Использование наночастиц с омнисканом в качестве контрастного агента для МРТ, направленного на опухоль, при плоскоклеточной карциноме полости рта с помощью стратегии стимулирования желатиназы

Введение

Плоскоклеточная карцинома полости рта (OSCC) - наиболее распространенная злокачественная опухоль в ротовой и челюстно-лицевой областях; из-за особого расположения OSCC хирургическое лечение неизбежно влияет на функции и эстетику орофациальной области. Ранняя и точная диагностика OSCC позволяет проводить более индивидуальное и правильное хирургическое лечение и, следовательно, приводит к снижению заболеваемости после лечения, а также к лучшему прогнозу пациента. Правильный диагноз и постановка диагноза, влияющие на планирование лечения заболевания, требуют использования методов визуализации [1].

МРТ - это неинвазивный метод визуализации без ионизирующего излучения. Его можно использовать для получения трехмерных изображений мягких тканей с высоким разрешением. Многопараметрическая МРТ была протестирована в клинических испытаниях и доказала свою полезность при локализации опухолей [2]. Хотя различные соединения были оценены как контрастные вещества для МРТ, комплексы гадолиния (Gd) продолжают оставаться наиболее широко используемыми и составляют практически все агенты, применяемые в настоящее время в клинике [3]. Однако существующие контрастные вещества для МРТ на основе Gd не специфичны для опухоли и не могут обеспечить точное обнаружение и характеристику опухоли. Из-за небольшого размера большинство этих агентов могут распределяться во внутрисосудистых и интерстициальных пространствах и быстро выводиться через почечную фильтрацию [3]. Чтобы улучшить специфичность опухолевых тканей и продлить время циркуляции контрастного вещества для МРТ в кровотоке, исследователи попытались разработать и синтезировать новые вариабельные контрастные вещества для МРТ [4,5,6,7,8].

В недавнем прошлом были разработаны и изучены многие наночастицы (НЧ), связанные с метоксиполи (этиленгликоль) (mPEG) и / или поликапролактоном (PCL) [9,10,11]. Эти НЧ использовались для доставки лекарств, они способствовали растворимости лекарств, улучшали терапевтический процесс за счет увеличения времени циркуляции и усиления поглощения опухолями за счет повышенной проницаемости и удерживающего эффекта. mPEG и PCL - сополимер, одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, который проявляет очень низкую иммуногенность, антигенность и токсичность и широко изучается для использования в медицине [12]. Известно, что биосовместимость и биоразлагаемость являются важными свойствами при использовании НЧ в области медицины, окружающей среды и химической инженерии [13, 14]. В нашей предыдущей работе мы разработали систему доставки лекарств, стимулирующих желатиназу, на основе mPEG и PCL с опухолеспецифическим расщепляемым желатиназой пептидом, вставленным между mPEG и PCL [12]. На эту наночастицу загружали терапевтические препараты, такие как доцетаксел, miR-200c. Исследования in vitro и in vivo показали, что препараты могут доставляться специфически в ткани опухоли [15]. Наши НП основаны на относительно простой стратегии нацеливания на опухоли. Эффект повышенной проницаемости и удерживания (EPR) может накапливать наночастицы в опухолевых тканях. Желатиназы (матриксные металлопротеазы-2/9, MMP2 / 9, коллагеназы IV), которые широко экспрессируются в опухолях, разделяют НЧ и высвобождают загруженные лекарственные средства. В отличие от стратегии активного нацеливания, наши НП обладают потенциалом загрузки различных терапевтических и диагностических препаратов, что было бы более простым и универсальным.

В этом исследовании мы загрузили тот же тип НЧ с Omn, широко используемым контрастным агентом для МРТ [16], чтобы достичь цели создания нацеленного на опухоль, биосовместимого и биоразлагаемого контрастного агента для МРТ. Эффективность Omn-NP в качестве контрастного агента для МРТ оценивалась на модели ксенотрансплантата плоскоклеточной карциномы ротовой полости человека с одним Omn в качестве контроля.

