Улучшение магнитоактивности магнитных наночастиц полиэтиленимина в остеобластах MG-63 с помощью нового однородного магнитного поля

Фон

Остеосаркома - наиболее распространенная злокачественная опухоль костей, поражающая в основном детей и подростков. Поскольку обычные методы лечения обеспечивают ограниченное улучшение, необходима новая стратегия лечения [1,2,3]. Появление генной терапии побудило исследователей оценить ее применение при остеосаркоме [4,5,6]. Безопасная и эффективная система доставки генов имеет решающее значение для генной терапии. Системы доставки генов можно разделить на системы доставки вирусных генов и системы доставки невирусных генов. Было показано, что системы доставки вирусных генов обладают высокой эффективностью трансфекции в различных первичных клетках и клеточных линиях. Системы доставки вирусных генов тесно связаны с проблемами безопасности, такими как запуск воспалительных реакций и генных мутаций [7], что побуждает исследователей переключить свои исследования на невирусные системы доставки генов. Однако большинство методов трансфекции невирусных генов не были особенно эффективными при трансфекции клеточных линий остеосаркомы [8, 9].

За последнее десятилетие для улучшения трансфекции эффективно использовались различные физические методы, такие как генные пушки [10], ультразвук [11] и электропорация [12]. Однако эти физические методы также вызывают повреждение клеток [13]. Поскольку магнитные поля обычно не вызывают повреждения клеток, технология магнитной трансфекции привлекла внимание исследователей. Mah et al. представили магнитные наночастицы в экспериментах по трансфекции генов путем связывания рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (rAAV), несущих зеленый флуоресцентный белок (GFP), с магнитными наночастицами для достижения целенаправленной усиленной трансфекции как in vitro, так и in vivo. По сравнению с чистыми аденовирусами, магнитные наночастицы аденовируса могут снизить дозу rAAV, несущих GFP, до 1% при тех же условиях скорости трансфекции [14]. Scherer et al. придумал термин «магнитофекция» для обозначения опосредованной магнитом трансфекции с использованием магнитных частиц [15]. Впоследствии Планк и др. описали методику магнитной трансфекции с использованием невирусных векторов [16]. Для дальнейшего повышения эффективности магнитофекции невирусных векторов Fouriki et al. регулировали частоту и амплитуду колеблющегося магнитного поля, чтобы вызвать динамический механический стимулирующий эффект на магнитные наночастицы, тем самым увеличивая вероятность контакта с клетками-мишенями [17]. Oral et al. дальнейшее повышение эффективности трансфекции и снижение цитотоксичности носителей генов за счет обратного вращения гексагонального вала магнита для управления скоростью и направлением магнитного поля [18]. В другом исследовании Vainauska et al. использовали динамическое градиентное магнитное поле, которое создавалось вращением цилиндрического постоянного магнита для нацеленной доставки магнитных носителей генов [19].

Эффективность магнитофекции значительно улучшилась, поскольку магнитные поля эволюционировали от статических и одиночных до динамических и сложных. Однако исследования, посвященные однородности и эффективному диапазону магнитного поля, ограничены. Насколько нам известно, большинство магнитных устройств не могут формировать однородные магнитные поля в конкретном трехмерном пространстве, что приводит к неоднородному распределению магнитных наночастиц, достигается только локальная трансфекционная эффективность магнитного поля и не устраняется возникающая цитотоксичность. Неоднородное магнитное поле также затрудняет сравнение реагентов для магнитной трансфекции, а также снижает эффективность трансфекции.

Для решения этих проблем наша исследовательская группа в сотрудничестве с Электротехническим колледжем Чунцинского университета разработала новый генератор магнитного поля [20, 21]. Генератор магнитного поля может формировать однородное магнитное поле на определенной высоте, а добавленные магнитные наночастицы быстро и равномерно распределяются по дну культуральной чашки. Однородное магнитное поле удобно не только для сравнительных исследований взаимосвязи между дозой и эффективностью трансфекции различных реагентов для трансфекции, но также может использоваться для оценки клеточного поглощения магнитных наночастиц.

В настоящем дизайне мы стремились создать надежную систему доставки невирусных генов с высокой эффективностью магнитофекции в клеточных линиях остеосаркомы. Линейный полиэтиленимин Mw20000 (PEI-20000) был выбран для приготовления магнитных наночастиц, поскольку несколько предыдущих исследований подтвердили, что системы доставки с линейным PEI имеют лучшую эффективность трансфекции, чем системы доставки с разветвленным PEI in vivo [22, 23]. Проведена оценка свойств модифицированных полиэтиленимином суперпарамагнитных наночастиц оксида железа (ПЭИ-СПИО-НЧ). Новый генератор магнитного поля был разработан для формирования однородного магнитного поля, которое использовалось для трансфекции комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA в клеточные линии остеосаркомы MG-63. Систематически исследовалось влияние различных магнитных полей на магнитофункцию.

