Плазмонный ИФА для чувствительного обнаружения биомаркеров заболеваний с помощью считывателя на смартфоне

Введение

Острый инфаркт миокарда (ОИМ) - это медицинское название сердечного приступа, который возникает, когда кровь, поступающая к сердечной мышце, резко прерывается, что приводит к повреждению тканей [1]. Симптомы ОИМ включают тяжелую и стойкую постгрудинную боль, аритмию, шок и сердечную недостаточность, которые могут быть фатальными [2]. ОИМ - одно из самых распространенных заболеваний в Европе и Америке. Примерно 1 500 000 человек ежегодно страдают от инфаркта миокарда только в США. В последние годы в Китае наблюдается явная тенденция к увеличению ОИМ, при этом ежегодно регистрируется не менее 500 000 новых пациентов. Тест на биомаркер в месте оказания помощи имеет большое значение для раннего мониторинга и лечения ОИМ. Сывороточный миоглобин (Myo) увеличивается через 1-2 часа после ОИМ и достигает максимального значения через 6-9 часов. Мио считается одним из самых ранних сывороточных маркеров для ранней диагностики ОИМ [3,4,5].

Недавно были разработаны плазмонные иммуноанализы, объединяющие традиционный иммуноферментный анализ (ELISA) и наноматериалы [6, 7]. Плазмонный иммуноанализ широко используется в клинической диагностике [8], мониторинге загрязнения окружающей среды [9] и обнаружении безопасности пищевых продуктов [10]. По сравнению с другими иммуноанализами, плазмонный иммуноанализ высокочувствителен и позволяет считывать данные невооруженным глазом без использования сложных инструментов. Металлические наночастицы, такие как наноматериалы золота и серебра, обычно используются в плазмонных наносенсорах из-за их превосходного локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR). В плазмонном иммуноанализе меченное ферментом антитело катализирует свои субстраты с образованием продукта, который запускает агрегацию или изменение формы наноматериалов. Группа Чена [11] сообщила о плазмонном иммуноанализе для обнаружения патогенов с использованием реакции гидролиза, катализируемой ацетилхолинэстеразой (AChE), для индукции агрегации наночастиц золота (AuNP). Чувствительность плазмонного иммуноанализа сравнима с ОТ-ПЦР. Однако надежная, сверхбыстрая и высокостабильная агрегация AuNPs в колориметрическом анализе остается проблемой из-за того, что процедура агрегации AuNPs является динамической [12, 13]. Другой вид плазмонного иммуноанализа основан на изменении формы плазмонных наночастиц. Плазмонные биосенсоры на основе травления на основе треугольных серебряных нанопризм (AgNPR) были зарегистрированы для обнаружения биомаркеров рака, в которых используется перекись водорода (H ₂ О ₂ ), продуцируемые глюкозооксидазой (GOx) для травления AgNPR [14, 15]. Однако для количественного тестирования молекулярной мишени необходимы относительно сложные и громоздкие инструменты для измерения спектра наноматериалов наряду с плазмонными иммуноанализами. Неудобство, связанное с этими инструментами, делает их неприменимыми для анализа на месте оказания медицинской помощи. Поэтому существует острая необходимость в разработке портативного, недорогого и простого в использовании устройства считывания плазмонного иммуноанализа для диагностики в месте оказания медицинской помощи (POCT).

Золотые наностержни (AuNR) широко используются в биосенсорах [16,17,18], плазмонной визуализации [19], фототермической терапии опухолей [20] и фотодинамической терапии [21] благодаря своим уникальным физическим, оптическим и электронным свойствам [22]. , 23,24]. В этой работе мы сообщили о чувствительном плазмонном иммуноанализе, основанном на ферментно-опосредованном изменении LSPR AuNR для обнаружения Myo. Чтобы облегчить POCT-диагностику AMI, мы разработали новый считыватель плазмонного иммунологического анализа, использующий датчик внешней освещенности (ALS) смартфона. Высокая корреляция между результатами плазмонного иммуноанализа и результатами традиционного ELISA на образцах сыворотки продемонстрировала возможности применения этого нового метода для ранней POCT-диагностики ОИМ, особенно в регионах с ограниченными технологическими ресурсами.

