Наногели, запускаемые двойным стимулом, в ответ на изменения температуры и pH для контролируемого высвобождения лекарства

Введение

Чувствительные к стимулам наноносители обычно разрабатывались как системы доставки лекарств для терапии, визуализации и диагностики [1, 2]. В последнее время различные стимулы, включая pH, температуру, биомолекулы, окислительно-восстановительный потенциал, магнитное поле и ультрафиолетовый свет, были использованы для индукции длительного или контролируемого высвобождения лекарства посредством внутренней или внешней активации [3,4,5,6]. Среди этих стимулов pH и температура являются наиболее известными модальностями в системах доставки и высвобождения лекарств. Поли- N -изопропилакриламид (PNIPAM) представляет собой типичный термочувствительный полимер, который используется в резервуарах для лекарств и системах высвобождения. Этот термочувствительный полимер обладает способностью изменять свое фазовое поведение, проявляя набухшее состояние из-за образования водородных связей между водой и амидными функциональными группами при более низкой критической температуре раствора (НКТР) и, наоборот, демонстрируя сжатие полимерной сетки за счет гидрофобных взаимодействий выше температуры LCST [7,8,9]. Более того, LCST обычно можно контролировать с помощью комплексообразующего отношения акриловой кислоты (AAc) или акрилового амида, связанного с PNIPAM [10, 11]. В частности, AAc может совершать два фазовых перехода при смещении НКТР в область более высоких температур [12, 13]. Наногели PNIPAM-co-AAc начинают сжиматься выше НКТР из-за гидрофобных взаимодействий [14, 15]. Однако депротонирование карбоксильных групп в AAc вызывает увеличение диаметра наногеля из-за межэлектронного отталкивания и повышенного осмотического давления [16,17,18].

Системы доставки лекарств, опосредованные PNIPAM, были разработаны для различных приложений в биомедицинских областях. Чувствительные к температуре или pH наногели PNIPAM использовались для оптимизации процесса адсорбции и доставки лекарств благодаря свойству обратимого фазового перехода [19,20,21,22]. В частности, сообщалось, что значения pH в различных тканях рассматриваются для пероральной доставки, хотя в разных тканях наблюдаются более тонкие изменения [23,24,25,26]. На сегодняшний день интеллектуальные биоматериалы, которые могут генерировать совместную реакцию на множественные стимулы, такие как pH и температура, продемонстрировали преимущества по сравнению с системами, чувствительными к одному стимулу [27,28,29]. Изменение гидрофильности, вызванное температурной чувствительностью, которая может происходить самопроизвольно при pH окружающей среды, также может играть важную роль в чувствительности к pH наряду с характеристиками НКТР сополимеров и гелей.

β-лапахон (β-LP), природное соединение, проявил терапевтическую активность при лечении рака [30]. В биомедицине функционализированные носители β-LP были разработаны с целью минимизировать его токсические эффекты. Различные носители для доставки β-LP были разработаны с использованием золота, оксида графена и PNIPAM [31, 32]. На сегодняшний день PNIPAM, нагруженный β-LP, применяется для химиотерапевтических схем при раке печени, груди, простаты и толстой кишки [33,34,35,36]. Хотя несколько носителей β-LP были изучены, относительно сложные процедуры приготовления были неконтролируемыми или спонтанное высвобождение β-LP частично ограничивало их эффективность. Таким образом, разработка эффективных носителей β-LP для биомедицинских приложений по-прежнему остается важной задачей.