Методы

Материалы и реагенты

Суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (SPIO-NP), гидрохлорид полиэтиленимина (PEI) и Hoechst-33,324 были приобретены у Sigma-Aldrich Co. (Сент-Луис, Миссури, США). PolyMag-200 (промышленный реагент для магнитофекции) был получен от Beijing Chief-East Tech Co., Ltd. (Qwbio) (Пекин, Китай). 1-Этил-3- [3- (диметиламино) пропил] карбодиимид (EDC) и N -гидроксисукцинимид (NHS) был приобретен у Chengdu Xiya Reagent Co. (Сычуань, Китай). PolyMag-200 и 96-луночные магнитные планшеты для культивирования клеток были приобретены у Chemicell GmbH (Берлин, Германия). Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), пенициллин-стрептомицин и фетальная бычья сыворотка (FBS) были получены от Invitrogen-Gibco (Калифорния, США). Изотиоцианат родамина B был получен от Aladdin Ind., Co. (Шанхай, Китай). LysoTracker Green DND-26 был получен от Shanghai Wei Jin Biological Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Набор для тестирования CCK-8 был получен от Seven Seas Biological Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай), а Endo-free Plasmid Maxi Kit-25 был приобретен у OMEGA (Джорджия, США). Физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) и другие реагенты были приготовлены в нашей лаборатории. Все растворители и химикаты были аналитической чистоты.

Синтез PEI-SPIO-NP

PEI-SPIO-NP получали, как описано ранее [24]. Вкратце, 0,1 г EDC и 0,5 г NHS добавляли к 15 мл водного раствора модифицированного карбоксилом SPIO-NPs (5 мг / мл, pH доводили до 5), и раствор перемешивали в течение 4-6 часов при комнатной температуре для активации карбоксил наночастиц оксида железа. Затем добавляли такой же объем водного раствора гидрохлорида полиэтиленимина (20 мг / мл) для прохождения реакции в течение нескольких часов. Полученный раствор конъюгированного PEI-SPIO-NPs подвергали диализу с использованием диализной мембраны (MWCO 20,000), погруженной в дистиллированную воду на 2 дня для удаления любых неконъюгированных молекул PEI и промежуточных продуктов. Аликвоту раствора наночастиц сушили вымораживанием и хранили.

Синтез и характеристика комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA

Синтез PEI-SPIO-NP осуществлялся, как описано выше, PEI-SPIO-NP и плазмидная ДНК (pDNA) предварительно нагревали отдельно в течение 10 мин при 37 ° C, а затем смешивали вместе при различных соотношениях N / P для получения Комплексы PEI-SPIO-NPs / pDNA. Морфологию комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA измеряли с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM, CM100, Philips, Нидерланды), а гидродинамический диаметр - с помощью динамического светорассеяния (DLS, Nicomp 380, PSS, FL, США). . Их магнитные свойства SPION и PEI-SPIO-NP были исследованы с помощью вибрационного магнитометра EV-11 (PPMS-9, Quantum Design, Сан-Карлос, Калифорния, США) при 300 К. Измерения были нормированы на вес железа в каждого образца, и измерения были проверены с помощью оптического эмиссионного спектрометра с индуктивно связанной плазмой (ICP-OES).

Поверхностные заряды измеряли путем определения дзета-потенциала с использованием прибора динамического светорассеяния (Malvern, Southborough, MA, USA) в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH =7,4). Комплексы PEI-SPIO-NPs / пДНК получали при различных мольных соотношениях N / P в диапазоне от 2,5 до 25 путем добавления раствора PEI-SPIO-NPs к раствору пДНК, и конечную концентрацию пДНК доводили до 30 мкг / мл.

Компоненты комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA были обнаружены с помощью атомно-силового микроскопа (IPC-208B, Chongqing University, Chongqing, China). Небольшой чешуйчатый металл, который использовался в качестве носителя для наблюдений, промывали ацетоном и сушили. Затем на металл наносили несколько капель образца антисмыслового зонда и сушили на воздухе. Морфология поверхности образца наблюдалась в крупномасштабной области сканирования 700 нм × 700 нм и 1000 × 1000 пикселей. Молекулярную структуру и микроструктуру образца наблюдали в мелкомасштабной области сканирования 9 нм × 9 нм и 800 × 800 пикселей. Исходные данные изображения были переданы в компьютер, а 3D-реконструкция была выполнена с помощью программы G2DR [25]. Измерения повторяли трижды для каждой группы.

Подвижность пДНК после связывания с PEI-SPIO-NP анализировали с помощью гель-электрофореза. Отношения N / P PEI-SPIO-NP / пДНК составляли 1/5, 1, 5, 10, 15, 20, 25 и 30, при этом содержание ДНК поддерживали на уровне 3 мкг. После 15 мин инкубации при 37 ° C 10 мкл раствора смеси анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле (90 В, 30 мин). Голая пДНК использовалась в качестве контроля.

