Нацеленные на опухоли и биосовместимые наночастицы MoSe2 @ наносферы альбумина в качестве двойного терапевтического агента для синергетической фототермической радиотерапии

Фон

Во всем мире рак груди встречается с очень высокой частотой у женщин и известен своей низкой выживаемостью и высокой частотой метастазов и рецидивов [1,2,3]. На практике часто используются хирургическая резекция, лучевая терапия (ЛТ) и химиотерапия, хотя эти методы лечения имеют недостатки [4]. Лучевая терапия является высокоэффективной терапией, но также вредна для нормальных тканей. Было исследовано усиление терапевтического эффекта RT при уменьшении его вредных воздействий. RT использует ионизирующее излучение (например, γ-лучи, рентгеновские лучи) для ионизации молекул воды в реактивные свободные радикалы, которые повреждают ДНК в раковых клетках локально, даже в глубокой области [5]. Поскольку сообщалось, что микросреда опухоли гипоксична, это считалось одним из основных препятствий для лучевой терапии [6, 7]. Учитывая эти недостатки, сообщалось, что комбинирование ЛТ с другими терапевтическими стратегиями является эффективным для усиления терапевтических эффектов. На сегодняшний день фототермическая терапия (ФТТ) широко исследуется как минимально инвазивное лечение рака из-за меньшего количества побочных эффектов, высокой специфичности и минимального побочного эффекта для нормальных тканей [8,9,10,11,12,13,14,15 ]. Однако одной лишь ЧТВ часто недостаточно из-за неполного подавления опухоли, особенно для недоступных опухолей, которые потенциально могут вызвать рецидив опухоли [16,17,18]. Интересно, что PTT, как сообщалось, приводит к гипертермии, индуцированной ближним инфракрасным (NIR), увеличивая внутриопухолевое кровообращение, и, следовательно, увеличивает доступность кислорода в микроокружении опухоли, делая клетки более чувствительными к RT [19,20,21]. Комбинация ЛТ с ЧГТ может объединить преимущества обоих, что предпочтительнее для улучшения терапевтических результатов рака.

В последнее время двумерные (2D) -слойные дихалькогениды переходных металлов (TMD), такие как MoS ₂ , WS ₂ , ReS ₂ и т. д., были использованы в качестве адсорбирующих агентов NIR или радиосенсибилизаторов для повышения эффективности PTT или RT благодаря их физическим свойствам [7, 19, 21]. Шен и его соавторы сообщили о получении однородного ультратонкого ReS ₂ снизу вверх. нанолисты для высокоэффективной PTT и RT с визуализацией изображения [21]. В дополнение к этим TMD, селенид молибдена (MoSe ₂ ) были описаны как фототермический преобразователь NIR для PTT [22, 23]. Поскольку одна только PTT имеет свой недостаток, есть больше причин для использования MoSe ₂ такие свойства, как радиосенсибилизация, для лучшей терапии рака.

В этой работе мы сначала подготовили сверхмалый MoSe ₂ наноточки, которые затем были собраны с бычьим сывороточным альбумином (BSA) в наносферы (NS) и, наконец, конъюгированы с нацеливающей на опухоль молекулой фолиевой кислоты (FA) через полиэтиленгликоль (PEG) «мостики». Помимо большого фототермического эффекта, полученный FA-MoSe ₂ Было обнаружено, что NS @BSA обладают отличной радиосенсибилизацией. Модификация BSA наделила MoSe ₂ наноточки (НА) с превосходной физиологической стабильностью и биосовместимостью. Эксперименты in vitro и in vivo продемонстрировали, что FA-MoSe ₂ НС @BSA продемонстрировали превосходный нацеленный на опухоль эффект, одновременно работая как фототермический агент в ближнем инфракрасном диапазоне и радиосенсибилизатор для синергетической фототермической лучевой терапии без токсичности для здоровых тканей.

Методы

Материалы

FA-PEG ₅₀₀₀ -NHS и CH ₃ -ПЭГ ₅₀₀₀ -NHS были получены от Shanghai Ponsure Biotech. Co. Ltd. Флуоресцеина изотиоцианат (FITC), бычий сывороточный альбумин (BSA, очищенный ≥ 98,0%), нерасфасованный MoSe ₂ порошок и краситель кальцеин-AM (CA) -пропидия иодид (PI) были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). 4 ', 6-Диамидино-2-фенилиндол (DAPI) был получен от Aladdin (Шанхай, Китай). Реагенты для культивирования клеток были предоставлены Corning Inc. Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) был предоставлен Dojindo Laboratories (Япония). Антитело γ-H2AX было предоставлено Millipore (Темекула, Калифорния).