Материалы и методы

Материалы и реагенты

Myo (из ткани сердца человека) был приобретен у Abcam (Кембридж, Великобритания). Анти-миомоноклональные антитела (mAb1 и mAb2) были произведены в нашей лаборатории (дополнительный файл 1). Нитрат серебра (AgNO ₃ , 99,8%) и боргидрид натрия (NaBH ₄ ) были приобретены в Sinoreagent (Шанхай, Китай). Перекись водорода (H ₂ О ₂ , 30 мас.%) И H ₂ SO ₄ были закуплены на заводе химических реактивов GZ (Гуанчжоу, Китай). Светоизлучающий диод (LED, 850 нм) был приобретен у Shenzhen OCtai Co., Ltd. (Шэньчжэнь, Китай). Хлорозавровая кислота (HAuCl ₄ ), TMB (3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин), Tween-20 и бромид цетилтриметиламмония (CTAB) были приобретены в Amresco (Хьюстон, Техас, США). Глюкозооксидаза типа VII из Aspergillus niger (GOx), пероксидаза хрена типа VI (HRP) и бычий сывороточный альбумин (BSA) были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). На протяжении всего исследования использовалась деионизированная вода (сорт Milli-Q, Millipore) с удельным сопротивлением 18,2 МОм · см. Образцы сыворотки крови были собраны в китайской больнице Гуанчжоу (Гуанчжоу, Китай).

Аппарат

Спектры LSPR AuNR в 96-луночных планшетах собирали с помощью гибридного многорежимного микропланшетного ридера Synergy H1 (Bio-Tek Instruments, Inc., США). Оптическую плотность ELISA на основе HRP измеряли при 450 нм с использованием микропланшетного ридера MK3 (Bio-Tek Instruments, Inc., США). Характеристику AuNR проводили с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) PHILIPS TECNAI-10, работающего при ускоряющем напряжении 120 кВ. Образцы для ПЭМ-измерений были приготовлены путем нанесения одной капли водной дисперсии на медную сетку, покрытую тонкими пленками углерода, а растворитель удаляли испарением на воздухе. Приобретен 3D-принтер в SHINING 3D (Ханчжоу, Китай). Смартфон HUAWEI P9 (Шэньчжэнь, Китай) был выбран в качестве базового смартфона для считывателя плазмонного иммуноанализа.

Дизайн считывателя плазмонного иммуноанализа для смартфонов

Конструкция считывающего устройства для плазмонного иммуноанализа на базе смартфона была создана с помощью программного обеспечения (Solidworks 2014), а затем обработана с помощью программного обеспечения 3D star. Для настройки печати был установлен режим печати «Качество», а для способа поддержки была настроена внутренняя и внешняя поддержка. Бесплатное приложение для смартфонов Light Meter использовалось для отображения результатов измерений на экране. В этой работе считыватель плазмонного иммуноанализа работает на телефоне Android (с открытым исходным кодом). Этот считыватель также можно использовать на iPhone, если пользователь применил программное обеспечение версии iOS (Light Meter).

Синтез AuNR

AuNR были получены путем роста семян, опосредованного золотом [25]. Приготовление золотых семян:готовили свежий 0,01 М боргидрид натрия в 0,01 М гидроксиде натрия. Затем 600 мкл раствора боргидрида натрия добавляли к HAuCl ₄ раствор (0,25 мМ) в 10 мл 0,1 М CTAB при перемешивании (300 об / мин мин ^-1 ). Цвет золотого семени изменился с зеленоватого на светло-коричневый. Синтез наностержней:AgNO ₃ (70 мкл, 0,1 М) раствор добавляли к 10 мл HAuCl ₄ . раствор (0,5 мМ) в 0,1 М CTAB. Затем при перемешивании добавляли 140 мкл аскорбиновой кислоты (0,0788 M) (300 об / мин ^-1 ). Наконец, добавляли 12 мкл затравки золота и раствор перемешивали при перемешивании (300 об / мин ^-1 ) за 12 ч перед использованием.