Оценивали влияние PEI-SPIO-NP на защиту пДНК от ДНКазы I. Комплексы PEI-SPIO-NPs / pDNA при различных соотношениях N / P и голая pDNA (3 мкг) инкубировали при 37 ° C в 5% CO ₂ субвлажная среда в течение 30 минут с ДНКазой I (4 ЕД) в ДНКазе / Mg ²⁺ буфер для разложения, состоящий из 50 мМ трис-HCl (pH =7,6) и 10 мМ MgCl ₂ . Затем ДНКазу I инактивировали добавлением раствора EDTA (pH =8,0) до конечной концентрации 2,5 мМ. Затем образец инкубировали в течение 15 минут при 65 ° C и добавляли 10 мкл 1 мг / мл гепарина натрия для высвобождения пДНК из комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA [26]. Целостность пДНК оценивали электрофорезом в 1% агарозном геле (90 В, 30 мин).

Магнитное поле

Новый генератор магнитного поля (рис. 4) был разработан нашей группой в сотрудничестве с Электротехническим колледжем Чунцинского университета [20, 21]. Мы использовали изображение 3D CAD, чтобы показать расположение магнитов однородного магнитного поля. Отображалось распределение в плоскости XOY и трехмерное распределение магнитного поля в интересующей области. Наблюдалось распределение НЧ PEI-SPION в различных магнитных полях, и неоднородное магнитное поле (96-луночный постоянный планшет Nd-Fe-B) использовали в качестве контроля.

Культура клеток

Клеточная линия остеосаркомы человека MG-63 (первоначально из Американской коллекции типовых культур) была получена из Чунцинского инженерного исследовательского центра терапии стволовыми клетками (Чунцин, Китай). Клетки поддерживали в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина и инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ и относительной влажности 95%.

Цитотоксичность in vitro

Цитотоксические эффекты in vitro различных наночастиц с пДНК или без нее, а также намагниченных или немагнитных наночастиц на клетки остеосаркомы MG-63 определяли с использованием набора для тестирования CCK-8. Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты с плотностью 4 × 10 ³ . клеток на лунку, добавляли различные наночастицы и инкубировали в течение 24, 48, 72 и 96 часов. Раствор CCK-8 (10% объема культуральной среды) добавляли в каждую лунку в заранее установленные моменты времени, и клетки культивировали еще 2 часа. Оптическую плотность клеток оценивали с использованием флуоресцентного ридера для микропланшетов при длине волны 450 нм, при этом значение поглощения отражало высокую жизнеспособность клеток; наблюдение высокой жизнеспособности указывает на то, что наночастицы вызывают низкий цитотоксический эффект. PolyMag-200 / pDNA и PolyMag-200 использовали в качестве положительного контроля. Чтобы изучить токсичность воздействия различных магнитных полей на клетки, мы выбрали PEI-SPIO-NP (без пДНК) в качестве векторов генов, и была исследована оптическая плотность клеток, подвергшихся воздействию различных магнитных полей в разные моменты времени.

Анализ конфокальной микроскопии

Поглощение комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA или наночастиц полиэтиленимина (PEI-NP) наблюдали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Клетки остеосаркомы MG-63 высевали в 24-миллиметровые стеклянные чашки с плотностью 3 × 10 ⁵ . за колодец. Помеченные родамином B изотиоцианат (RBITC) комплексы PEI-SPIO-NPs / pDNA (3 мкг) добавляли к клеткам и инкубировали в течение 30 мин под действием однородного магнитного поля или неоднородного магнитного поля; Меченные RBITC комплексы PEI-NP / пДНК добавляли к клеткам без вмешательства магнитного поля. Затем клетки немедленно дважды промывали PBS (0,01 M) для удаления любых свободных комплексов PEI-SPIO-NP / пДНК, меченных RBITC, или комплексов PEI-NP / пДНК, меченных RBITC, и обработанные клетки инкубировали в течение 6–24 ч. . Среду удаляли через 6, 12 и 24 часа после трансфекции, и ядра клеток окрашивали Hoechst 33342 в течение 5 минут. После удаления остатка Hoechst 33342 клетки инкубировали в предварительно нагретой среде, содержащей 0,5 мМ LysoTracker Green DND-26, в течение 1 ч, а затем дважды промывали предварительно нагретым PBS. Клетки получали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (LSM 700, Carl Zeiss, Оберкохен, Германия) с объективом × 40 для визуализации флуорохромов со следующими длинами волн возбуждения (Ex) и излучения (Em) [GFP (Ex:488 нм); Em:530 нм), Hoechst (Ex:350 нм; Em:460 нм), LysoTracker Green (Ex:443 нм; Em:505 нм) и RBITC (Ex:554 нм; Em:576 нм)] [27 ].