Подготовка FA-MoSe ₂ @BSA NS

Во-первых, в типичной процедуре 50 мг MoSe ₂ порошок добавляли в 25 мл дистиллированной воды при 20-минутном перемешивании, а затем обрабатывали ультразвуком на ледяной бане, используя ультразвуковую обработку наконечника (Scientz-IID, 950 Вт, 25 кГц). Обработка ультразвуком была импульсной в течение 2 секунд включения и 3 секунды в течение всего времени обработки ультразвуком 12 часов с амплитудой 70%. После этого смесь центрифугировали при 6000 об / мин в течение 25 мин. Супернатант собирали и снова центрифугировали при 12000 об / мин в течение 30 минут, в результате чего получали MoSe ₂ наноточек (MoSe ₂ НД) раствор. После этого к вышеуказанному супернатанту добавляли 25 мг порошка BSA при слабом перемешивании, образуя затвердевшие коацерваты после перемешивания в течение 6 часов при 25 ° C и pH =7,4, а затем обрабатывали поперечным сшиванием 0,5% глутаральдегидом (250 мкл). После этого глутаральдегид удаляли диализом в воде в течение 1 дня, в результате чего получали MoSe ₂ Наносферы @BSA (MoSe ₂ @BSA NS). Затем MoSe ₂ Наносферы @BSA были разделены на две части, одна из которых смешана с FA-PEG ₅₀₀₀ -NHS (8 мг), а другой был смешан с CH ₃ -ПЭГ ₅₀₀₀ -NHS (8 мг) и перемешивали в течение 2 часов. Наконец, раствор диализовали в воде, чтобы получить очищенный FA-MoSe ₂ @BSA NS и MoSe ₂ Решение @BSA NSs. Приготовленный раствор хранили при 4 ° C. Кроме того, спектрометр UV-VIS использовался для количественной оценки FA на FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Подробно после смешивания MoSe ₂ Наносферы @BSA с FA-PEG ₅₀₀₀ -NHS (8 мг) и после реакции в течение 2 ч смесь центрифугировали для удаления неограниченной FA. Супернатант собирали для обнаружения абсорбции. Концентрацию ФА определяли с помощью УФ-видимого спектрометра при длине волны пика поглощения ФА (280 нм). Эффективность инкапсуляции FA (EE) рассчитывалась, как описано в следующем уравнении:

Характеристики FA-MoSe ₂ @BSA NS

Морфологию образцов наблюдали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ, JEOL JEM2011, Токио, Япония) и сканирующего электронного микроскопа (SEM, Hitachi FE-SEM S-9300, Janpan). Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., Великобритания) использовали для определения размера и дзета-потенциала. Спектры поглощения в ультрафиолетовом и видимом (УФ-видимом) диапазонах регистрировали на спектрофотометре УФ-видимого диапазона UV2550 (Shimadzu, Киото, Япония). Инфракрасные спектры с преобразованием Фурье (FTIR) регистрировали с помощью FTIR-спектрометра (BRUKER VERTEX 70, Ettlingen, Germany). Порошковая дифракция рентгеновских лучей (XRD) наносфер регистрировалась на рентгеновском дифрактометре (Seifert Jso-Debyerex-2002, Германия). Содержание Мо в клетках и тканях измеряли с помощью атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-AES, Hitachi P4010, Япония). Во время облучения БИК изменение температуры регистрировалось каждые 30 с с помощью термопарного термометра (Fluke, США).

Культура клеток и клеточное поглощение

Клетки 4T1 опухоли молочной железы мыши были приобретены из Американской коллекции типовых культур (ATCC) и культивированы в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина при 37 ° C с 5% CO ₂ .