Материалы и методы

Материалы

Метоксиполиэтиленгликоль-NHS (mPEG-NHS, Mn 5000) был приобретен у Beijing Jiankai Technology Co (Пекин, Китай). Расщепляемый желатиназой пептид (последовательность:H2N-PVGLIG-COOH) был синтезирован Shanghai HD Biosciences Co (Шанхай, Китай). Омнискан (инъекция гадодиамида) был приобретен в компании GE Healthcare (Ирландия). Коллагеназы IV приобретены у Sigma (США).

Синтез омн-нагруженных НЧ-стимулов желатиназ

Расщепляемый желатиназой сополимер mPEG-Pep-PCL и mPEG-PCL без пептида были синтезированы сополимеризацией с раскрытием цикла, как и в нашей предыдущей работе [17]. Омн-НЧ были приготовлены методом испарения двойной эмульсии с растворителем. Вкратце, 10 мг сополимера mPEG-Pep-PCL растворяли в 1 мл дихлорметана (DCM). Затем добавляли 0,1 мл, 0,2 мл и 0,3 мл Омн соответственно. Эту смесь эмульгировали в 3 мл 3% (мас. / Об.) Водного раствора поливинилового спирта (ПВС) обработкой ультразвуком (XL2000, Misonix, Фармингдейл, Нью-Йорк, США) в течение 60 с для получения эмульсии масло / вода (мас. / Мас.). . Эту эмульсию затем эмульгировали в 5 мл водного раствора, содержащего 0,5% (мас. / Об.), Обработкой ПВА ультразвуком в течение 60 с. Образовавшуюся эмульсию вода / масло осторожно перемешивали при комнатной температуре в вытяжном шкафу до тех пор, пока органический растворитель не испарился. Полученный раствор фильтровали для удаления не включенных лекарств. Бланк-NP получали таким же образом, как описано, без добавления Omn. Нагруженные Omn NP mPEG-PCL (Con-Omn-NP) были синтезированы с 10 мг сополимера mPEG-PCL и 0,2 мл Omn с соблюдением тех же шагов.

Измерение размера частиц и исследование морфологии НЧ

Размеры частиц и стабильность Omn-NP и холостых NP измеряли методом динамического рассеяния света (DLS) (Brookhaven Instruments Corporation, США). Омн-НЧ и холостые НЧ хранили при комнатной температуре. Размеры частиц определяли с помощью DLS каждые 2 дня для оценки стабильности Omn-NP (всего в течение 6 дней). Значения представляли собой среднее значение трех измерений для одного образца. Изучение морфологии Omn-NP и холостых NP проводили с использованием просвечивающего электронного микроскопа (TEM) (JEM-100S, JEOL, Япония). Одну каплю правильно разбавленной суспензии НЧ помещали на медную сетку, покрытую нитроцеллюлозной мембраной, и сушили на воздухе при комнатной температуре. Перед наблюдением образец был отрицательно окрашен 1% -ным (масс. / Об.) Раствором фосфорно-вольфрамового натрия.

Содержание загрузки лекарств и эффективность инкапсуляции

Содержание загрузки лекарственного средства и эффективность инкапсуляции Omn-NP анализировали путем расчета концентрации иона гадолиния. Один миллилитр Omn-NP расщепляли концентрированной азотной кислотой, а затем смесь разбавляли разбавленной азотной кислотой. Образец был протестирован с помощью атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-AES, Optima 5300DV, PerkinElmer, США).

Макроскопические изменения и микроскопические морфологические изменения НЧ в ответ на коллагеназу

Нагруженные омн mPEG-PCL NP (Con-Omn-NP) и mPEG-Pep-PCL NP (Omn-NP) инкубировали с раствором Хэнка, содержащим коллагеназу IV (0,34 мг / мл), при 37 ° C в течение 24 часов. Изменения прозрачности раствора наблюдали невооруженным глазом.

Оценка морфологии под микроскопом Con-Omn-NP и Omn-NP (инкубированных с коллагеназой или без нее) проводилась с использованием ТЕМ. Для ПЭМ одну каплю суспензии НЧ помещали на медную сетку, покрытую нитроцеллюлозной мембраной, и сушили на воздухе перед наблюдением.