Анализ проточной цитометрии

Клетки MG-63 высевали в 12-луночные планшеты (1 × 10 ⁵ клеток на лунку) в течение 24 часов, после чего их дважды промывали PBS и предварительно инкубировали в течение 1 часа с 0,8 мл среды Opti-MEM при 37 ° C перед трансфекцией. Комплексы PEI-SPIO-NPs / пДНК (N / P =10) или комплексы PEI-NPs / pDNA (N / P =10), содержащие 3 мкг пДНК, добавляли в каждую лунку, и планшеты для культивирования клеток помещали в однородную среду. или неоднородное магнитное поле в течение 20 мин. PolyMag-200 / pDNA использовали в качестве положительного контроля. Через 4 часа клетки трижды промывали 1 мл PBS (0,01 M) для удаления любых свободных комплексов PEI-SPIO-NP / пДНК или комплексов PEI-NP / пДНК, и клетки культивировали еще 24 часа. После инкубации клетки собирали и оценивали эффективность трансфекции с помощью проточной цитометрии (BD FACS Canto II, BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США), эту часть эксперимента повторяли трижды.

Статистический анализ

Количественные данные были получены в трех экземплярах ( n =5) и выражается как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводился с использованием однофакторного дисперсионного анализа для множественных сравнений и критерия Стьюдента t тест для межгруппового сравнения. А P значение <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Принцип магнитофекции

Магнитофекция определяется как векторы, которые связаны с суперпарамагнитными наночастицами и накапливаются на клетках-мишенях под действием магнитных градиентных полей [15]. На рисунке 1 представлены компоненты и морфология комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA и основной принцип магнитофекции. Медленное накопление вектора и, следовательно, низкая концентрация вектора в тканях-мишенях были идентифицированы как простые, но сильные препятствия на пути эффективной доставки генов [28]. Основным механизмом увеличения эффективности магнитофекции, по-видимому, является быстрое осаждение полной дозы вектора на клетках-мишенях, так что до 100% этих клеток будут иметь векторные частицы, связанные с их поверхностью в течение нескольких минут. Таким образом, магнитофекция является подходящим инструментом для преодоления сильного барьера медленного накопления векторов и, следовательно, низкой концентрации векторов в тканях-мишенях. Комплексы PEI-SPIO-NPs / pDNA случайны, и их осаждение в клетках-мишенях в отсутствие магнитного поля занимает ограниченное время и требует много времени. Тем не менее, комплекс PEI-SPIO-NPs / pDNA может широко и равномерно соприкасаться с клетками-мишенями за относительно короткий период времени в присутствии магнитного поля, что может увеличить вероятность поглощения эндоцитами единичной площади клеток, чтобы повысить степень использования комплекса PEI-SPIO-NPs / pDNA и повысить эффективность трансфекции.

Обзор магнитофекции с использованием комплекса PEI-SPIO-NPs / pDNA. Футерованный полиэтиленимин (LPEI) и суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (SPIO-NP) связаны реакцией дегидратационной конденсации. Для этой цели SPIO-NP были покрыты LPEI, т.е. LPEI плотно связан с поверхностью SPIO-NP, и они вместе образуют PEI-SPIO-NP. Если PEI-SPIO-NP смешивают с голой пДНК, отрицательно заряженная пДНК связывается с положительно заряженными PEI-SPIO-NP посредством электростатической адсорбции. Клетки инкубируют с комплексами PEI-SPIO-NP / пДНК в присутствии магнитного поля, которое притягивает комплексы к клеткам. Результатом магнитофекции является то, что практически все клетки вступают в контакт с векторами, и большой процент клеток быстро трансфицируется

Характеристика комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA

На рисунке 2а показано, что PEI-SPIO-NP имеют примерно сферическую форму, а комплексы PEI-SPIO-NP / пДНК кажутся агрегированными, оба имеют благоприятную диспергируемость, а притяжение между положительными и отрицательными зарядами делает комплексы PEI-SPIO-NP / пДНК способными приобретать небольшой размер. Петля гистерезиса комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA показана на рис. 2b. Массовый процент оксида железа в PEI-SPION-NP, измеренный атомно-абсорбционным спектрометром, составляет 20,33 (± 2,87)%. Намагниченность насыщения комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA составляла 21,5 (± 1,6) emu / г железа. Несмотря на пониженные магнитные свойства по сравнению с немодифицированными суперпарамагнитными наночастицами оксида железа, комплексы PEI-SPIO-NPs / pDNA показали превосходную магнитную чувствительность, которая необходима для высокоэффективной магнитофекции.