Процедура плазмонного иммуноанализа на основе AuNR для обнаружения мио

Для плазмонного иммуноанализа, чтобы приготовить 96-луночные полистирольные планшеты с анти-Myo-антителом 1 (Ab1), разбавленные Ab1 инкубировали в 96-луночных полистирольных планшетах при 4 ° C в течение ночи. После трех промывок PBST 96-луночные планшеты из полистирола были заблокированы блокирующим буфером (1 мг / мл ^-1 BSA в PBST) при 37 ° C в течение 1 ч. Затем 96-луночные планшеты из полистирола трижды промывали промывочным буфером и хранили при -20 ° C. Антитело против Myo 2, меченное GOx (GOx-Ab2), получали в соответствии с процедурами, указанными в дополнительном файле 1.

Для обнаружения Myo в 96-луночные планшеты из полистирола, покрытые Ab1, добавляли различные концентрации растворов Myo (100 мкл). После инкубации в течение 1 ч планшеты трижды промывали буфером PBST, а затем 0,01 мг / мл ^-1 . Добавляли GOx-Ab2 и инкубировали при 37 ° C еще 1 час. Затем планшеты трижды промывали буфером PBST, добавляли 50 мкл глюкозы (0,5 мМ) и инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин. Затем супернатант смешивали с 50 мкл цитратного буфера (40 мМ, pH 4,0), содержащим AuNR ([Au0] 0,24 мМ), CTAB (12,5 мМ) и HRP (3 мкМ), и инкубировали в течение 30 мин. Соответствующий LSPR-спектр AuNR собирали коммерческим устройством для считывания микропланшетов, а интенсивность прошедшего света (850 нм) AuNR измеряли с помощью считывающего устройства для плазмонного иммуноанализа на базе смартфона. Калибровочная кривая плазмонных иммуноанализов на Myo была построена путем сопоставления измеренной интенсивности прошедшего света с соответствующей концентрацией Myo. Для обнаружения Myo образцы сыворотки разбавляли в десять раз буфером PBS. Затем 100 мкл разбавленных образцов сыворотки добавляли в 96-луночные планшеты из полистирола, покрытые Ab1. Концентрацию Myo тестировали, как описано выше. Каждое значение представляет собой среднее значение для трех повторов.

Процедура ELISA на основе HRP показана в дополнительном файле 1.

Метод анализа данных

Линейный регрессионный анализ был обработан с помощью origin 9.0. Все эксперименты независимо повторяли трижды. Каждое значение представляет собой среднее значение для трех повторов.

Результаты и обсуждение

Принцип иммуноанализа на основе AuNR для обнаружения мио

Плазмонный иммуноанализ сочетает сэндвич-иммуноанализ с плазмонными характеристиками AuNR. Ab1 и Ab2 были конъюгированы с глюкозооксидазой (GOx-Ab2) (рис. 1). После связывания меченный GOx Ab2 может катализировать свой субстрат глюкозу с образованием глюконовой кислоты и перекиси водорода (H ₂ О ₂ ). H ₂ О ₂ действует как окислитель для травления AuNR при определенной концентрации HRP и Br ^- , что приводит к значительному синему сдвигу в спектре ППР AuNR и уменьшению оптической плотности AuNR на длине волны 850 нм. В плазмонном иммуноанализе количество GOx пропорционально целевой концентрации. Степень синего сдвига в спектре ППР AuNR и снижение оптической плотности AuNR при 850 нм положительно коррелировали с целевыми концентрациями. Результаты плазмонного иммуноанализа могут быть квалифицированы с помощью считывающего устройства для микропланшетов для измерения синего сдвига спектра ППР AuNR или с помощью считывающего устройства для смартфона для измерения изменения оптической плотности AuNR на длине волны 850 нм.

Принципиальная схема плазмонного иммуноанализа на основе AuNR для обнаружения Myo