В V itro C эллиптический U ptake

Линии плоскоклеточного рака полости рта человека (HSC3) были любезно предоставлены Девятой больницей Шанхая. Опухолевые клетки высевали в 24-луночный планшет с плотностью 5 × 10 ⁵ . клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов. Затем загруженные кумарином-6 НЧ mPEG-Pep-PCL (12,5 мкг / мл, рассчитанные по кумарину-6) добавляли в культуральную среду и инкубировали в течение 0,5 и 1 ч при 37 ° C. Культуральную среду отсасывали и трижды промывали PBS. Клетки иммобилизовали в течение 20 мин абсолютным этанолом (1 мл на лунку), затем трижды промыли PBS. Клетки наблюдали с помощью иммунофлуоресцентной цитохимии и конфокального лазерного сканирующего микроскопа (LSM710, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Берлин, Германия). Длина волны возбуждения и испускания для кумарина-6 составляла 460 нм.

Животные

Все эксперименты на животных проводились в полном соответствии с руководящими принципами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованном Национальными институтами здравоохранения США (публикация NIH № 85-23, пересмотренная в 1985 г.), и были одобрены Советом по этике для Исследования на животных Нанкинской стоматологической больницы, Медицинская школа Нанкинского университета. Мышей BALB / c (5–6 недель, 18–22 г) покупали в Исследовательском центре модельных животных Нанкинского университета. Состояние здоровья животных, включая массу тела и состояние кожи, контролировалось дважды в неделю. Изъязвления, снижения подвижности животных и снижения веса во время эксперимента не наблюдалось.

Создание модели OSCC

Опухолевые клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина при 37 ° C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ и 95% воздуха. Чтобы создать модель ксенотрансплантата человеческого OSCC, человеческие клетки OSCC HSC3 (1 × 10 ⁶ клетки в 50 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS)) подкожно инокулировали в правую подмышечную впадину голых мышей (3 мыши на группу). Мы измеряли размер опухоли через день штангенциркулем. Когда диаметр опухоли составлял приблизительно 0,4–0,5 см, мыши были готовы к экспериментам по МРТ in vivo.

Исследование МРТ in vivo с Omn-NP и Omn в качестве контрастного агента

Для исследования in vivo мы разделили мышей на две группы (A и B). Мышам в группе A вводили Omn-NP через хвостовую вену, тогда как мышам в группе B вводили ту же концентрацию Omn, что и загруженные NP. Обе группы сканировали с использованием МРТ-сканера Bruker Biospin 7.0T (Bruker BioSpin, Эттлинген, Германия). Параметры устанавливались следующим образом:поле зрения (FOV) 3,5 × 2,5 см; толщина среза 0,8 мм; TR, 745,2 мс; TE, 7,5 мс. Осевые срезы мыши получали с использованием T1-взвешенной последовательности спинового эхо. Изображения были получены до и в разные моменты времени после внутривенного введения двух контрастных веществ.

Экспрессия MMP2 / 9 в опухоли и нормальных тканях

После исследования МРТ in vivo опухолевые ткани, сердце, печень, селезенка, легкие, почки и мышечные ткани из модели мышей OSCC были отобраны для иммуногистохимического (IHC) окрашивания на MMP2 и MMP9. Все ткани препарировали и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, обычно превращали в парафин и делали срезы толщиной 5 мкм. Исследование IHC на полуколичественное выражение (-, + и ++) MMP2 / 9 было проведено с использованием оптической микроскопии.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием t Стьюдента. контрольная работа. Данные были указаны как среднее ± стандартное отклонение и значение p . <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Характеристика наночастиц mPEG-Pep-PCL

¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) спектры сополимеров mPEG-Pep-PCL подтвердили, что пептид был успешно конъюгирован с mPEG, а конъюгаты mPEG-Pep были успешно конъюгированы с PCL (фиг. 1a). Молярное отношение гидрофильного блока к гидрофобному блоку (mPEG / PCL) в сополимере mPEG-Pep-PCL составляло около 0,95 на основе интегрального отношения -CH2-O- (4,04 ppm) в сегменте PCL к -CH2-CH2-O ( 3,65 частей на миллион) в сегменте мПЭГ из ¹ Измерение H ЯМР.