Здесь мы разработали двунаправленную систему с контролируемым высвобождением, используя термочувствительные и pH-чувствительные свойства PNIPAM. Эта система доставки лекарств состоит из наногеля PNIPAM, сополимеризованного с содержанием AAc, образующего наногель PNIPAM-co-AAc. Мы описали схематическое изображение стратегии самосборки, загрузки лекарственного средства и высвобождения наногеля PNIPAM-co-AAc (схема 1). β-LP, модельное лекарство, загружали в наногели PNIPAM-co-AAc посредством гидрофобных взаимодействий. Высвобождение β-LP нагруженными наногелями PNIPAM-co-AAc можно эффективно контролировать с помощью температуры и pH. Наногели PNIPAM-co-AAc показали эффективное антипролиферативное свойство в фибробластах с основным pH при температуре тела. β-LP, загруженный в наногели, обеспечивает значительную терапевтическую эффективность благодаря термо- и pH-чувствительной структуре, поэтому наногель, модифицированный PNIPAM, может быть хорошим кандидатом для доставки лекарств и лечения опухолей, реагирующих на раздражители.

Схематическое изображение двойного контролируемого высвобождения лекарственного средства гидрогелей PNIPAM-co-AAc в зависимости от температуры и pH

Методы

Материалы

НИПАМ (97%, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) сушили в вакууме при комнатной температуре. N , N ′ -Метиленбисакриламид (MBA), AAc, дистиллированная вода, этиловый спирт (EtOH), персульфат калия (KPS) (98%, Dae Jung, Корея), β-LP (Natural Products, Корея) и фосфатно-солевой буфер (PBS ) были аналитической чистоты и использовались без дополнительной очистки.

Синтез наногеля PNIPAM-co-AAc

Наногель PNIPAM-co-AAc был синтезирован согласно предыдущим сообщениям [37]. В трехгорлую круглодонную колбу на 500 мл добавляли 2,26 г мономера НИПАМ, 0,154 г МБА в качестве сшивающего агента и 0 г, 0,036 г, 0,077 г, 0,145 г AAc в 200 мл дистиллированной воды и затем растворяли. путем перемешивания магнитной балкой в ​​течение 30 мин при 75 ° C с последующим синтезом PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10 и PNIPAM-co-AAc20, соответственно. Кислород удаляли из смеси продувкой азотом. Для инициирования реакции к раствору добавляли 37,5 мг KPS в качестве инициатора и затем перемешивали. Обратный конденсатор использовался для предотвращения испарения раствора из-за высокой температуры. Раствор стал мутным через 10 мин после добавления КПС. Для удаления непрореагировавших мономеров его диализовали с помощью диализной трубки (12–14 кДа) в течение 7 дней. Дистиллированную воду, используемую для диализа, меняли ежедневно. Полученные материалы замораживали в жидком азоте и лиофилизировали в течение 3 дней с получением высушенного наногеля PNIPAM-co-AAc.

Загрузка β-LP в PNIPAM-co-AAc

Один миллиграмм синтезированного наногеля PNIPAM-co-AAc растворяли в 1 мл этанола и к растворенному PNIPAM-co-AAc добавляли 0,1 мг β-LP. Смесь интенсивно перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение ночи. После перемешивания неинкапсулированный β-LP подвергали диализу с помощью диализной трубки (6–8 кДа). Диализованный наногель замораживали в жидком азоте и лиофилизировали в течение 3 дней. Затем в диализную трубку вводили 1 мл β-LP, инкапсулированного PNIPAM-co-AAc (6–8 кДа). Чтобы предотвратить потерю раствора, конец трубки герметизировали. После добавления 10 мл этанола подготовленные диализные трубки погружали в раствор PBS.

Характеристика PNIPAM-co-AAc

Морфологию определяли с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и автоэмиссионной сканирующей электронной микроскопии (FE-SEM). Вкратце, после того, как наногели PNIPAM-co-AAc были достаточно диспергированы с помощью обработки ультразвуком, дисперсии капают на медные сетки 300 меш (Electron Microscopy Science, PA, USA) и выпариваются в течение ночи. Затем были получены ПЭМ-изображения при ускоряющем напряжении 200 кВ (JEM2100F, JEOL Ltd., Япония). СЭМ-микрофотографии сканировали при ускоряющем напряжении электронов 15 кВ (JSM-7100F, JEOL USA). Спектры получали на инфракрасном спектрометре с преобразованием Фурье (FT-IR, Nicolet 6700, Япония). Загрузку β-LP и количество, высвободившееся из наногелей, рассчитывали с помощью спектрометра UV-Vis (UV-1800, Shimadzu, Япония). Для подтверждения НКТР наногель был точно измерен с интервалом в 1 ° C на предмет изменений размера и поверхностного заряда наногелей с использованием динамического рассеяния света (DLS) (ELS-2000ZS, Otsuka Electronics, Япония).