Характеристики комплексов ПЭИ-СПИО-НП / пДНК. а ПЭМ комплексов ПЭИ-СПИО-НП и ПЭИ-СПИО-НП / пДНК. б Петли гистерезиса SPIO-NP и комплексов PEI-SPIO-NP / пДНК. c Дзета-потенциал и гидродинамический диаметр комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA при различных соотношениях N / P. г Полутоновое изображение AFM и молекулярная структура комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA. Красные точки обозначают расположение химической группы SPIO, зеленые точки обозначают атомы азота, желтые точки обозначают атомы углерода, а атом фосфора представлен черной точкой белого круга. е (a) Распределение размеров комплексов PEI-SPIO-NP / пДНК и e (b) дзета-потенциал комплексов PEI-SPIO-NP / пДНК, измеренный с помощью прибора для динамического светорассеяния Malvern Zetasizer. Результаты выражаются в виде среднего значения ± стандартное отклонение ( n =5)

Гидродинамический диаметр и дзета-потенциал считались обязательными параметрами носителей генов. Рисунок 2c показывает, что гидродинамический диаметр комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA составлял 200 (± 21,7) нм с соотношением N / P (NH ₂ —Группа в PEI / PO ₄ - группа в пДНК) 2,5 и 175 (± 16,4) нм, когда отношение N / P было 5, что указывает на то, что быстрое изменение размера произошло во время перехода потенциала от отрицательного к положительному. После этого силы отталкивания между комплексами PEI-SPIO-NPs / pDNA увеличивались с увеличением отношения N / P, что указывает на увеличение размера наночастиц.

Мы проанализировали типы химических связей в соответствии с расположением атомов и дополнительно предположили молекулярную структуру комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA. Молекулярная структура комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA была косвенно раскрыта с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM, рис. 2d), которая показала, что карбоксильные группы суперпарамагнитных наночастиц оксида железа связаны с первичным амином PEI посредством амидной связи. Кроме того, пДНК была обернута в молекулярную цепь PEI посредством электростатического связывания между фосфатными группами нуклеотидной цепи и аминогруппами PEI, образуя комплексы PEI-SPIO-NPs / pDNA. На полутоновом изображении AFM красная точка представляет расположение атомов железа, зеленая точка указывает атомы азота, желтые точки обозначают атомы углерода, а атом фосфора представлен белым кружком с черной точкой.

Как показано на фиг. 2e, потенциал комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA детектировали с использованием прибора динамического светорассеяния. При pH =7 потенциал суперпарамагнитных наночастиц оксида железа (SPIO-NPs) составлял -6,6 (± 1,1) мВ, что указывало на присутствие карбоксильных групп на их поверхности. Потенциал ПЭИ-СПИО-НЧ составил + 18,2 (± 1,5) мВ. Потенциал PEI, модифицированного SPIO-NP, был преобразован в положительно заряженную поверхность, которую можно было использовать в качестве носителя гена, который объединяется с отрицательно заряженной pDNA. Мы оценили изменение поверхностных зарядов комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA при различных соотношениях N / P. Комплексы PEI-SPIO-NPs / pDNA показали отрицательный поверхностный заряд даже при низком отношении N / P, равном 2,5, который постепенно переводился в положительный поверхностный заряд, когда отношение N / P увеличивалось до 5. Это увеличение отношения N / P в комплексах PEI-SPIO-NPs / pDNA приводит к увеличению положительного заряда поверхности полиплексов. При соотношении N / P, равном 10, потенциал комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA (N / P =10) составлял + 11,9 (± 1,2) мВ, а поверхностный заряд достигал плато. Положительно заряженные комплексы контактировали с отрицательно заряженной клеточной мембраной и позволяли клеткам поглощать комплексные наночастицы [29]. PEI-SPIO-NP могут не только использоваться в качестве носителей генов отрицательно заряженной пДНК, но также вносить определенный уровень магнетизма для адресной доставки лекарств и стать контрастным агентом, используемым для контрастной визуализации магнитно-резонансной томографии (МРТ) [30, 31] .

Фундаментальным требованием к носителям генов является то, что носитель трансфекции должен эффективно образовывать стабильный комплекс с нуклеиновыми кислотами. Для оценки его связывающей способности аналогичные объемы раствора PEI-SPIO-NP и раствора пДНК смешивали при различных соотношениях N / P и встряхивали. Затем аликвоту смеси объемом 10 мкл анализировали электрофорезом в агарозном геле (фиг. 3а). В отличие от голой пДНК, миграция плазмиды была полностью заблокирована при соотношении N / P, равном 5, что указывает на то, что PEI-SPIO-NP полностью концентрировали пДНК [32].

Анализ связывания пДНК и анализ защиты пДНК PEI-SPIO-NP. а Электрофорез в агарозном геле комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA при различных соотношениях N / P. б Анализ электрофоретической подвижности PEI-SPIO-NPs / pDNA после обработки ДНКазой-I. PEI-SPIO-NP с различным соотношением N / P и пДНК (3 мкг) инкубировали при 37 ° C в 5% CO ₂ субвлажная среда в течение 30 минут с ДНКазой-I (4 ЕД) в ДНКазе / Mg ²⁺ буфер для разложения, состоящий из 50 мМ трис-HCl (pH =7,6) и 10 мМ MgCl ₂ . Затем ДНКазу I инактивировали добавлением раствора EDTA (pH =8) до конечной концентрации 2,5 мМ. Затем образец инкубировали в течение 15 минут при 65 ° C и добавляли 10 мкл 1 мг / мл гепарина натрия для высвобождения пДНК из PEI-SPIO-NPs / pDNA. Целостность пДНК оценивали электрофорезом в 1% агарозном геле (90 В, 30 мин)