Для клеточного поглощения использовали FITC для маркировки NS посредством физического поглощения. Клетки 4T1 прикреплялись к предметным стеклам в 6-луночных планшетах и ​​инкубировались со свободным FITC, MoSe ₂ @BSA NS, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + FA и FA-MoSe ₂ @BSA NS при той же концентрации FITC (0,05 мг / мл) в течение 3 ч соответственно. Затем клетки трижды промывали PBS и фиксировали 0,2 мл глутарового альдегида с последующим окрашиванием DAPI в течение 10 мин. Флуоресцентные изображения клеток получали с помощью лазерного сканирующего микроскопа. Для дальнейшего наблюдения за клеточным захватом клетки 4T1 (2 × 10 ⁵ клеток / лунку) культивировали в 6-луночном планшете для культивирования клеток в течение 24 часов, а затем инкубировали с MoSe ₂ @BSA NS, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + FA и FA-MoSe ₂ @BSA NSs за дополнительные 3 ч. После этого обработанные клетки трижды осторожно промывали PBS, гомогенизировали и обрабатывали 1 мл раствора царской водки в течение 4 часов. ICP-AES использовали для определения содержания Mo внутри клеток. Коэффициент поглощения =\ (\ frac {\ mathrm {Ma}} {\ mathrm {Mb}} \) × 100%, где Ma - это масса Мо внутри клеток, а Mb - это общая масса добавленного Мо.

Биосовместимость in vitro

Во-первых, была собрана цельная кровь здоровых мышей для обнаружения in vitro гемолиза FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Более подробно, красные кровяные тельца (эритроциты) собирали центрифугированием. Отбрасывая супернатанты, собранные эритроциты смешивали с FA-MoSe ₂ . @BSA NS (в PBS, 1:4) в заранее определенных концентрациях (50 мкг / мл, 100 мкг / мл, 150 мкг / мл, 200 мкг / мл и 400 мкг / мл). В качестве положительного или отрицательного контроля эритроциты инкубировали с деионизированной водой или PBS. После инкубирования при 37 ° C в течение 1 ч вышеуказанный набор суспензий центрифугировали (10000 об / мин, 1 мин) и оптическую плотность супернатантов при 541 нм контролировали с помощью спектрометра UV-Vis. Коэффициент гемолиза рассчитывали с использованием следующего уравнения.

где A _т , А _ПК , и A _nc - абсорбция супернатанта при 541 нм тестируемого образца, положительного и отрицательного контролей соответственно.

Кроме того, цитотоксичность MoSe ₂ @BSA NS и FA-MoSe ₂ @BSA NSs выявляли стандартным анализом CCK-8. 4T1 клетки (1 × 10 ⁵ клеток / мл, 0,5 мл) высевали в 96-луночный планшет и культивировали в течение 24 часов. После удаления старых сред, свежие среды, содержащие 0,01, 0,1, 0,15, 0,3 и 0,4 мг / мл MoSe ₂ @BSA NS и FA-MoSe ₂ НС @BSA инкубировали с клетками 4T1 в течение 24 часов. PBS использовали для трехкратной мягкой промывки клеток. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл рабочего раствора CCK-8 (10% CCK-8 + 90% DMEM) с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 1 часа. Величину поглощения при 450 нм определяли с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Labtech, Inc., Дарем, Северная Каролина).

Фототермическая лучевая терапия in vitro

Во-первых, были исследованы фототермические характеристики НС in vitro. MoSe ₂ @BSA NS и FA-MoSe ₂ @BSA NS с такими же концентрациями Mo, культивированные с клетками в течение 3 часов, а затем облученные NIR-излучением в течение 5 минут (808 нм, 1 Вт / см ² ). Температуру обработанных клеток в каждой лунке определяли с помощью инфракрасной тепловой камеры (Fluke TI25, США) соответственно.

Затем для фототермической терапии in vitro прикрепленные клетки 4T1 культивировали с различной концентрацией MoSe ₂ @BSA NS и FA-MoSe ₂ @BSA NS на 3 ч. НС вне ячеек были удалены. Затем клетки обрабатывали NIR или без него (808 нм, 1 Вт / см ² , 5 мин) и различной дозировкой рентгеновского облучения (RT, 0–5 Гр, 0,084 Гр / с). После еще одной 24-часовой инкубации жизнеспособность клеток определяли с помощью стандартного анализа CCK-8. Обработанные выше клетки дополнительно окрашивали кальцеином-AM / PI для обнаружения живых и мертвых клеток, а затем отображали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (кальцеин-AM:Ex =488 нм, Em =515 нм; PI:Ex =535 нм, Em =617 нм). Кроме того, обработанные клетки также анализировали иммунофлуоресценцией γ-H2AX. После обработки, описанной выше, клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 10 минут, пропускали через метанол в течение 15 минут при -20 ° C и промывали PBS. После этого клетки смешивали с блокирующим буфером (1% BSA в растворе PBS) в течение 1 ч при 25 ° C и дополнительно инкубировали с мышиным моноклональным антителом против фосфогистона γ-H2AX (разведение 1:500) в течение ночи при 4 ° C. С. После отмывки PBS флуоресценцию клеток наблюдали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