Свойства высвобождения лекарства из PNIPAM-co-AAc

Для изучения поведения высвобождения β-LP 10 мл наногелей, нагруженных β-LP, переносили в диализную трубку (3,5 кДа), которую затем перемешивали при комнатной температуре и 37 ° C в PBS. Через определенное время высвобождения (0–12 ч) 2 мл образца в каждом растворе смеси анализировали с помощью спектрометра УФ – видимой области. В спектрометре UV-Vis базовая линия была установлена ​​на уровне 200-800 нм с PBS при pH 2, 4, 7,4 и 8, и 2 мл высвободившегося β-LP, содержащегося в растворе PBS, были добавлены в кювету.

Активность по высвобождению лекарств с помощью температурных и pH-стимулов

Двойной эффект на жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ). Клетки фибробластов NIH3T3 высевали в 96-луночные планшеты (2 × 10 ⁴ клеток / лунку) и культивировали в течение ночи при 37 ° C. Затем среду заменяли свежей средой, содержащей свободный β-LP, PNIPAM-co-AAc5 и PNIPAM-co-AAc20, включая β-LP в различных концентрациях. После инкубации в течение 3 ч в каждую лунку добавляли раствор МТТ и инкубировали в течение 4 ч. Затем культуральную среду удаляли с последующей обработкой солюбилизирующим раствором. Значения поглощения при 595 нм измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов (EL800, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Изображения живой / мертвой флуоресценции были получены с помощью флуоресцентного микроскопа (IX37, Olympus, Япония). Клетки NIH3T3 (1,5 × 10 ⁵ клеток / лунку) высевали в 8-луночный μ-слайд (там же, Мюнхен, Германия) и культивировали в течение ночи. После замены культуральной среды в лунки добавляли 20 мкг / мл свободного β-лапахона, PNIPAM-co-AAc5 и PNIPAM-co-AAc20, включая β-LP, диспергированные в культуральной среде. После инкубации в течение 3 или 6 часов клетки промывали и оценивали жизнеспособность клеток с помощью анализа жизнеспособности / цитотоксичности LIVE / DEAD® (Molecular Probes, Юджин, штат Орегон).

Результаты и обсуждение

Приготовление наногелей PNIPAM-co-AAc

Наногели PNIPAM-co-AAc с тремя различными содержаниями AAc (5, 10 и 20%) были изготовлены методом радикальной полимеризации. ПЭМ и СЭМ использовались для подтверждения размера частиц, морфологии и монодисперсности наногелей. Как показано на фиг. 1a и b, наногель PNIPAM-co-AAc5 показал относительно однородное распределение по размерам со средним диаметром частиц приблизительно 250 нм. Кроме того, при повышении температуры наблюдался золь-гель переход наногелей на основе ПНИПАМ. Хотя водные растворы PNIPAM-co-AAc5 сохранялись в виде фазы золя при комнатной температуре, наногель переходил в фазу геля при нагревании, в результате чего раствор становился мутным выше НКТР (рис. 1c). Дзета-потенциалы PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10 и PNIPAM-co-AAc20 снизились до - 13,56 мВ, - 16,61 мВ, - 21,87 мВ и - 23,62 мВ из-за увеличения площади поверхности. карбоксильные группы, обеспечиваемые содержанием AAc (рис. 1d). Он также показал, что гидродинамический диаметр PNIPAM-co-AAc находится в диапазоне 217–442 нм, когда содержание AAc увеличивается до 30 ° C из-за увеличения водородных связей с водой и межэлектронного отталкивания. Однако диаметр наногелей уменьшался при 50 ° C из-за гидрофобных взаимодействий (рис. 1д). Эти результаты предполагают, что PNIPAM-co-AAc может различаться по размеру в зависимости от количества AAc, связанного с PNIPAM, и температуры. Состав наногеля был дополнительно охарактеризован с помощью ИК-Фурье спектроскопии, как показано на рис. 2. 1100 см ^-1 ~ 1200 см ⁻¹ пик указывает на изгиб C-N. Спектры также отображали -CH ₂ пик растягивающих колебаний при 1300 см ⁻¹ ~ 1400 см ⁻¹ . Дополнительный пик на 1600 см ⁻¹ ~ 1700 см ⁻¹ был отнесен к C =O, который принадлежит NIPAM. В частности, растяжение карбоновой кислоты (-COOH) проявлялось при 1700 см ^-1 ~ 1800 см ⁻¹ кроме наногеля ПНИПАМ. Широкий пик на 3200 см ⁻¹ ~ 3300 см ⁻¹ показали поглощение растяжения N-H. Следовательно, производные наногеля PNIPAM, состоящие из различных соотношений компонентов PNIPAM и AAc, имеют разные характеристики из-за разного содержания AAc.