Другой особенностью PEI-SPIO-NP как потенциальных носителей генов является то, что они могут защищать пДНК от разрушения нуклеазами, тем самым способствуя трансфекции. Рисунок 3b показывает, что голая пДНК значительно разрушается ДНКазой-I. Комплексы PEI-SPIO-NPs / пДНК при мольном соотношении N / P <5 были полностью переварены, тогда как пДНК, высвобожденная из комплексов PEI-SPIO-NPs / пДНК (N / P =5:1), оставалась нетронутой. Результаты этих анализов защиты от ДНКазы-I показали, что PEI-SPIO-NP эффективно защищают пДНК от переваривания ДНКазой-I, что подразумевает ее потенциальное применение в генной терапии.

Как показано выше, когда N / P было <5, PEI-SPIO-NP не могли защитить пДНК от расщепления нуклеазами. Размеры комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA увеличивались, когда N / P было> 10, что было непригодным для векторного транспорта [33, 34]. Размер комплексов PEI-SPIO-NPs / pDNA был наименьшим и демонстрировал стабильность при N / P =5. Более того, дзета-потенциал PEI-SPIO-NP не увеличивался значительно, когда N / P> 10. Следовательно, для обеспечения стабильности PEI-SPIO-NPs / pDNA для последующих экспериментов было выбрано соотношение N / P, равное 10.

Генерация магнитного поля

Новый генератор магнитного поля Хальбаха (рис. 4a, b) был разработан нашей группой в сотрудничестве с Электротехническим колледжем Университета Чунцина [20, 21]. Новый генератор магнитного поля состоит из девяти идентичных кубовидных модулей с постоянными магнитами и двух пассивных регулировочных пластин (рис. 4c), которые создают очень однородное магнитное поле в горизонтальной плоскости.

Генераторы магнитного поля и их однородность магнитного поля и ПЭИ-СПИО-НП распределены в различных магнитных полях. а Измерение однородности магнитного поля Graussmeter. б Генератор однородного магнитного поля. c Трехмерное изображение расположения магнитов генератора однородного магнитного поля (где каждый магнит имеет размер 40 × 40 × 200 мм ³ ). г 96-луночный генератор магнитного поля. е Однородность магнитного поля 96-луночного генератора магнитного поля. е Однородность магнитного поля генератора однородного магнитного поля. г Распределение PEI-SPIO-NP в 96-луночном магнитном поле. ч Распределение ПЭИ-СПИО-НП в однородном магнитном поле. я Распределение однородного магнитного поля в плоскости XOY (50 мм × 50 мм) и j Трехмерное распределение однородного магнитного поля

Оптимизирующая структура магнита может генерировать магнитное поле, которое равномерно распределяется в горизонтальном направлении на площади 50 мм × 50 мм в плоскости YOZ. Градиент распределяется в вертикальном направлении с градиентом 2 мТл / мм. Магнитное поле равномерно распределено в области XOY размером 50 мм × 50 мм с однородностью 1,3 × 10 ⁻³ . и магнитное поле 0,0739 Тл, сила магнитного поля в корональной плоскости и сагиттальной плоскости, где был помещен планшет для культивирования клеток, составляет соответственно 0,0632 Тл и 0,07 Тл. Разница однородности каждой лунки в 96-луночном магнитном планшете для культивирования клеток была приблизительно 80% (рис. 4г, д). Однако разница в однородности каждой лунки в новом магнитном поле Хальбаха меньше 2 ‰, поэтому разница в однородности между двумя магнитными полями составляет> 100 раз (рис. 4f). В этом случае мы установили 96-луночный магнитный планшет для культивирования клеток как неоднородное магнитное поле, а новое магнитное поле Хальбаха представляет собой относительно однородное магнитное поле, которое использовалось в качестве экспериментального инструмента для последующих исследований.

На распределение PEI-SPIO-NP существенно влияло магнитное поле. ПЭИ-СПИО-НП постепенно опускались под действием силы тяжести и беспорядочно распределялись в отсутствие магнитного поля. При приложении магнитного поля PEI-SPIO-NP быстро опускались на дно пластин. Кроме того, распределение могло также существенно измениться в различных магнитных полях. В обычном неоднородном магнитном поле (96-луночный магнитный планшет для культивирования клеток) PEI-SPIO-NP собирали в массы или полосы и распределяли по линиям магнитной силы (рис. 4g). Однако PEI-SPIO-NP были равномерно распределены в однородном магнитном поле, которое создавалось новым генератором магнитного поля (рис. 4h). Как видно из распределения в плоскости XOY и трехмерного распределения магнитного поля (рис. 4i, j), красная область на рисунке представляет собой относительно однородное магнитное поле с однородностью около двух тысячных ( Z =10 мм), и видно, что градиент магнитного поля в целевой области составляет около 1,3 т / м (130 Гс / см). The magnetic field generated in the designated area could obtain a good flat property in the horizontal direction by adjusting the arrangement of the magnet module and changing the magnetization direction of the magnet module.