Модель животного

Голые мыши Balb / c (в возрасте 5–8 недель) были предоставлены лабораториями Charles River (Пекин, Китай). Для создания модели опухоли 4T1 у животных, 150 мкл 10 ⁶ суспензию клеток вводили подкожно в спину мыши. Мышей кормили в помещении для животных и наблюдали каждые 2 дня. Все процедуры благополучия и экспериментальные процедуры в этом исследовании были выполнены в соответствии с политикой Национального министерства здравоохранения и одобрены этическим комитетом Первой народной больницы города Шанцю. Когда объем опухоли достиг 100 мм ³ , мышей использовали для экспериментов in vivo.

Биораспределение и кровообращение in vivo

Системное биораспределение NS было исследовано на мышах с опухолью 4T1. Через 1 час, 1 день, 7 дней и 24 дня после внутривенной инъекции MoSe ₂ @BSA NS и FA-MoSe ₂ @BSA (10 мг / кг), опухоль и основные органы (сердце, печень, селезенка, легкие и почки) взвешивали и переваривали раствором царской водки в течение 12 часов. Содержание Mo и Se в этих тканях анализировали с помощью ICP-AES. Кроме того, здоровым мышам Balb / c внутривенно вводили FA-MoSe ₂ @BSA (10 мг / кг). Приблизительно 10 мкл крови из хвоста мышей было собрано и проанализировано с помощью ICP-AES на предмет кровообращения.

Фототермическая лучевая терапия in vivo

Для фототермической лучевой терапии in vivo мыши с опухолями ( n =5 на группу) обрабатывали PBS + NIR, PBS + RT, MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR и FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT (с 5 мг / кг MoSe ₂ ). Доза лучевой терапии составила 5 Гр. Через 24 часа после внутривенной инъекции область опухоли облучали 5-минутным БИК-излучением (808 нм, 1 Вт / см ² ). Во время облучения тепловые изображения мышей регистрировались инфракрасной тепловизионной камерой. В последующие 30 дней длину и ширину опухоли контролировали каждые 4 дня. Относительный объем опухоли был рассчитан как V / V ₀ , где V ₀ представляет объем опухоли на момент начала лечения. Между тем, массу тела каждой мыши также контролировали каждые 4 дня.

Биосовместимость in vivo

Для биосовместимости in vivo 150 мкл FA-MoSe ₂ НС @BSA (15 мг / кг) внутривенно вводили здоровым голым мышам Balb / c. Перед инъекцией и через 30 дней кровь собирали для анализа крови, включая лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC), гемоглобин (HGB), средний объем тромбоцитов (MPV), средний корпускулярный гемоглобин (MCH), гематокрит (HCT), средняя концентрация корпускулярного гемоглобина (MCHC), средний корпускулярный объем (MCV) и тромбоциты (PLT). В то же время мышей умерщвляли и собирали сердце, печень, селезенку, легкие и почки. Полученные органы фиксировали 4% параформальдегидом, разрезали на срезы размером 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Окрашенные срезы визуализировали с помощью цифрового микроскопа.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Двусторонний студент t Тест был использован для анализа статистической значимости двух групп. Различия считались значимыми для * P <0,05 и очень значимо для ** P <0,01.

