Комбинация ингибитора NQO1 и 5-фторурацила на основе наночастиц мезопористого кремнезема для мощного противоопухолевого эффекта против плоскоклеточного рака головы и шеи (HNSCC)

Введение

Плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC) - одна из самых смертоносных форм рака, и 90% его происхождения происходят из плоскоклеточных клеток [1]. HNSCC является высокоангиогенным по своей природе, и его сосудистая сеть экспрессирует различные цитокины, включая факторы роста фибробластов (FGF) и факторы роста эндотелия сосудов (VEGF), которые связаны с более высоким метастазированием и плохой выживаемостью [2]. Заболеваемость HNSCC в Китае занимает шестое место по смертности от рака:в 2015 году было зарегистрировано около 250 000 новых случаев и 77 500 случаев смерти. Общая 5-летняя выживаемость HNSCC очень низкая из-за таких факторов, как агрессивный характер, ранний рецидив, высокий уровень метастазов и высокий уровень смертности из-за плохого прогноза [3]. Основным вариантом лечения HNSCC является хирургическое вмешательство с последующей лучевой или химиотерапией. Точнее говоря, химиотерапия, если ее эффективно использовать на ранних или послеоперационных стадиях, будет противодействовать росту опухоли [4, 5]. Эффективное использование химиотерапии уничтожит раковые клетки в опухолевых тканях и подавит рецидив опухоли. Однако длительная химиотерапия на основе одного агента часто приводит к лекарственной устойчивости и снижению терапевтической эффективности [6]. Следовательно, необходимо использовать инновационные стратегии для улучшения выживаемости и качества жизни пациентов с HNSCC.

Некоторые противораковые агенты, используемые для лечения HNSCC, включают цисплатин, 5-фторурацил (5-FU), паклитаксел или доцетаксел. Среди всего прочего, 5-фторурацил (5-FU) используется в качестве терапии первой линии при HNSCC и другом лечении плоскоклеточного рака [7]. 5-ФУ представляет собой аналог пиримидина, который действует путем необратимого ингибирования тимидилатсинтазы в раковых клетках и тем самым подавляет репликацию ДНК, приводящую к гибели клеток [8]. Как и все противоопухолевые препараты, 5-ФУ оказывает неблагоприятное воздействие на системный кровоток и вызывает токсичность для нормальных тканей, в то время как сообщается, что комбинация 5-ФУ с вторичным агентом потенциально может уменьшить побочные эффекты и улучшить общая терапевтическая эффективность лечения рака [9].

НАД (Ф) Н:хинон оксидоредуктаза 1 (NQO1) представляет собой флавопротеин, уровень которого в опухолевых тканях повышен в 100-200 раз по сравнению с нормальными тканями [10]. Двухэлектронная оксидоредуктаза представляет собой индуцибельный детоксифицирующий фермент фазы II, способный детоксифицировать хиноны путем образования стабильных гидрохинонов [11]. Показано, что NQO1 экспрессируется на низком базальном уровне в нормальных тканях человека, где он защищает клетки от окислительно-восстановительного цикла и окислительного стресса и стабилизирует супрессор p53. NQO1 постоянно сверхэкспрессируется при некоторых формах рака, включая рак груди, поджелудочной железы и плоскоклеточный рак [12]. Сверхэкспрессия NQO1 способствует прогрессированию бремени рака и делает раковые клетки более устойчивыми к химиотерапевтическим препаратам, таким как 5-FU или цисплатин (индукторы окислительного стресса), что делает NQO1 потенциальным онкогенным объектом для повышения терапевтической эффективности [13]. Сообщалось, что нокдаун NQO1 с помощью siRNA усиливал цитотоксический эффект многих лекарств, таких как гемцитабин или доксорубицин [14]. Кроме того, сообщается о нескольких синтетических и природных ингибиторах NQO1, таких как кумарины, куркумины или ES936 [15,16,17]. В этом исследовании мы использовали ß-лапахон (ß-лап, 3,4-дигидро-2,2-диметил-2H-нафто [1,2-b] пиран-5,6-дион) в качестве ингибитора NQO1 [ 18]. ß-lap действует через NQO1-зависимый механизм и создает значительное количество активных форм кислорода (АФК), которые приводят к повреждению цепей ДНК и гибели раковых клеток [19].

