, а когда был добавлен 1 нМ биотинилированной последовательности захвата, уровень тока снизился до 1,29E-08 A. Это изменение в ток подтвердил иммобилизацию датчика захвата на чувствительной поверхности IDE. Как правило, одноцепочечный олигонуклеотид несет более отрицательный заряд с обнаженной 5-карбонизированной фосфатной основной цепью (зонд), тогда как чистый заряд этаноламина нейтрален, как заявляет поставщик. Эта большая разница в заряде привела к очевидному изменению измеренного тока, как показано на рис. 3c. Далее, этот параметр снова возвращался при образовании дуплекса с целевой цепью. Это открытие связано с уменьшением воздействия на фосфатный остов, а дополнительные положительные заряды происходят от азотистых оснований в цепи миРНК (рис. 4a).

а Предсказанная вторичная структура miRNA-335-5p. Полноразмерная miRNA-335-5p отображается с участками стебля и петли. Указывается выбранная целевая область для интерактивного анализа. б Измерения I-V на IDE для химических и биологических модификаций поверхности (черный кружок, пустой; красный кружок, CDI; темно-синий кружок, стрептавидин; зеленый кружок, этаноламин). На вставке к рисунку схематично изображена вставка. c I-V измерения на IDE для крепления зонда. (зеленый кружок - этаноламин; темно-красный кружок - зонд). Изображение для усложнения AAA показано на вставке к рисунку

Интерактивный анализ зонда и цели. а Взаимодействие более высоких доз зонда и miRNA-335-5p (мишень). (темно-красный круг - зонд; черный круг - цель). б Дозозависимый анализ miRNA-335-5p. Тестирование от нижнего фемтомолярного до нижнего наномолярного диапазона. (темно-красный кружок, зонд; оранжевый кружок, 1 фМ; синий кружок, 10 фМ; зеленый кружок, 100 фМ; фиолетовый кружок, 1 пМ; розовый кружок, 10 пМ; голубой кружок, 100 пМ; черный кружок, 1 нМ)

Дозозависимый интерактивный анализ в среде IDE

После прикрепления биотинилированного зонда к чувствительной поверхности целевой интерактивный анализ проводился с различными дозами. Эта проверка проводилась от низкого фемтомолярного до низкого наномолярного диапазона. Чтобы гарантировать этот диапазон, мы выполнили предварительный анализ с 1 нМ целевых последовательностей miRNA-335-5p. После добавления 1 нМ целевой последовательности miRNA-335-5p на поверхность, модифицированную захватывающим зондом, текущий уровень изменился с 1,29 E-08 A до 1,29E-07 A (рис. 4a); этот результат указывает на то, что гибридизация происходит между зондом захвата и целевой последовательностью. После этого подтверждения, чтобы определить предел обнаружения, мы титровали целевую последовательность от 1 фМ до 1 нМ, которая снижалась независимо на поверхностях, модифицированных зондом захвата. Текущие изменения были обнаружены до и после иммобилизации. Различия в токе для 1 фМ, 10 фМ, 100 фМ, 1 пМ, 10 пМ, 100 пМ и 1 нМ гибридизации составляли 2,87, 3,87, 5,04, 6,88, 8,59, 11,21 и 11,61E-08 А, соответственно. На основании полученных результатов были обнаружены четкие дозозависимые изменения тока во всех протестированных концентрациях целевой последовательности (рис. 4b).

Высокая аналитическая эффективность:чувствительность, специфичность и воспроизводимость

На основании приведенных выше результатов с приращениями, зависящими от концентрации, был проведен линейный регрессионный анализ. Чувствительность обнаружения оценивалась с помощью расчета 3σ, и она упала на уровне 1 фМ (рис. 5а, б). Концентрация была менее 1 фМ, показывая фоновый сигнал и более низкие значения. Кроме того, был проведен анализ специфичности, чтобы отличить последовательности-мишени от некомплементарных и одно- и трехкратно несовпадающих последовательностей. Было очевидно, что сконструированный зонд показал более сильную реакцию с идеальными комплементарными последовательностями miRNA-335-5p, чем с другими последовательностями (фиг. 6a). Последовательность с одним несовпадением приводит к более высокому отклику по току, чем некомплементарные и тройные несовпадающие последовательности из-за образования частичного дуплекса с помощью последовательности с одним несовпадением в последовательности зонда. Анализы воспроизводимости были выполнены со всеми химическими и биологическими модификациями на поверхности IDE в трех экземплярах, и данные были усреднены. Усредненные данные показывают, что не было значительных изменений, когда проводились разные эксперименты (рис. 6b). Кроме того, для поддержки производительности IDE было проведено сравнение характеристик доступных в настоящее время методов (таблица 1).

Дозозависимость. а Дозозависимое взаимодействие miRNA-335-5p с зондом. б Линейный регрессионный анализ с различными концентрациями miRNA-335-5p. LOD считался самой низкой концентрацией аналита на фоне фонового сигнала (S / N =3:1)

Высокопроизводительный анализ. а Анализ специфичности. Последовательности-мишени отличались от некомплементарных последовательностей, а также последовательностей с одним и тремя несовпадениями. б Тест воспроизводимости. Отображаются усредненные значения для трех экспериментов

Выводы

Разработка аналитического метода с использованием биологических биомаркеров помогает диагностировать АБА во время медицинских осмотров. В текущем исследовании была разработана опосредованная miRNA-335-5p детекция для прогнозирования тяжести AAA, поскольку было обнаружено, что miRNA-335-5p экспрессируется с AAA. Выходные данные сгенерированного обнаружения IDE отображаются от более низких до более высоких уровней обнаружения, чтобы облегчить прогнозирование серьезности AAA. Нижний уровень обнаружения составлял 1 фМ с высокой специфичностью и воспроизводимостью для высокопроизводительного анализа. Метод четырехвалентного стрептавидина-биотина, использованный в этом исследовании, дал хорошие результаты и может быть использован для других анализов биомаркеров.

Доступность данных и материалов

Все данные полностью доступны без ограничений.

Сокращения

AAA:

Аневризма брюшной аорты

CDI :

1,1'-Карбонилдиимидазол

PBS:

Фосфатный буферный раствор

IDE:

Встречно-штыревой электрод

UV:

Ультрафиолет