Assessment of In Vitro Cytotoxicity

We used CCK-8 kits to evaluate the effects of magnetization, magnetic field, and pDNA on the cytotoxicity of nanoparticles. Figure 5a shows that with the prolongation of culture time, the absorbance values increased in all the groups except for the PolyMag-200/pDNA groups. The absorbance values of PEI-SPIO-NPs/pDNA group were higher than that of PEI-NPs/pDNA group and PolyMag-200/pDNA group (P  < 0.05) and lower than that of the control group (P  > 0.05), suggesting that the cytotoxicity of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes is lower than unmagnetized PEI-NPs/pDNA complexes and PolyMag-200/pDNA complexes. Figure 5b shows the negative effects on the absorbance values caused by the uniform and non-uniform magnetic fields. The negative effect caused by the uniform magnetic field was smaller than that caused by the non-uniform magnetic field (P <0,05). As shown in Fig. 5c, the absorbance values of nanoparticles without pDNA is significantly lower than that of nanoparticles with pDNA (P  < 0.05), which meant nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts.

Comparison of cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes, and different nanoparticles with pDNA and without pDNA on MG-63 osteoblasts. Cytotoxicity is detected by the CCK-8 test kit, the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm, which reflects the cell viability, and the high viability is indicative of the low cytotoxicity. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P <0,05, ** P < 0.01). а The cytotoxicity effects of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes on MG-63 osteoblasts. б The cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field on MG-63 osteoblasts and c the cytotoxicity effects of different nanoparticles with pDNA and without pDNA

Although PEI is an efficient transfection reagent, its cytotoxicity is strongly and positively correlated with its transfection efficiency and the mechanism of cytotoxicity caused by PEI is not very clear [35]. The present study found that during transfection, PEI increases the permeability of the cell membrane and damages the integrity of the mitochondrial and nuclear membranes [36, 37]. Sonawane et al. [38] reported that PEI25K promotes the release of mitochondrial protons and inhibits the electron transport chain in a dose- and time-dependent manner, indicating that PEI induces cell apoptosis. Another study showed that PEI induces cell autophagy, which is closely related to cytotoxicity [39]. The cytotoxicity of magnetized PEI decreased, and this might be attributable to the surface carboxyl groups of superparamagnetic iron oxide nanoparticles, which are negatively charged, thus partly neutralizing the positive charge of the PEIs and decreasing the chances of incurring irreversible damage. The non-uniform magnetic field induced PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes to gather into masses or bands, and be distributed along with the lines of magnetic force (Fig. 4b), thereby causing severe damage to parts of the cell membrane and even cell death due to the excessively high number of positive charges [40]. In contrast, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes were uniformly distributed across the uniform magnetic field, thereby decreasing the accumulation of positive charges and reducing the cytotoxicity.

Nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts than nanoparticles without pDNA; this may be attributed to the negatively charged pDNA partially neutralize the surface positive potential of the cationic nanoparticles at the beginning of magnetofection progress. Moghimi SM et al. concluded that PEI-induced cellular toxicity could been defined as a two-stage process, with the first stage taking place within 30 min of PEI uptake [41]. Stage-one toxicity has been defined as necrosis that is based on compromise of cell membrane integrity mediated by PEI binding to negatively charged plasma membrane proteoglycans, with highly cationic NPs being extremely cytotoxic [42]. After internalized by MG-63 osteoblast, different nanoparticles exhibits similar cytotoxic mechanisms, internalization leads to proton buffering, osmotic pressure, and eventual lysis of lysosomal membranes, releasing hydrolytic enzymes and other lysosomal constituents into the cytoplasm [43].

Cellular Uptake of PEI-SPIO-NPs/pDNA Complexes

To better understand the intracellular distribution of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes or PEI-NPs/pDNA complexes and the relationship between intracellular uptake of complexes and transfection efficiency, a laser scanning confocal microscope was used to trace the magnetized RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes and non-magnetized RBITC-PEI-NPs/pDNA complexes during transfection of MG-63 cells. LysoTracker Green D26 is a specific marker for lysosomes, and Hoechst 33342 specifically stains nuclei. Overlapping green and red fluorescence, which yields yellow fluorescence, represents colocalization and indicates entrapment of polyplexes in lysosome.