Результаты и обсуждение

Подготовка и характеристика FA-MoSe ₂ @BSA NS

Процедура подготовки FA-MoSe ₂ НС @BSA изображен на рис. 1а. Вкратце, нестабильный MoSe ₂ наноточки были приготовлены из объемного MoSe ₂ под воздействием ультразвука, затем стабилизируется и собирается белком BSA и одновременно конъюгируется с целевой молекулой FA через «мостики» PEG. Подготовленный MoSe ₂ НА представляли собой сверхмалые наноточки, как это видно на ПЭМ (рис. 1b). Рентгенограмма MoSe ₂ ND были показаны в Дополнительном файле 1:Рисунок S1. Дифракционный пик при 13,1 ° принадлежит плоскости (002), что соответствует положению пика объемного MoSe ₂ . Отчетливый пик (002) указывает на существование нескольких слоев на оси c MoSe ₂ NDs. Дифракционный пик плоскости (100) для MoSe ₂ НА значительно расширяется по сравнению с массивным MoSe ₂ , что может быть связано с уменьшением размера MoSe ₂ НД [23]. После сборки и конъюгации с белком BSA и FA нанокомпозиты образовали сферические частицы (рис. 1c). Спектры FTIR показали наличие связи –CONH- в FA-MoSe ₂ @BSA NS, что указывает на то, что FA, вероятно, был конъюгирован с MoSe ₂ через сложноэфирную связь (дополнительный файл 1:Рисунок S2). Кроме того, мы количественно определили FA на FA-MoSe ₂ @BSA, что составило 10,5 ± 0,11%. Анализ DLS показал, что средний диаметр MoSe ₂ НК и FA-MoSe ₂ НЧ @BSA имели размер приблизительно 3,8 нм и 139,8 нм, соответственно (рис. 1d). После 7 дней хранения размер MoSe ₂ НА увеличились с 3,8 до 63,2 нм, а FA-MoSe ₂ НС @BSA не показали очевидных изменений в размере (рис. 1e), что указывает на агрегацию и низкую стабильность MoSe ₂ НД на длительном хранении. Кроме того, при диспергировании в различных средах, таких как вода, PBS и клеточная среда, FA-MoSe ₂ НС @BSA показали аналогичное распределение по размерам (рис. 1е). Эти результаты показали, что FA-MoSe ₂ НС @BSA стабильны в физиологических условиях, и это улучшает стабильность MoSe ₂ ND, вероятно, приписывают сборке BSA и покрытию PEG [24, 25]. Как показано на рис. 1g, спектры ультрафиолетовой и видимой (УФ-видимой) области MoSe ₂ НК и FA-MoSe ₂ НС @BSA имели аналогичные высокие характеристики поглощения в ближнем ИК-диапазоне, что указывает на то, что модификации BSA и FA не влияли на поглощение MoSe ₂ .

а Схема FA-MoSe ₂ Синтез ЯП @BSA . б ТЕМ изображение MoSe ₂ NDs. На вставке было ПЭМ-изображение высокого разрешения. c Изображения FA-MoSe ₂ , полученные с помощью ПЭМ и СЭМ @BSA NSs. г Распределение по размерам MoSe ₂ НК и FA-MoSe ₂ @BSA NSs. е Изменение размера MoSe ₂ НК и FA-MoSe ₂ @BSA NSs в воде более 7 дней. е Распределение по размерам FA-MoSe ₂ @BSA NSs в воде, PBS и среде соответственно. г Спектры поглощения MoSe ₂ НК и FA-MoSe ₂ @BSA NS

Фототермический эффект FA-MoSe ₂ @BSA NS

На рис. 2а показано, что температура FA-MoSe ₂ Раствор НП @BSA увеличивался с увеличением концентрации (0–200 мкг / мл). После БИК-излучения (808 нм, 1 Вт / см ² ) в течение 5 мин изменение температуры FA-MoSe ₂ Раствор НС @BSA при 200 мкг / мл достигал приблизительно 41 ° C, в то время как температура чистой воды увеличивалась только приблизительно на 1,5 ° C при тех же условиях. Кроме того, изменение температуры FA-MoSe ₂ НС @BSA, облученные при различной мощности (0,5–2,0 Вт / см ² ) в течение 5 мин. Как показано на рис. 2b, температура увеличивалась до максимума 40,6 ° C с увеличением интенсивности лазерной мощности. На рисунке 2c изображена фотостабильность FA-MoSe ₂ . @BSA NSs, подразумевая, что FA-MoSe ₂ НС @BSA сохранили свои прекрасные фототермические эффекты без какого-либо ослабления повышения температуры после трех циклов облучения в ближней инфракрасной области. Эти результаты показали, что FA-MoSe ₂ НС @BSA обладают значительной фотостабильностью и отличными фототермическими свойствами. Как показано на рис. 2d, значения единиц Хаунсфилда (HU) FA-MoSe ₂ Изображения НП @BSA, полученные с помощью компьютерной томографии (КТ), положительно коррелировали с их концентрацией, что указывает на то, что НП потенциально могут использоваться в качестве радиосенсибилизатора.