Использование наночастиц для системной доставки малых молекул становится многообещающим подходом в лечении рака [20]. Наночастицы, нагруженные лекарством, требуют меньшего графика дозирования и, как было показано, улучшают противоопухолевую эффективность и относительно снижают побочные эффекты. Среди всех носителей мезопористые наночастицы кремнезема (MSN) обладают значительным потенциалом для эффективной доставки полезной нагрузки к опухолевым тканям [21, 22]. Поры микрометрового размера обеспечивают стабильную загрузку лекарств и предотвращают их высвобождение в большой круг кровообращения, а также способствуют их преимущественному накоплению в протекающих раковых тканях за счет усиленного эффекта проницаемости и удержания (EPR) [23].

В целом, основная цель настоящего исследования заключалась в объединении терапевтических преимуществ 5-FU и ингибитора NQO1 для усиления противоопухолевого эффекта при HNSCC. Противоопухолевый эффект in vitro анализировали с использованием различных методов, таких как жизнеспособность клеток, вестерн-блоттинг, проточный цитометр / анализ апоптоза на основе Hoechst и анализ живых / мертвых. Исследования in vivo проводились на модели ксенотрансплантата с опухолевыми клетками Cal33.

Заключение

Таким образом, мы успешно создали мезопористые наночастицы диоксида кремния, покрытые липидным бислоем с 5-FU + ß-лапками. Мы показали, что (i) противоопухолевый эффект ß-lap зависимым от концентрации образом в опухолевых клетках HNSCC, (ii) комбинация 5-FU + ß-lap приводит к значительному ингибированию белка NQO1 и белка Bcl-2, ( iii) комбинированный FNQ-MSN продемонстрировал значительное снижение опухолевой нагрузки в ксенотрансплантате HNSCC. Эти данные недвусмысленно указывают на тот факт, что сублетальная доза ингибитора NQO1 (ß-lap) потенциально может повысить терапевтическую эффективность 5-FU при опухолях HNSCC и потенциально может быть распространена на клиническое лечение других злокачественных новообразований.

Материалы и методы

Приготовление наночастиц двухслойного липидного мезопористого диоксида кремния, нагруженных 5-FU / ß-Lap

Содержащий лекарство MSN получали растворением бромида цетилтриметиламмония (CTAB) (210 мг) в 180 мл воды и кипятили до 80 ° C, затем добавляли 5-FU и ß-лапку, добавляя 20% мас. / Мас. От общего количества наночастиц и затем добавляли фторид аммония (NH4F) (30 мг) и хорошо перемешивали в течение 60 мин. Затем по каплям в течение 30 минут добавляли 1,6 мл тетраэтилортосиликата (TEOS) и непрерывно перемешивали в течение 3 часов. Образовывались полупрозрачные белые коллоиды, которые собирали после центрифугирования (15 мин) при 10000 об / мин при 24 ± 1 ° C. MSN ресуспендировали в сверхчистой воде и цикл центрифугирования повторяли 2 раза. Отдельно получали тонкопленочную мембрану с использованием DSPE-PEG2000 (2% от общей массы MSN) и гидратировали водой, суспендированной с загруженным лекарственным средством MSN. Смесь немедленно обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут при 50 Вт при комнатной температуре (25 ° C). В конце концов, MSN на основе ПЭГилированного липидного бислоя, нанесенного на подложку, дважды промывали и ресуспендировали в сверхчистой воде.

Размер частиц, анализ дзета-потенциала и анализ морфологии

Диаметр частиц, индекс полидисперсности (PDI) и дзета-потенциал оценивали с помощью Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Малверн, Великобритания). Частицы анализировали с использованием механизма динамического рассеяния света (DLS), и дисперсии частиц были хорошо разбавлены перед экспериментом. Все эксперименты проводили в трех экземплярах при комнатной температуре. Морфологию наночастиц определяли с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM) с использованием CM 200 UT, Philips, MA, USA), работающего при 100 кВ. Вкратце, дисперсии частиц разбавляли, каплю помещали в сетку ТЕМ с размером ячеек 300 меш и давали отстояться в течение 10 мин. Частицы контрастировали 2% фосфорновольфрамовой кислотой (PTA) в качестве отрицательного окрашивания, сушили на воздухе и наблюдали под микроскопом TEM.