а ¹ H Спектры ядерного магнитного резонанса (300 МГц, 25 мкС) PEG-Pep-PCL в CDCl3. б Диаметр и индекс полидисперсности пустых НЧ и НЧ, нагруженных Ом (0,1 мл, 0,2 мл, 0,3 мл). c Стабильность загруженных Omn НЧ (0,1 мл, 0,2 мл, 0,3 мл). г ПЭМ-микрофотографии холостых НЧ и НЧ, нагруженных Омн. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения трех отдельных измерений

Размеры частиц и стабильность НЧ

Размер частиц и индекс полидисперсности (PDI) определяли методом DLS (рис. 1b). Не было обнаружено значительных различий в размерах частиц между тремя Omn-NP ( p > 0,05), в то время как достоверные различия были обнаружены между Omn-NP и холостыми NP ( p <0,05). Для PDI не было обнаружено значительных различий между этими Omn-NP ( p > 0,05), но были значительные различия между Omn-NP и холостыми NP ( p <0,05).

Что касается стабильности Omn-NP, то во всех трех Omn-NP не наблюдалось осаждения и явного изменения размеров (рис. 1c), что указывает на стабильность Omn-NP.

Морфологические исследования НЧ

Микрофотографии ПЭМ холостых НЧ и Omn-НЧ представлены на рис. 1г. Сплюснутая форма также могла наблюдаться как у пустых НЧ, так и у Omn-NP, и Omn-NP были намного меньше, чем пустые НЧ из-за их разных размеров. Более того, Omn в наночастицах можно было четко различить, который выглядел как темные частицы в наночастицах. Эти частицы Omn могут наблюдаться рассредоточенно внутри НЧ.

Контент загрузки лекарств и эффективность инкапсуляции

Содержание загрузки лекарственного средства и эффективность инкапсуляции трех Omn-NP показаны в таблице 1. Результат показал, что 0,3 мл Omn имел самую высокую загрузку лекарственного средства, но эффективность инкапсуляции была довольно низкой, а 0,1 мл Omn имел самую высокую эффективность инкапсуляции и относительно близкую. загрузка препарата 0,2 мл и 0,3 мл Омн. Принимая во внимание как загрузку лекарственного средства, так и эффективность инкапсуляции, в заключительном исследовании МРТ in vivo использовали 0,1 мл Omn-NP. Низкая эффективность инкапсуляции также указывает на то, что в реакционной системе добавленного нами Omn было достаточно для НЧ.

Макроскопические и микроскопические морфологические изменения Omn-NP и Con-Omn-NP в ответ на коллагеназу IV

Чтобы проверить расщепление NP в ответ на желатиназу (коллагеназа IV), оценивали макроскопические и микроскопические морфологические изменения Omn-NP и Con-Omn-NP после инкубации с раствором Хэнка, содержащим 2 мг / мл коллагеназы IV. A1 и B1 показали прозрачные растворы Con-Omn-NP до и после инкубации с коллагеназой IV, а A2 и B2 показали, что не было обнаружено никаких изменений в микроскопической морфологии Con-Omn-NP с использованием ПЭМ до и после инкубации. C1 и D1 показали растворы Omn-NP до и после инкубации с коллагеназой IV. D1 показал, что жидкость стала мутной из-за выпадения осадка в растворах Omn-NP через 24 часа. На D2 показаны ПЭМ-изображения Omn-NP в ответ на коллагеназу IV, структуры NP разрушены (рис. 2). Этот результат показал, что наши НЧ были стимулами желатиназы:расщепление пептида разрушило бы НЧ, и загруженные лекарства высвободились. И свойство расщепления пептида для высвобождения загруженных лекарств также было продемонстрировано посредством высвобождения лекарств и в наших предыдущих исследованиях [12, 18].

a1 , a2 , b1 , b2 , c1 , c2 , d1 , d2 Макроскопические и микроскопические морфологические изменения НЧ mPEG-PCL, нагруженных Omn (Con-Omn-NP), и НЧ mPEG-Pep-PCL, нагруженных Omn (Omn-NP), после инкубации с коллагеназой IV