Figure 6 shows that extensive co-localization was observed at 6 h post-transfection, which indicates that most of the complexes were entrapped in endosomes. The RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed a higher frequency of co-localization than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group (arrow). At 12 h post-transfection, most of the red fluorescence had already translocated from the green fluorescence of lysosomes to the surrounding blue fluorescence of nuclei, and some green fluorescence of gene expression was visible in the cytoplasm, which indicated that most complexes escaped the endosomes via the proton sponge effect [44, 45] (arrow). The fluorescent signals of the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group were more distinct than those of the RBITC-SPIO-PEI-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group. It was interesting that the cytoplasm emitted green fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, which indicated expression of GFP, thereby illustrating the proton sponge effect that facilitates gene expression. At 12 h post-transfection, some nuclei emitted red fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, indicating that complexes had been transported into nuclei, which may be attributable to the mechanical effect of magnetofection (arrow). At 24 h post-transfection, the green fluorescence in the cytoplasm showed maximal levels, the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed more intense green fluorescence than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field and the PBITC-PEI-NPs group (arrow). The affiliated magnetic field enabled the magnetic nanoparticles to attach rapidly to the cell membrane and accelerate intracellular uptake of magnetic nanoparticles. By contrast, up to 100% of these cells will have vector particles bound to their surfaces within a few minutes in the presence of the novel uniform magnetic field; more vectors adherence leads to a greater probability of cellular uptake, and transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [46].

Intracellular tracking of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes in the presence of uniform magnetic field (uniform MF) or non-uniform magnetic field (non-uniform MF) and PEI-NPs/pDNA complexes without magnetic field (No MF) at 6, 12, and 24 h post-transfection to MG-63 osteoblasts. Confocal images were obtained from three channels and overlaid:red indicates RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes (excitation:554 nm; emission:576 nm), green represents lysosomes stained with Lysotracker-DND26 and the homogeneous green in the cytoplasm implies GFP expression (excitation:443 nm; emission:505 nm), blue signifies the nuclei stained by the Hochest 33342. (excitation:359 nm; emission:461 nm)

In Vitro Transfection

Because PEI-SPIO-NPs are endowed with promising attributes such as pDNA condensation ability and high cell viability, we next used it as a gene carrier to determine the role of novel uniform and non-uniform magnetic fields on transfection efficiency. To evaluate the effectiveness of magnetofection, we selected the MG-63 osteosarcoma cell line as target cells and used GFP-pDNA as the reporter gene.

GFP expression was observed by inverted fluorescence microscopy at 24 h post-transfection. Figure 7a shows that the PEI-SPIO-NPs/pDNA group yielded significantly higher transfection efficiencies than the PEI-NPs/pDNA group in the presence of the uniform or non-uniform magnetic field, which is obvious in the uniform magnetic field group (P  < 0.05), the transfection efficiency of the uniform magnetic field group was 42.1%, which is roughly two times higher than that of the non-uniform magnetic field group. Although PolyMag-200/pDNA showed high transfection efficiency and has been confirmed to transfect most adherent cell lines, it is also highly cytotoxic. The cells were collected for flow cytometry at 48 h post-transfection (Fig. 7b), and the statistical analysis results were in agreement with the findings from fluorescence microscopy (Fig. 7c).

MG-63 osteoblasts transfected with PEI-SPIO-NPs/pDNA or PEI-NPs/pDNA under the condition of no magnetic field, non-uniform magnetic field, or uniform magnetic field. GFP-pDNA was used for reporter gene in combination with PEI-NPs or PEI-SPIO-NPs (N/P = 10), and the cells were exposed to the non-uniform or uniform magnetic fields for 20 min. At 24-h post-transfection, cell images were captured under an inverted fluorescent microscope. PolyMag-200 comprise commercial magnetic transfection reagents that were used as positive control, naked pDNA was used as the negative control. а At × 40 magnification in an inverted fluorescent microscope. б Transfection efficiency was calculated by flow cytometer and c statistical analysis of the transfection efficiency of PEI-SPIO-NPs/pDNA group, PolyMag-200/pDNA group and PEI-NPs/pDNA group. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P <0,05, ** P  < 0.01)

The mechanism underlying the increase in transfection efficiency by magnetofection is currently unclear. Previous studies have demonstrated that magnetofection does not involve magnetic nanoparticles being pulled directly into the cells by the magnetic field, magnetic nanoparticles enter cells via endocytosis and remain intact upon cellular uptake [47]. The observed significant increase in transfection efficiency may be due to the synergistic effect of accelerated sedimentation and fast internalization [48, 49]. The number of magnetic complexes that enter each cell apparently influences pDNA content. Although genes must still escape endosomes before transcription, transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [50], branched PEIs showed a higher uptake rate. However, once inside the cell, lysosomal escape becomes the key to transfection, especially with higher N/P ratios, and linear PEIs showed higher rates of lysosomal escape [51,52,53]. Because of the magnetic force, PEI-SPIO-NPs can quickly come in close contact with cell membranes, which to some extent, increases the uptake capability of complexes. Once the complexes are inside the cell, PEIs provide a structural advantage and facilitate timely release of pDNA, which is eventually expressed by the cells.