а ТЕА и б СЭМ-изображение наногелей PNIPAM-co-AAc5. c Внешний вид наногелей PNIPAM-co-AAc5. Масштабные линейки - 500 нм. г Дзета-потенциалы и е средние диаметры, измеренные при 30 ° C и 50 ° C с помощью DLS для PNIPAM с содержанием AAc 0%, 5%, 10% и 20% при pH 7,4

ИК-Фурье спектры PNIPAM с содержанием AAc 0%, 5%, 10% и 20%

Характеристики чувствительности к температуре

Для исследования температурного поведения распределение наногелей PNIPAM-co-AAc по размерам было оценено методом DLS. Изменение гидродинамического диаметра измеряли в диапазоне температур от 30 до 50 ° C для определения НКТР. PNIPAM с содержанием AAc 5%, 10% и 20% имел две отдельные стадии перехода (рис. 3). Производные PNIPAM-co-AAc начинали первую стадию перехода при 30 ° C, а затем вступали во вторую стадию перехода около 40 ° C. Более того, температура второго перехода имела тенденцию к увеличению с увеличением содержания AAc в PNIPAM. Следовательно, LCST PNIPAM-co-AAc20 находился при относительно высокой температуре 45 ° C, в то время как температура PNIPAM составляла 32 ° C. Эта разница в значениях LCST может быть вызвана повышенным отрицательным зарядом производных PNIPAM-co-AAc. Однако температуры НКТР PNIPAM-co-AAc5 и PNIPAM-co-AAc10 были почти идентичны при 37 ° C и 39 ° C соответственно. Следовательно, PNIPAM-co-AAc10 в дальнейшем не использовался для оценки эффективности высвобождения лекарственного средства. Значения LCST, полученные в производных PNIPAM-co-AAc, были аналогичны предыдущему исследованию [37]. Эти результаты продемонстрировали, что наногели PNIPAM-co-AAc имеют два фазовых перехода и НКТР PNIPAM, содержащего AAc, смещены в сторону более высокой температуры из-за гидрофобных взаимодействий от межфазных цепей PNIPAM и межэлектронного отталкивания через карбоксильные группы AAc.

Температурная зависимость гидродинамических диаметров а ПНИПАМ, b PNIPAM-co-AAc5, c PNIPAM-co-AAc10 и d Наногели PNIPAM-co-AAc20 при pH 7,4