Загрузка лекарств

Анализ загрузки лекарственного средства двумя способами выполнялся путем расчета незагруженного или несвязанного лекарственного средства в супернатанте и лекарственного средства, загруженного в наночастицу. Эффективность загрузки лекарственного средства определяли методом ВЭЖХ. ВЭЖХ была оборудована насосом Shimadzu LC-20 AD PLC и детектором SPD-M20A PDA и программным обеспечением для анализа Shimadzu LC, содержащим колонку C18 с обращенной фазой (Phenomenex C18, 150 4,6 мм, 5 мкм). Подвижная фаза для 5-FU состоит из смеси ацетонитрила и воды (10:90, об. / Об.) И перекачивается со скоростью 1 мл / мин. Длина волны обнаружения установлена ​​на 265 нм для 5-FU. Подвижная фаза для ß-лапки, состоящая из ацетонитрила / воды (31:69, об. / Об.), И длина волны обнаружения установлена ​​на 254 нм при 35 ° C. Нагрузочная способность (LC) и эффективность загрузки (LE) 5-FU / ß-накат были рассчитаны по соответствующей формуле.

Исследование выпуска лекарства

Высвобождение 5-FU и ß-лапки оценивали в PBS (pH 7,4) и ABS (pH 5,0) при 37 ° C с использованием метода диализа. Вкратце, 1 мг эквивалента каждой нагруженной лекарством наночастицы загружали в диализную мембрану в 1 мл соответствующего буфера, и концы герметизировали. Герметизированную диализную мембрану помещали в 25 мл соответствующего буфера ABS и PBS и помещали на водяную баню со встряхиванием при 37 ° C. Образцы собирали через заданный интервал времени и заменяли равным объемом свежего буфера. Количество лекарственного средства, высвобожденного в соответствующем буфере, оценивалось методом ВЭЖХ, как описано в предыдущем разделе.

Клеточная культура и анализ активности NAD (P) H:хиноноксидоредуктазы 1 (NQO1)

Клетки Cal33 HNSCC культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% FBS и 1% смеси антибиотиков. Клетки поддерживали в инкубаторе в условиях окружающей среды. Для анализа активности NQO1 клетки Cal33 высевали в 96-луночный планшет при плотности посева 8 × 10 ³ клеток на лунку и инкубируют в течение ночи. Клетки обрабатывали различными концентрациями ß-lap и инкубировали в течение 24 часов. 0,8% дигитонин (50 мкл 2 нМ ЭДТА) использовали для лизирования клеток, и анализ выполняли с использованием менадиола и МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид) в качестве реакцию связывания субстрата и активность измеряли при 620 нм. Анализ проводили в трех экземплярах.

Анализ жизнеспособности клеток in vitro

Анализ жизнеспособности клеток ß-lap в увеличивающейся концентрации и анализ жизнеспособности клеток индивидуального и комбинированного режима были протестированы с помощью 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4 -сульфофенил) -2H-тетразолий (MTS) анализ. Вкратце, клетки Cal33 высевали в 96-луночный планшет при плотности посева 1 × 10 ⁴ . клеток на лунку и инкубируют в течение ночи. На следующий день клетки обрабатывали увеличивающейся концентрацией ß-lap отдельно; клетки обрабатывали индивидуальным и комбинированным режимом 5-FU и ß-lap при базовой концентрации 5, 10 и 20 мкг / мл и инкубировали в течение 24 часов. Клетки дважды промывали и обрабатывали раствором MTS в соответствии с инструкциями производителя. Жизнеспособность клеток рассчитывалась по отношению к необработанным клеткам, и считывающее устройство для микропланшетов использовали для определения поглощения при 460 нм.

Вестерн-блоттинг

Посеянные клетки в 6-луночном планшете обрабатывали увеличивающейся концентрацией ß-lap отдельно; клетки обрабатывали индивидуальной (5-FU или ß-лапой) и комбинационной схемой 5-ФУ и ß-лапки (FNQ-MSN) и инкубировали в течение 24 часов. Клетки собирали, лизировали (М-на буфер) и центрифугировали, и супернатант, содержащий белок, собирали. Концентрацию белка в клеточном лизате оценивали с использованием метода бицинхониновой кислоты (BCA). 10% полиакриламидного геля Бис-Трис использовали для разделения белков и немедленно переносили на мембрану из поливинилиденфторида (ПВДФ). Мембрану блокировали с использованием 5% обезжиренного молока, приготовленного в н-трис-буферном физиологическом растворе (TBS), содержащем Твин 20 (TBST, pH 7,2). Первичные антитела кроличьего поликлонального NQO1 (1:1000), моноклонального Bcl-2 мыши (1:1000) и моноклонального GAPDH мыши (1:1000) инкубировали на мембране в течение ночи при 4 ° C. Мембрану промывали TBST, а затем инкубировали со вторичными антителами (антителами против мыши или кроличьими IgG) в разведении 1:10000. Мембрану снова промывали TBST, и блоты обрабатывали раствором субстрата ECL, и плотность полос белка оценивали с помощью фотопроявителя.