а Кривые фототермического нагрева FA-MoSe ₂ Раствор НС @BSA в различных концентрациях (0, 50, 100 и 200 мкг / мл) при лазерном облучении 808 нм при плотности мощности 1 Вт / см ² . б Кривые фототермического нагрева FA-MoSe ₂ Раствор @BSA NSs в концентрации 100 мкг / мл под воздействием лазерного излучения с длиной волны 808 нм и различной плотностью мощности (0,5, 1, 1,5 и 2 Вт / см ² ). c Температурные колебания FA-MoSe ₂ @BSA NSs при трех циклах облучения лазером 808 нм при плотности мощности 1 Вт / см ² . г КТ-изображения (вставка) и значения HU FA-MoSe ₂ @BSA NSs с разными концентрациями

Поглощение клетками и биосовместимость in vitro

Для оценки клеточного поглощения MoSe ₂ @BSA NS и FA-MoSe ₂ НС @BSA были помечены FITC. Как показано на рис. 3а, внутри цитоплазмы в FA-MoSe ₂ наблюдалась гораздо более сильная флуоресценция FITC. Клетки, обработанные @BSA NSs, по сравнению с клетками MoSe ₂ @BSA NSs- и клетки, обработанные свободным FITC. Количественный анализ ICP-AES показал более высокое клеточное поглощение FA-MoSe ₂ @BSA NS, чем MoSe ₂ НС @BSA (рис. 3б). Эти результаты продемонстрировали, что ЖК усиливает поглощение клетками FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Интересно, что после блокировки FA, FA-MoSe ₂ Клетки, обработанные @BSA NSs, показали более слабую зеленую флуоресценцию FITC внутри цитоплазмы по сравнению с клетками без блокировки FA. Соответственно, скорость поглощения клетками FA-MoSe ₂ @BSA NSs + FA-обработанные клетки меньше, чем у FA-MoSe ₂ Клетки, обработанные @BSA NSs. Это указывает на то, что рецептор FA на клеточной мембране затруднен (свободным FA), в свою очередь, снижает способность нацеливания и доступность FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Это также демонстрирует, что рецептор FA сверхэкспрессируется в клетках 4T1 и НП FA-MoSe2 @ BSA проникают в клетки, вероятно, через рецептор-опосредованный путь эндоцитоза [26, 27].

а Конфокальные флуоресцентные изображения клеток 4T1 после инкубации со свободным FITC и FITC-меченным MoSe ₂ @BSA NS, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + блокировка FA и FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Красный и синий цвета представляют собой ядра клеток, окрашенные флуоресценцией FITC и DAPI, соответственно. б Количественный анализ ICP-AES клеток 4T1 в отношении MoSe ₂ @BSA NS, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + блокировка FA и FA-MoSe ₂ @BSA NS

Биосовместимость НС in vitro оценивали с помощью анализов гемолиза и цитотоксичности. Рисунок 4a не показал очевидного гемолиза для FA-MoSe ₂ . Эритроциты (RBC), обработанные @BSA NSs, или RBC, обработанные PBS. Более того, при концентрациях до 0,4 мг / мл MoSe ₂ @BSA NS и FA-MoSe ₂ НС @BSA инкубировали с клетками в течение 24 ч, подавление жизнеспособности было менее 10%. Эти результаты свидетельствуют о том, что FA-MoSe ₂ НС @BSA обладают отличной биосовместимостью in vitro.

а Коэффициент гемолиза эритроцитов после 1-часовой инкубации с FA-MoSe ₂ @BSA NSs в различных концентрациях. На вставке показана фотография эритроцитов, подвергшихся воздействию дистиллированной воды, PBS и FA-MoSe ₂ . @BSA NS с разными концентрациями с последующим центрифугированием. б Жизнеспособность клеток 4T1 после обработки по отношению к MoSe ₂ @BSA NS и FA-MoSe ₂ @BSA NSs в различных концентрациях в течение 24 ч

Фототермальная лучевая терапия in vitro

Как показано на рис. 5a, b, клетки, обработанные FA-MoSe ₂ НС @BSA показали наибольшее повышение температуры (ΔT =23,6 ° C) после 5 минут БИК-излучения (808 нм, 1 Вт / см ² ) по сравнению с MoSe ₂ Клетки, обработанные @BSA NSs и PBS. На рисунке 5c показано повышение эффективности RT за счет добавления FA-MoSe ₂ . @BSA NSs. С увеличением доз рентгеновского излучения эффективность FA-MoSe ₂ при ЛТ АНБ @BSA улучшили гораздо больше, чем у MoSe ₂ @BSA NSs. Было продемонстрировано, что FA-MoSe ₂ НС @BSA могут усиливать эффект лучевой терапии, вероятно, из-за их способности ослаблять рентгеновское излучение, которое может концентрировать энергию рентгеновского излучения внутри опухолевых клеток и генерировать вторичные оже-электроны, что приводит к повреждению ДНК и подавлению роста клеток [28, 29]. / P>