Эффективность двойного контролируемого высвобождения лекарства

Для сравнения профилей высвобождения лекарственного средства PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5 и PNIPAM-co-AAc20, β-LP, высвобождаемый производными PNIPAM-co-AAc, измеряли в течение 6-часового периода при комнатной температуре (24 ° C). и температура тела (37 ° C). Первоначально мы измерили спектры поглощения в УФ-видимой области для PNIPAM-co-AAc20 и PNIPAM-co-AAc20, включая β-LP, и наблюдали сильное поглощение при 257 нм, соответствующее β-LP (дополнительный файл 1:Рисунок S1). Емкость загрузки лекарственного средства β-LP, нагруженного PNIPAM-co-AAc20, составила около 60% с использованием стандартной калибровочной кривой концентрация-абсорбция β-LP (дополнительный файл 2:Рисунок S2) [38, 39]. Как показано на рис. 4, совокупный процент лекарственного средства, высвобождаемого из производных PNIPAM-co-AAc, показал, что количество β-LP, высвобождаемое из PNIPAM-co-AAc20, было относительно ниже, а его эффективность высвобождения была значительно снижена по сравнению с PNIPAM и PNIPAM. -co-AAc5 при обеих температурах. Однако точки высвобождения насыщенного лекарственного средства для большинства производных PNIPAM-co-AAc наблюдались после лечения в течение 2 часов. В частности, на эффективность высвобождения лекарства из наногелей PNIPAM сильно влияла температура реакции. Производные PNIPAM-co-AAc показали улучшенную эффективность высвобождения лекарственного средства при температуре тела по сравнению с таковой при комнатной температуре. Этот результат также подтверждается значительно более высоким кумулятивным высвобождением лекарственного средства всех производных PNIPAM, когда температура реакции превышает 40 ° C (дополнительный файл 3:Рисунок S3).

Кумулятивное высвобождение β-LP из наногелей PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5 и PNIPAM-co-AAc20 при температурах a комнатная температура (24 ° C) и b температура тела (37 ° C) и pH 7,4

Как показано на рис. 4 и в таблице 1, наногели PNIPAM-co-AAc при высокой температуре могут легко высвобождать лекарство из-за их значительной усадки. Кроме того, самая высокая эффективность высвобождения лекарственного средства при температуре тела наблюдалась у PNIPAM, а второй по эффективности был PNIPAM-co-AAc5. Оба имеют относительно низкое содержание AAc, что приводит к снижению температуры НКТР. В частности, мы наблюдали, что β-LP в PNIPAM-co-AAc20 высвобождается с относительно более низкой эффективностью (61%) при температуре тела, в то время как в других наногелях примерно 80% β-LP высвобождается при той же температуре. Эти результаты показали, что PNIPAM-co-AAc20 показал минимальное высвобождение лекарственного средства при температуре тела при максимально возможной инкапсуляции по сравнению с PNIPAM и другим PNIPAM-co-AAc5. Кроме того, эти результаты также согласуются с зависимыми от температуры изменениями в измерении размера производных PNIPAM для определения значений LCST.

Затем мы оценили, может ли PNIPAM-co-AAc20 контролировать высвобождение лекарства через другой фактор, на который PNIPAM реагирует, pH, с максимальным захватом лекарства при температуре тела. PNIPAM-co-AAc20 показал примерно 70% кумулятивной максимальной эффективности высвобождения, увеличиваясь примерно на 10% при pH 8 по сравнению с кислым или нейтральным pH. Между тем, не наблюдалось значительной разницы между pH 7,4 и кислым pH (рис. 5 и таблица 2). Взятые вместе, эти результаты показывают, что профиль высвобождения лекарственного средства PNIPAM-co-AAc20 может зависеть от контроля содержания AAc, и этот наногель с двойным контролируемым высвобождением лекарственного средства может эффективно модулировать скорость высвобождения лекарственного средства при основных значениях pH, которые, как известно, являются присутствует в частях тонкого кишечника [40].