Исследования клеточного поглощения in vitro

Поглощение клетками нагруженных кумарином-6 НЧ показано на фиг. 3. Зеленая флуоресценция кумарина-6 проявлялась в цитоплазме клеток HSC3, что позволяет предположить, что кумарин-6 попал в цитозоль вместе с НЧ. Поскольку кумарин-6 изначально был захвачен в НЧ, это указывает на то, что наши НЧ могут эффективно преодолевать барьеры клеточной мембраны и распространяться в цитоплазме клетки посредством эндоцитоза.

а, б Исследования поглощения HSC3 клетками наночастиц in vitro. Изображения с конфокальной микроскопии клеток HSC3 после инкубации с НЧ, нагруженными кумарином-6

МРТ In Vivo с Omn-NP и Omn в качестве контрастных агентов

Изображения были получены до введения Омн-НЧ и Омн внутривенно в дозе 0,025 ммоль / кг (Gd ³⁺ ) 2-х групп. Затем были получены постконтрастные изображения через 5 мин, 15 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 150 мин и 180 мин после инъекции (рис. 4а). ) соотношение было рассчитано и использовано в качестве измеримого показателя для оценки с использованием Omn-Nps по сравнению с Omn. Результаты показали, что максимальное TBR для Omn-NP составляло 2,23 ± 0,10 и 1,48 ± 0,01 для Omn, время достижения пика составляло 30 минут для Omn-NP и 5 минут для Omn, а время усиления сигнала составляло 180 минут для Omn-. НЧ и 30 мин для Omn (рис. 4б). Между двумя группами была значительная разница в максимальном TBR и времени удерживания ( p <0,05). Хотя наши Omn-NP имели относительно низкую лекарственную нагрузку, была продемонстрирована улучшенная МРТ-визуализация in vivo по сравнению с одним Omn. Это также доказало, что наши Omn-NP были стимулами для желатиназы и опухолеспецифичностью.

а , b Осевые изображения МРТ и линейная диаграмма отношения опухоли к фону модели ксенотрансплантата человеческого OSCC в указанных положениях опухоли, полученная с помощью T1-взвешенной последовательности. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения трех отдельных измерений

Несмотря на то, что для диагностики ОСЗ использовались недавно передовые методы визуализации, такие как однофотонная эмиссионная компьютерная томография [19], позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) [20] и оптическое изображение [21], МРТ по-прежнему остается наиболее широко используемым и надежным инструменты для определения стадии опухолей головы и шеи в соответствии с системой определения стадии рака TNM [1], а хелаты гадолиния по-прежнему являются наиболее широко используемыми контрастными веществами для МРТ [22].

Для достижения цели нацеливания на опухоль специально для контрастного агента МРТ использовались стратегии активного и пассивного нацеливания [2, 23, 24]. Активное нацеливание [12] стало большим направлением в диагностике рака. Направляющие лиганды, такие как аптамер [25], пептид [8], антитело [6] и фолат [26], конъюгированы с макромолекулярными и супрамолекулярными мультимерными комплексами Gd для связывания с конкретными рецепторами, сверхэкспрессируемыми опухолевыми клетками или сосудистыми сетями. Однако свойства биосовместимости и биоразлагаемости этих макромолекул и супрамолекул неясны, а их небиоразлагаемость затрудняет клиническое применение. Однако наши Omn-NP состоят из PEG, PCL, пептида, расщепляющего желатиназу, и Omn. PEG и PCL обладают превосходной биосовместимостью и биоразлагаемостью, а Omn - это широко используемый в клинической практике контрастный агент для МРТ; поэтому ожидается, что наши Omn-NP будут обладать превосходной биобезопасностью.

Модификация полимера гидрофильным мПЭГ может продлить кровообращение и увеличить накопление НЧ в опухолях. Пегилирование может снизить адгезию сывороточного белка и создать скрытую поверхность, чтобы продлить время циркуляции, избегая поглощения ретикулоэндотелиальными системами [12, 17]. Концентрация инкапсулированных лекарственных средств специфически увеличивалась на участках опухоли, и в этом исследовании наблюдалось значительное увеличенное время усиления. Следовательно, время пика TBR было намного позже, а период задержки визуализации был намного дольше в группе Omn-NP, чем в группе Omn.