а Тепловизионные изображения PBS, MoSe ₂ @BSA NS и FA-MoSe ₂ Клетки, обработанные NSA @BSA, и b соответствующие кривые изменения температуры при непрерывном облучении лазером с длиной волны 808 нм (1 Вт / см ² ). c Жизнеспособность 4 клеток Т1, обработанных PBS, MoSe ₂ @BSA NS и FA-MoSe ₂ НС @BSA в сочетании с различной дозой рентгеновского облучения (0–5 Гр). г Жизнеспособность клеток 4T1, обработанных различными образцами под 808 нм NIR-лазером (5 мин, 1 Вт / см ² ) и рентгеновское (5 Гр) облучение

Для дальнейшей оценки комбинированного терапевтического эффекта RT и PTT клетки 4T1 обрабатывали только NIR или RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR или FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT. Как показано на рис. 5d, FA-MoSe ₂ Группа, обработанная @BSA NS + NIR + RT, показала наиболее значительную зависимую от концентрации гибель клеток со степенью подавления 92,8%. Превосходный лечебный эффект FA-MoSe ₂ @BSA NSs, вероятно, были вызваны (1) фототермической абляцией PTT и повреждением ДНК ОТ FA-MoSe ₂ @BSA NS и (2) нацеливание на FA усилило интернализацию FA-MoSe в клетке ₂ @BSA NSs и, следовательно, генерация большего количества тепла и рентгеновских лучей для уничтожения клеток.

Как показано на фиг. 6a, несколько мертвых клеток можно было наблюдать в контрольных группах PBS + NIR и PBS + RT. Хотя мертвые клетки были обнаружены в FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT или FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR группы, но живые клетки все еще существовали. И наоборот, в FA-MoSe ₂ Группа @BSA NS + NIR + RT, более 95% клеток были повреждены и показали красную флуоресценцию, что указывает на то, что комбинированная RT и PTT FA-MoSe ₂ НС @BSA могут повысить терапевтическую эффективность.

а Живые-мертвые и б Изображения окрашивания γ-H2AX клеток 4T1, обработанных PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe ₂ @BSA NS, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT и FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT соответственно

Начиная с FA-MoSe ₂ НС @BSA обладают высоким коэффициентом поглощения рентгеновского излучения, поэтому потенциально они могут увеличивать RT. Как показано на фиг. 6b, очень низкие уровни сигналов γ-H2AX наблюдались в группах, обработанных PBS, FA-MoSe ₂ Только NS @BSA и FA-MoSe ₂ @BSA NS + группы, обработанные NIR. Между тем, FA-MoSe ₂ Группа, обработанная @BSA NS + NIR + RT, показала более высокие уровни сигналов γ-H2AX, что указывает на более значительное повреждение ДНК внутри ядер клеток. Эти результаты показали, что FA-MoSe ₂ НС @BSA могут усиливать эффект RT за счет его способности ослаблять рентгеновское излучение, которое концентрирует энергию рентгеновского излучения внутри опухолевых клеток и генерирует вторичные и оже-электроны, вызывая повреждения ДНК и подавляя рост клеток [30–32]. P>

Биораспределение и кровообращение in vivo

Как показано на фиг. 7a, b, через 24 часа после инъекции элементы Mo и Se накапливались в опухоли, за исключением печени и почек. Содержание элементов Mo в опухолевой ткани после инъекции MoSe ₂ @BSA NS и FA-MoSe ₂ Были также оценены NS @BSA. Как показано на рис. 7c, уровни Mo в опухолевой ткани для FA-MoSe ₂ Группа, обработанная @BSA NSs, увеличивалась со временем и достигла пика через 24 часа после инъекции, что было выше, чем у MoSe ₂ Группа, обработанная @BSA NSs. Figure 7d shows the blood circulation curve of Mo at different time point post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs. The Mo t _1/2 α (blood distribution half-life) and t _1/2 β (blood terminal elimination half-life) of the FA-MoSe₂ @BSA NSs group are 0.91 ± 0.06 h and 16.96 ± 1.3 h, respectively. These results were likely due to (1) prolonged blood circulation promoted by PEG and BSA modifications [24, 33], (2) decreased macrophage clearance of nanoparticles by the reticuloendothelial system [34, 35], and (3) facilitated tumor targeting effect by the FA modification and subsequent accumulation in tumor tissues. The tumor optimum accumulation time of FA-MoSe₂ @BSA NSs could guide the in vivo photothermal radiotherapy.