Анализ апоптоза и Хёхста

Клетки Cal33 высевали в 6-луночный планшет с плотностью посева 2 × 10 ⁵ . клеток на лунку и инкубируют в течение ночи. Затем клетки обрабатывали индивидуальной (5-ФУ или ß-лапой) и комбинационной схемой 5-ФУ и ß-лапки (FNQ-MSN) и инкубировали в течение 24 часов. Клетки собирали, промывали, центрифугировали и осаждали. Клетки обрабатывали 2,5 мкл аннексина V и 2,5 мкл PI и инкубировали в течение 15 мин в темноте. Затем клетки доводили до 1 мл и оценивали с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS, BD, FACSverse). Всего было проанализировано 10 000 клеток. Схожую процедуру для посева клеток и обработки лекарственным средством использовали, а затем окрашивали красителем Hoechst 33342 (10 мкг / мл) и инкубировали в течение 10 мин. Клетки промывали и фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) и снова промывали. Морфологию клеток наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Nikon A1, Япония).

Противоопухолевая эффективность FNQ-MSN В модели опухоли ксенотрансплантата HNSCC

Самцов мышей BALB / c массой от 18 до 22 граммов в возрасте от 4 до 5 недель были закуплены в Центре содержания животных при университете легкой промышленности Чжэнчжоу, Хэнань. Животных содержали в комнате с кондиционированием воздуха с 12-часовым циклом темное-светлое и обеспечивали свободный доступ к пище и воде. Все протоколы для животных были одобрены этическим комитетом Чжэнчжоуского университета легкой промышленности, Хэнань. Чтобы создать модель ксенотрансплантата, 1 × 10 ⁷ Клетки Cal33 в 150 мкл культуральной среды инокулировали в правое бедро мыши подкожно. Когда средний размер опухоли достигал 80–100 мм3, мышей случайным образом делили на 5 групп для контроля, 5-FU, ß-lap, 5-FU + ß-lap и FNQ-MSN, соответственно, по 8 мышей в каждой группе. . 5-ФУ вводили в фиксированной дозе 5 мг / кг, а ß-lap - в фиксированной дозе 25 мг / кг и вводили 3 раза с перерывом в 3 дня для каждой инъекции в хвостовую вену. Вес мыши и объем опухоли регулярно контролировали в течение 18 дней. Объем опухоли рассчитывали по формуле

В настоящем исследовании не наблюдали смерти мышей из-за нагрузки опухолевыми клетками, и все животные были умерщвлены CO ₂ а затем принесены в жертву вывиху шейки матки ближе к концу исследования.

Статистический анализ

Несколько групп сравнивали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Уровень значимости p Значение <0,05 считалось значимым, и все данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, если иное не указано специально в соответствующих экспериментах.

Результат и обсуждение

Приготовление мезопористых наночастиц диоксида кремния на подложке из двухслойных липидных слоев с 5-ФУ / ß-лапками