Более того, улучшенная специфичность и увеличенное время усиления минимизируют вводимую дозу ионов гадолиния и, таким образом, снижают риск нефрогенного системного фиброза, что является проблемой при разработке контрастных агентов на основе гадолиния [27, 28].

Окрашивание IHC для MMP2 и MMP9

Результаты ИГХ окрашивания для MMP2 и MMP9 нормальных тканей из органов и опухолевых тканей показаны на рис. 5. Результаты показали, что уровни экспрессии MMP2 и MMP9 в опухолевых тканях были (++), тогда как в большинстве нормальных тканей были ( - ). В опухолевых тканях клеточная плазма и внеклеточный матрикс были заметно окрашены в коричневый цвет, что указывает на более высокий уровень экспрессии MMP2 / 9.

а , b ИГХ-окрашивание на MMP2 и MMP9 в нормальных и опухолевых тканях ксенотрансплантата на модели мышей линий плоскоклеточной карциномы ротовой полости человека

Семейство матриксных металлопротеиназ (ММП) играет ключевую роль в инвазии и метастазировании рака. Сообщается, что ММР2 / 9, которые также известны как коллагеназы IV и желатиназы A / B, являются наиболее важными связанными с раком ММП. Исследования выявили корреляцию между экспрессией желатиназ и плохими исходами многих опухолей, включая OSCC [29, 30]. Высокая экспрессия MMP2 / 9 также наблюдалась в нашем исследовании. ММП, несомненно, являются важными противораковыми мишенями, поскольку они широко распространены и тесно связаны с раком. Таким образом, наши Omn-NP могут использоваться практически при всех опухолях. Его простота и универсальность имеют хороший потенциал для клинического применения.

Выводы

В этом исследовании мы разработали и синтезировали новую систему доставки контрастного вещества для МРТ, направленную на опухоль, чтобы компенсировать дефекты контрастных веществ, используемых в настоящее время в клинике. Для Omn-NP было обнаружено более высокое отношение опухоли к фону MRI T1 и увеличенное время циркуляции крови, чем для Omn на модели мышей OSCC. Это исследование демонстрирует, что Omn-NP являются многообещающими в качестве опухолеспецифических контрастных агентов для МРТ для улучшения специфичности и увеличения времени циркуляции в опухолевых тканях. Учитывая превосходные свойства биосовместимости и биоразлагаемости PEG и PCL, а также Omn, широко применяемого в клинической практике контрастного вещества для МРТ, эта система доставки контрастного вещества для МРТ, направленная на опухоль, имеет хороший потенциал для клинического применения. Кроме того, будут предприняты дальнейшие усилия по увеличению содержания лекарственного вещества и эффективности инкапсуляции Omn в наших наночастицах для повышения чувствительности.

Доступность данных и материалов

Данные, подтверждающие выводы этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Сокращения

НП:

Наночастицы

Омн:

Омнискан

OSCC:

Плоскоклеточный рак полости рта

MMP:

Матричная металлопротеиназа

Gd:

Гадолиний

mPEG:

Метокси-поли (этиленгликоль)

PCL:

Поли (ε-капролактон)

Пеп:

Пептид

Омн-НП:

Нагруженные омнисканом НЧ мПЭГ-Пеп-ПКЛ

Con-Omn-NPs:

НЧ мПЭГ-ПКЛ, нагруженные омнисканом

МРТ:

Магнитно-резонансная томография

EPR:

Повышенная проницаемость и удерживание

DCM:

Дихлорметан

PVA:

Поливиниловый спирт

DLS:

Динамическое рассеяние света

PDI:

Индекс полидисперсности

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

ICP-AES:

Индуктивно-связанная плазменно-атомно-эмиссионная спектрометрия

DMEM:

Модифицированный носитель Орла, созданный Дульбекко

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

IHC:

Иммуногистохимический

PBS:

Фосфатный буферный раствор