а Мо и b Se elements content of tumor and major organs including heart, liver, spleen, lung, and kidney in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. c Quantitative in vivo analysis of the Mo elements content of the tumor regions in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice as a function of injection time. г Blood circulation curve of Mo at different time points post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs

In Vivo Photothermal Radiotherapy

As shown in Fig. 8a, b, the temperature of the tumor region under NIR irradiation (5 min, 1 W/cm ² ) showed about 22.1 °C increase at 24-h post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs, compared with that of PBS- or MoSe₂ @BSA NSs-treated groups. This indicated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have excellent photothermal effect in vivo. As shown in Fig. 8c, no distinct weight changes were observed in the control or any of the treated Balb/c mice during the 30-day treatment duration, demonstrating that the treatments did not affect the health of these mice. Next, 4T1-tumor-bearing mice were randomly divided into six groups. Group 1:NIR; group 2:RT; group 3:FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT; group 4:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR; group 5:MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT; and group 6:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT. Then, 5 mg/kg of MoSe₂ was used in all groups. The radiotherapy dose was 5 Gy, and the dose rate is 0.084 Gy/s. At 24-h intravenous post injection, tumor region was irradiated by 5 min NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm ² ). The tumor sizes were closely monitored afterward (Fig. 8d). Compared to other groups, the most remarkable tumor growth inhibition was observed in group 6 after the combined photothermal-radiotherapy with FA-MoSe₂ @BSA NSs, achieving an obvious synergistic therapeutic outcome in comparison to PTT alone or RT alone delivered by FA-MoSe₂ @BSA NSs (Fig. 8d).

а In vivo thermal images of mouse after intravenous injection of saline, MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs and durations NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm ² ). б The corresponding temperature change curves of tumor regions in mice. c The weight and d relative tumor volume profile of 4T1 xenografted tumors after intravenous injection of PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, and FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, respectively. ** P  < 0.01 vs control group and other groups

In Vivo Biocompatibility

As a kind of nanoagent for in vivo biomedical applications, their potential toxic side effect is something that always requires particular attention. In addition to the body weight data of mice in different groups post various treatments in Fig. 8c, the H&E staining images of major organs and complete blood panel assays were provided to evaluate the safety of the FA-MoSe₂ @BSA NSs. As shown using H&E staining in Fig. 9a, no apparent pathological tissue damage or abnormality in major organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) was observed in FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. Moreover, as illustrated in Fig. 9b, the parameters of WBC, RBC, HGB, MCH, HCT, MCHC, MCV, and PLT for FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice were within the normal range. These results demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited low toxicity and excellent in vivo biocompatibility.

а H&E-stained tissue sections of major organs, including the heart, liver, spleen, lung, and kidney from mice treated with FA-MoSe₂ @BSA NSs at day 0 and day 30 (scale bar = 100 μm). б Blood biochemistry of mice at days 0 and 30 post-treatment with FA-MoSe₂ @BSA NSs

Выводы

In summary, MoSe2 NDs was first prepared by ultrasonication, and MoSe₂ @BSA nanospheres was then successfully synthesized via a simple BSA self-assembly method. The BSA surface provided a rich modifiable functional group that readily conjugated FA molecules, enabling the synthesis of versatile FA-MoSe₂ @BSA NSs which showed outstanding physiological stability and excellent tumor targeting effect. Due to the strong radio-sensitization ability and high NIR absorption of MoSe₂ NDs, FA-MoSe₂ @BSA NSs could be used as a photothermal agent for NIR-induced tumor ablation, and act as a radio-sensitizer to enhance the efficacy of RT. In vitro and in vivo experiments verified that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited high cytotoxicity under NIR and X-ray irradiation, contributing to remarkably enhanced therapeutic effect in the tumor-targeted combined photothermal-radiotherapy. Most importantly, it was demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have great biocompability in vitro and in vivo, encouraging further biomedical or clinic applications. Therefore, considering all the above desirable characteristics, the FA-MoSe₂ @BSA NSs with highly integrated functionalities is promising for applications in cancer therapy.

Сокращения

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

FA:

Фолиевая кислота

MoSe₂ :

Molybdenum selenide

NDs:

Nanodots

NIR:

Ближний инфракрасный порт

NSs:

Nanospheres

PEG:

Полиэтиленгликоль

PTT:

Фототермическая терапия

RT:

Radiotherapy