В этом исследовании мы адаптировали мезопористую наночастицу диоксида кремния, стабилизированную ПЭГилированным липидным бислоем. MSN, нагруженный 5-FU / ß-лапками, получали способом обработки эмульсией ультразвуком, а затем загруженный лекарственным средством MSN вводили в колбу, содержащую тонкую липидную пленку, состоящую из DSPE-PEG2000. Смесь обрабатывали ультразвуком и получали покрытый липидом MSN, содержащий 5-FU / ß-лапку (FNQ-MSN) (фиг. 1a). Эффективность нагружения (УЭ) 5-ФУ и ß-перегиба составила 91,5 ± 1,65% и 92,9 ± 1,24%, соответственно. FNQ-MSN показал 8,1 ± 1,12 мас.% 5-FU и 7,6 ± 0,95 мас.% Β-лапки, что указывает на высокую нагрузочную способность (LC) носителя MSN. Наличие липидного бислоя предотвратит его нежелательное высвобождение в системный кровоток и тем самым предотвратит токсичность. Средний размер частиц загруженного лекарственным средством MSN составлял 92,1 ± 0,85 нм (PDI ~ 0,089), в то время как сборка липидного бислоя на поверхности MSN (FNQ-MSN) увеличивала средний размер частиц до 128,4 ± 1,24 нм (PDI ~ 0,115), указывая на то, что твердое присутствие липидных материалов на поверхности MSN (рис. 1b). Дзета-потенциал изменился с -18,2 ± 1,22 до -26,4 ± мВ. Малый размер частиц FNQ-MSN позволит преимущественно накапливать нагруженный лекарством носитель в протекающих тканях опухоли за счет эффекта ЭПР. Кроме того, поверхностный ПЭГилированный обеспечивает отличную стабильность и увеличенное время циркуляции крови, что еще больше увеличит шансы FNQ-MSN в опухолевых тканях. Изображение ПЭМ показало морфологическое сходство с изображением липосом и представило идеальную сферическую форму, равномерно распределенную по сетке. На ПЭМ-изображении отчетливо видна более поздняя сероватая внешняя и более темная сердцевина, указывающая на присутствие липидных сборок на поверхности MSN (рис. 1c). Размер, наблюдаемый с помощью ПЭМ, подтверждается размером частиц DLS с зетазизатора. MSN обладают хорошо упорядоченными каналами для гомогенного распределения молекул лекарства. Поверхностные свойства пор - один из важных факторов стабильной загрузки малых молекул. Различные физические силы, участвующие во взаимодействии хозяин-гость, в основном включают гидрофобные силы и силы ван-дер-ваальсова взаимодействия. Чем выше способность загрузки лекарственного средства, тем выше внутриклеточная концентрация и выше эффективность уничтожения опухолевых участков. FNQ-MSN продемонстрировал превосходную стабильность в среде PBS, и размер частиц оставался неизменным на протяжении всего периода исследования до 30 дней. Такая улучшенная стабильность системы-носителя и высокая нагрузочная способность системы-носителя улучшат биораспределение и эффективность лечения опухолей.

а Схематическое изображение конструкции мезопористых наночастиц диоксида кремния, покрытых 5-FU и ß-лапками, покрытых двойным слоем липидов. Два лекарства загружаются в поры MSN, которые дополнительно стабилизируются за счет сборки двойного слоя PEG-илированного липида на внешней поверхности MSN. б Гранулометрический состав FNQ-MSN. c ПЭМ-изображение FNQ-MSN со вставкой с большим увеличением

Выпуск лекарства in vitro

Высвобождение лекарственного средства in vitro 5-FU и ß-лапки из FNQ-MSN изучали в PBS и ABS (рис. 2). Как показано, наблюдались две разные тенденции высвобождения при pH 7,4 и pH 5,0. Например, 25% 5-ФУ высвобождается за 24 часа при pH 7,4 по сравнению с ~ 40% высвобождения лекарства при pH 5,0 за 24 часа. Точно так же 20% и 30% ß-лапки высвобождались при pH 7,4 и pH 5,0 соответственно. Кинетика высвобождения была идентична на протяжении всего периода исследования:50% 5-FU высвобождалось в щелочном буфере и 80% высвобождения лекарства при pH 5,0 через 72 часа периода исследования. Высвобождение лекарственного средства в кислой среде в зависимости от pH благоприятно для лечения рака. Явления всплеска высвобождения не наблюдалось в обоих условиях pH, что в основном объясняется присутствием слоя DSPE-PEG, который контролировал высвобождение лекарства из FNQ-MSN на протяжении всего периода исследования. Существенная разница в высвобождении лекарственного средства наблюдалась между условиями pH 7,4 и pH 5,0. При pH 7,4 ПЭГ- b -DSPE проявляет свойство высокой скрытности слоя, тем самым предотвращая высвобождение инкапсулированного соединения. Настоящий результат показал, что высвобождение лекарственного средства ускоряется при pH 5,0, что указывает на разборку защитной оболочки вокруг поверхности MSN. Скорость высвобождения лекарственного средства, чувствительная к pH, которая обеспечивает максимальное высвобождение лекарственного средства в раковых клетках, может улучшить противоопухолевую эффективность и снизить нежелательную токсичность для нормальных тканей. Возможно, что в присутствии pH-чувствительного элемента FNQ-MSN может привести к отслаиванию липидного бислоя на MSN, что приведет к усиленному высвобождению в условиях более низкого pH.