Кумулятивное высвобождение β-LP из наногелей PNIPAM-co-AAc20 при различных значениях pH

Оценка свойств высвобождения лекарств

Антипролиферация in vitro была оценена по ключевому критерию наноматериалов, предназначенных для контролируемой доставки и высвобождения лекарств. Как показано на фиг. 6, свободный β-LP показал более низкую жизнеспособность клеток, чем наногели PNIPAM-co-AAc, нагруженные β-LP для эквивалентных концентраций β-LP. Более того, наногель PNIPAM-co-AAc20 показал относительно высокую жизнеспособность клеток при концентрации 20 мкг / мл, поскольку высвобождение β-LP наногеля PNIPAM-co-AAc20 было относительно низким по сравнению с высвобождением наногеля PNIPAM-co-AAc5 при 37 ° С. Кроме того, этот результат также совпал с кумулятивными профилями высвобождения лекарственного средства. Затем мы оценили жизнеспособность клеток с использованием флуоресцентно окрашенных живых и мертвых клеток (рис. 7). Анализ окрашивания живых / мертвых клеток показал, что наногель β-LP и PNIPAM-co-AAc5, включая β-LP, были сходными по жизнеспособности клеток, в то время как PNIPAM-co-AAc20 показал значительное увеличение жизнеспособности клеток при дозе 20 мкг / мл. после лечения в течение 3 ч. Однако повышенное высвобождение лекарственного средства из PNIPAM-co-AAc20 начало наблюдаться после инкубации при pH 8,0 в течение 3 часов, а значительная синергическая противоопухолевая активность наблюдалась при том же pH в течение 6 часов после обработки. Эти результаты предполагают, что наногель PNIPAM-co-AAc20, реагирующий на температуру и pH, имеет потенциальное применение для контролируемой загрузки и высвобождения лекарств в терминальной части тонкой кишки.

Антипролиферативная активность наногелей PNIPAM-co-AAc, нагруженных β-LP в различных концентрациях, в клетках фибробластов NIH3T3 в течение 3 часов при 37 ° C

Флуоресцентные изображения цитотоксичности в клетках NIH3T3 с a без лечения, b только β-LP, c β-LP / PNIPAM-co-AAc5 и d Обработка β-LP / PNIPAM-co-AAc20 в течение 3 часов при pH 7,4 и обработка β-LP / PNIPAM-co-AAc20 в течение 3 часов ( e ) и 6 часов ( f ) при pH 8,0. Живые и мертвые клетки окрашивают кальцеином AM (зеленый) и гомодимером этидия (красный). Шкала 100 мкм

Выводы

Мы разработали наногели PNIPAM-co-AAc, нагруженные β-LP, высвобождение которых может быть вызвано температурой и pH. Эти производные наногелей были разработаны и получены радикальной сополимеризацией. НКТР повышается с увеличением содержания AAc в наногелях PNIPAM-co-AAc из-за межэлектронного отталкивания между карбоксильными группами на содержании AAc, что приводит к усадке наногелей PNIPAM и последующему высвобождению лекарственного средства. Наногели PNIPAM-co-AAc с высоким содержанием AAc, нагруженные β-LP, показали заметно сниженный профиль высвобождения in vitro при температуре тела. Кроме того, высвобождение лекарственного средства может быть достигнуто с замечательным синергетическим эффектом при щелочном pH. Наконец, мы демонстрируем, что PNIPAM-co-AAc20 обладает оптимальными свойствами, имея пониженную эффективность высвобождения лекарственного средства при температуре тела, но повышенное высвобождение лекарственного средства при pH 8,0, что подтверждается анализами жизнеспособности клеток с использованием клеток фибробластов. Следовательно, этот чувствительный к температуре и pH наногель может стимулировать перспективное применение для двойного контролируемого высвобождения лекарств при физиологическом pH тонкого кишечника и привлекательный способ доставки лекарств в кишечник путем перорального введения.

Сокращения

AAc:

Акриловая кислота

DLS:

Динамическое рассеяние света

FE-SEM:

Автоэмиссионная сканирующая электронная микроскопия

FT-IR:

Инфракрасный спектрометр с преобразованием Фурье

КПС:

Персульфат калия

LCST:

Более низкая критическая температура раствора

MBA:

N , N ′ -Метиленбисакриламид

PNIPAM:

Поли- N -изопропилакриламид

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

β-LP:

β-лапахон