Высвобождение in vitro 5-FU и ß-лап из FNQ-MSN в буферных условиях с pH 7,4 и pH 5,0. Исследование высвобождения продолжалось до 72 часов, и высвобождение лекарственного средства определяли количественно с помощью метода ВЭЖХ. ** p <0,01

Чувствительность NQO1 к ß-кругу

Поскольку повышенная регуляция NQO1 во многих раковых клетках, включая HNSCC, связана с плохим прогнозом и плохим терапевтическим результатом, лекарства, нацеленные на NQO1, могут быть потенциальной стратегией лечения рака [24]. NQO1 сверхэкспрессируется на уровне от 100 до 200 раз в плоскоклеточной карциноме по сравнению с уровнем, связанным с нормальными тканями. Поэтому влияние ß-лапок на активность фермента NQO1 было изучено на клетках Cal33. Как показано, ß-lap показал зависимое от концентрации ингибирование активности фермента NQO1 в клетках Cal33 (рис. 3a). Примечательно, что значительный ингибирующий эффект наблюдался при дозе 20–50 мкг / мл ß-лапки. Кроме того, ингибирующий потенциал ß-лапки в отношении белка NQO1 был дополнительно изучен с помощью вестерн-блоттинга (рис. 3b). Результаты четко выявили значительное снижение белка NQO1 в раковых клетках с увеличением концентрации ß-лап. Примерно 80% ингибирование NQO1 наблюдается при 100 мкг / мл ß-lap. Биоактивируемый препарат NQO1, такой как ß-Lap, метаболизируется NQO1 и образует нестабильное гидрохиноновое соединение, которое немедленно превращается обратно в исходный компонент, оставляя 2 одноэлектронных окисления, и потребляет 2 O ²⁻ . Это создаст бесполезный окислительно-восстановительный цикл, в котором 1 молекула ß-лапа будет генерировать 130 моль супероксида за счет потребления 60–70 моль NAD (P) H6. Образовавшиеся таким образом супероксидные (O2−) радикалы превращаются в перекись водорода (H2O2−) и вызывают апоптоз и гибель клеток [25].

а Влияние концентрационно-зависимой активности ß-lap на активность NQO1 раковых клеток Cal33 ферментативным методом. б Влияние зависимой от концентрации активности ß-lap на уровни белка NQO1 по данным вестерн-блоттинга с использованием GAPDH в качестве домашнего белка

Противораковый эффект FNQ-MSN in vitro в клетках HNSCC

Противоопухолевый эффект ß-lap в клетках Cal33 in vitro изучали с помощью МТТ-анализа. Результаты показали, что ß-lap демонстрирует типичное зависимое от концентрации снижение жизнеспособности клеток (рис. 4a). Примечательно, что значительное снижение жизнеспособности клеток наблюдалось при концентрации 50 мкг / мл. Для дальнейших экспериментов было выбрано 20 мкг / мл (ниже значения IC50 ß-lap). Затем изучали потенцирующий эффект ß-лапки на 5-ФУ при 3 различных концентрациях (5, 10 и 20 мкг / мл). Как показано, комбинация 5-FU + ß-lap приводила к снижению жизнеспособности клеток; наиболее примечательно, что FNQ-MSN проявлял значительно более низкую жизнеспособность клеток по сравнению с любым из отдельных лекарств или физических комбинаций (фиг. 4b). Например, 5-FU и ß-lap показали жизнеспособность клеток 35,7% и 70,2%, в то время как 5-FU + ß-lap продемонстрировал 26,5%, а FNQ-MSN показал 13,1%, соответственно. Результаты ясно показали, что цитотоксический эффект 5-ФУ был значительно увеличен при сочетании с β-лапками. Стоит отметить, что FNQ-MSN был более эффективным по сравнению с 5-FU + ß-lap, что объясняется лучшей интернализацией и контролируемым высвобождением загруженных терапевтических средств из системы-носителя. Результаты ясно показывают ингибирующее действие ß-lap на ферментативную активность NQO1 и уровни белка, а также усиливают противораковый эффект 5-FU и приводят к улучшенному терапевтическому результату при лечении HNSCC.

а Влияние зависимой от концентрации активности ß-lap на жизнеспособность клеток Cal33. б Цитотоксический эффект индивидуума и комбинации со вторым химиотерапевтическим агентом, 5-ФУ в 3 различных концентрациях 5–20 мкг / мл соответственно. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-анализа через 24 ч инкубации. c Вестерн-блот-анализ экспрессии белков NQO1 и Bcl-2 после обработки индивидуумом или комбинацией 5-FU и ß-lap

Роль FNQ-MSN в сигнальных путях:вестерн-блот-анализ

Механизм цитотоксического действия, опосредованного ß-лапками, был дополнительно изучен с помощью вестерн-блоттинга. Как показано, ß-lap приводил к уменьшению полосы белка NQO1 по сравнению с контролем; однако наиболее заметное снижение уровня NQO1 наблюдалось в группе клеток, обработанных FNQ-MSN (рис. 4c). Повышение химиочувствительности Cal33, индуцированное ß-лапками, за счет усиления апоптоза клеток оценивали по уровню белка Bcl-2. Семейство Bcl-2 играет важную роль в регулировании клеточного гомеостаза и контролирует пролиферацию и гибель раковых клеток. Процесс уменьшения Bcl-2 и увеличения Bax приводит к высвобождению цитохрома С в цитозоле, который инициирует полный каскад каспаз, приводящий к гибели клеток [26]. Результаты ясно показали, что комбинация 5-FU и ß-lap (FNQ-MSN) значительно подавляла регуляцию Bcl-2, указывая на усиление противоопухолевого эффекта в раковых клетках Cal33.

Анализ апоптоза HNSCC

После анализа жизнеспособности клеток эффект апоптоза отдельного и комбинированного лекарственного средства на клетки Cal33 оценивали с помощью проточного цитометра после окрашивания аннексином V / PI (фиг. 5). Эффект апоптоза отдельных 5-ФУ (10 мкг / мл) или ß-лап (30 мкг / мл) не приводил к какому-либо заметному апоптозу раковых клеток; однако 5-FU + ß-лапка приводила к резкому увеличению доли апоптоза раковых клеток. Важно отметить, что FNQ-MSN вызывал более 60% апоптоза клеток (ранний и поздний апоптоз), что свидетельствует о превосходном терапевтическом эффекте комбинированного режима на основе носителя. Эффект апоптоза был дополнительно подтвержден окрашиванием Hoechst 33342. Как показано, клетки, обработанные FNQ-MSN, приводят к большему количеству клеток, подвергающихся апоптозу, ядерной конденсации и фрагментации по сравнению с таковым только 5-FU или ß-lap (фиг. 6). Во время процесса апоптоза клетки сжимаются, не повреждая внешнюю клеточную мембрану, что приводит к конденсации хроматина с повышенным образованием апоптотических тел.

Анализ клеток Cal33 с помощью проточного цитометра с использованием двойного окрашивания на аннексин V и PI после обработки отдельным или комбинацией 5-FU и ß-лапки. В проточном цитометре было зарегистрировано 10 000 событий

Анализ морфологии ядра клеток Cal33 после окрашивания Hoechst 33342; клетки обрабатывали индивидуально и комбинацией 5-ФУ и ß-лапки. В проточном цитометре было зарегистрировано 10 000 событий

Анализ живых / мертвых

Противоопухолевый эффект отдельного и комбинированного лекарственного средства дополнительно оценивали с помощью анализа «живые / мертвые». Обработанные клетки подвергали окрашиванию кальцеином AM и бромистым этидием в качестве соответствующего маркера живых и мертвых клеток (фиг. 7). Как показано, необработанные клетки окрашиваются 100% зеленой флуоресценцией. Отдельные препараты, 5-ФУ (10 мкг / мл) или ß-лапка (30 мкг / мл), хотя и демонстрировали клетки, окрашенные слабой красной флуоресценцией; однако преобладающие клетки проявляли зеленую флуоресценцию, что указывало на ограниченную гибель клеток. В раковых клетках, обработанных FNQ-MSN, наблюдалась заметная гибель клеток, о чем свидетельствует преобладающая красная флуоресценция и меньшее количество клеток, окрашенных зеленой флуоресценцией. Более высокий противораковый эффект FNQ-MSN был приписан синергической активности 5-FU и ß-lap в раковых клетках и способности ß-lap увеличивать химиочувствительность 5-FU.

Анализ живых / мертвых клеток Cal33 с использованием двойного окрашивания кальцеином AM и бромистым этидием после обработки индивидуальной или комбинацией 5-ФУ и ß-лапки

Противоопухолевая эффективность FNQ-MSN in vivo в отношении модели ксенотрансплантата HNSCC

Для дальнейшей оценки эффективности комбинированного режима на модели животных готовили ксенотрансплантат HNSCC и вводили 5 мг / кг 5-FU и 10 мг / кг ß-lap, соответственно. Фармацевтический класс ß-lap - ARQ761, который в настоящее время проходит фазу I клинических испытаний для лечения метастатических злокачественных новообразований. ß-Lap установил предел максимальной переносимой дозы для людей согласно доклиническим исследованиям [27]. Помня об этом, мы оптимально выбрали дозу 10 мг / кг ß-лапки для исследований in vivo. Как показано, не наблюдалось значительного уменьшения объема опухоли при индивидуальном введении 5-ФУ и β-лапки по сравнению с необработанным контролем (фиг. 8а). Заметное уменьшение объема опухоли наблюдалось при использовании физической смеси 5-FU + ß-lap; однако комбинированное лечение 5-ФУ и β-лапой на основе носителя (FNQ-MSN) значительно задерживало рост опухоли и продлевало выживаемость мышей с ксенотрансплантатом с опухолью. График объема опухоли FNQ-MSN можно разделить на две части; незначительный рост объема опухоли наблюдался до 9 дня, в то время как опухоль значительно увеличивалась с 9 дня до 18 дня, тем не менее, общий объем опухоли был во много раз меньше по сравнению с контрольной или другими группами. Токсичность индивидуального и комбинированного режима оценивалась по массе тела (рис. 8b). Как показано, физическая смесь 5-FU + ß-Lap привела к серьезной токсичности, что выражалось в потере веса тела более чем на 10%, в то время как 5-FU приводило к 5% массы тела. Как и ожидалось, FNQ-MSN не приводил к потере массы тела, что указывает на уникальное преимущество системы носителя на основе липида-MSN. Усиленный противоопухолевый эффект FNQ-MSN был приписан ингибирующему эффекту ß-lap по отношению к ферменту и белку NQO1, что, в свою очередь, увеличивало химиочувствительность 5-FU и приводило к синергетическому противораковому эффекту в человеческих опухолях Cal33, во-вторых, липидном бислое. - MSN с покрытием защищает лекарство во время системного кровотока и может высвобождаться контролируемым образом в опухолевой ткани, в-третьих, ПЭГилирование наноносителя может увеличивать время циркуляции крови, обеспечивая преимущественное накопление в опухолевых тканях за счет эффекта ЭПР [28, 29 ]. Пегилированный MSN в основном задерживался в RES печени, селезенки и легких, что составляло более 80% введенной дозы. Модификация MSN ПЭГ, очевидно, снижает скорость клиренса MSN в органах, демонстрируя, что ПЭГилированные НЧ труднее удалить из органов RES независимо от формы частиц [30, 31]. В целом, исследование модели HNSCC in vivo предлагает «доказательство концепции» того, что эффективная комбинация 5-FU + ß-lap в стабильном наноносителе может повысить терапевтическую эффективность опухоли, одновременно уменьшая связанный с ней токсический эффект.

а Противоопухолевая эффективность FNQ-MSN in vivo на модели ксенотрансплантата HNSCC. Мышей с опухолями HNSCC вводили 5-FU, ß-lap, 5-FU + ß-lap и FNQ-MSN в фиксированной дозе 5 мг / кг 5-FU и 10 мг / кг ß-lap внутривенно. в 3 раза. Объем опухоли был отмечен как часть анализа эффективности и сравнен с необработанным контролем. б Анализ массы тела, соответствующий данным объема опухоли. * p <0,05 и *** p <0,001

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью и файлы с дополнительной информацией к ней.

Сокращения

5-FU:

5-фторурацил

EPR:

Улучшенный эффект проницаемости и удерживания

FNQ-MSN:

Мезопористые наночастицы кремнезема, нагруженные 5-FU / ß-лапками

HNSCC:

Плоскоклеточный рак головы и шеи

MSN:

Мезопористые наночастицы кремнезема

NQO1:

НАД (Ф) Н:хинон оксидоредуктаза 1

ß-lap:

бета-лапахон