Оптимизация плазмонного иммуноанализа для обнаружения мио

Концентрации HRP и CTAB напрямую влияют на обнаруживаемые результаты. В этой работе AuNR травили раствором, содержащим 100 мкМ H ₂ О ₂ и различные концентрации HRP и CTAB в цитратном буфере (40 мМ, pH 4,0), от которых регистрировали LSPR-сдвиг AuNR. В этом исследовании были выбраны 1,5 мкМ HRP и 6,25 мкМ CTAB из-за максимального LSPR-сдвига AuNR, наблюдаемого при этих концентрациях (рис. 2а). При оптимизированных концентрациях HRP и CTAB AuNP травили 100 мкМ H ₂ О ₂ в цитратном буфере (20 мМ, pH 4,0). Спектр LSPR AuNR был смещен в синий цвет, а поглощение AuNR на длине волны 850 нм со временем уменьшалось (рис. 2b). Через 30 мин LSPR AuNR стабильны. Поэтому 30 минут было выбрано в качестве времени для H ₂ О ₂ травление AuNR. AuNP травились различными концентрациями H ₂ О ₂ . Спектр AuNRs LSPR был смещен в синий цвет с уменьшением H ₂ О ₂ концентрации (рис. 2в). ПЭМ-изображения AuNR показали, что с увеличением H ₂ О ₂ При концентрации AuNR форма AuNR изменилась с прямоугольной на эллиптическую (рис. 2d – f). Эти результаты продемонстрировали, что спектр LSPR AuNRs зависел от концентрации H ₂ O ₂

Оптимизация и характеристика AuNR на основе плазмонного иммуноанализа для обнаружения Myo. а Оптимизация концентрации HRP и CTAB в AuNR на основе плазмонного иммуноанализа. Различные цветные линии представляют разные концентрации CTAB, среди которых предпочтительны 6,25 мМ CTAB и 1,5 мкМ HRP. б Оптимизация времени для H ₂ О ₂ травление AuNR, для которых 1,5 мкМ HRP, 6,25 мМ CTAB и 100 мкМ H ₂ О ₂ предпочтительно в цитратном буфере (20 мМ, pH 4,0) в течение 30 минут. c LSPR-спектр AuNR с добавлением 50 мкл различных концентраций H ₂ О ₂ . г - е ПЭМ-изображения AuNR, травленных различными концентрациями H ₂ О ₂ (0 мкМ, 10 мкМ и 100 мкМ) в течение 30 мин. г LSPR-сдвиг AuNR при различных концентрациях GOx. ч Спектр LSPR AuNR в присутствии GOx-Ab2 при различных степенях разбавления. я Сдвиг спектра LSPR AuNR в прямом плазмонном иммуноанализе, покрытых различными концентрациями Myo. Каждое значение представляет собой среднее значение для трех повторов

GOx может катализировать глюкозу с образованием H ₂ О ₂ , которые могли травить AuNR. В этой работе 0,5 мМ глюкозы катализируется различными концентрациями GOx, и продуцируемый H ₂ О ₂ был использован для травления AuNR (рис. 2ж). Когда концентрация GOx была на уровне 100 пг / мл ^-1 (6,66 × 10 ⁻¹¹ моль л ⁻¹ ), спектр LSPR AuNR показал явный сдвиг в синий цвет, что свидетельствует о высокой чувствительности основанного на AuNR плазмонного иммуноанализа. GOx конъюгировали с Ab2, а затем разводили до различных концентраций. Каталитическая активность GOx-Ab2 была подтверждена с помощью разложенного GOx и протравленного AuNR. Спектр LSPR AuNR был смещен в синий цвет при увеличении концентрации GOx-Ab2 (фиг. 2h), что указывает на то, что GOx-Ab2 сохраняет хорошую каталитическую активность. Кроме того, Myo наносили на микропланшеты и инкубировали с GOx-Ab2. Через 30 мин GOx-Ab2 трижды промывали буфером PBST. Затем в микролунку добавляли глюкозу с последующим добавлением AuNR к раствору глюкозы через 30 мин. Синий сдвиг спектра LSPR AuNR увеличивается с увеличением концентрации GOx-Ab2 (рис. 2i), демонстрируя, что Ab2 сохраняет свою иммунологическую активность, в то время как GOx сохраняет свою каталитическую активность.

Считыватель плазмонного иммуноанализа на смартфоне для определения миообнаружения на месте

Обычно описываемые плазмонные иммуноанализы интерпретируются количественно коммерческим ридером для микропланшетов или спектрометром, что ограничивает их применимость в регионах с ограниченными ресурсами. Чтобы улучшить доступность нашего плазмонного иммуноанализа, мы подготовили считывающее устройство для плазмонного иммуноанализа на основе смартфона, которое использует датчик внешней освещенности (ALS) смартфона для измерения интенсивности проходящего света AuNR. В большинстве смартфонов ALS - это конфигурация по умолчанию, используемая для автоматической регулировки интенсивности света экрана в зависимости от различных обстоятельств. Ранее мы сообщали об использовании БАС в ридере колориметрических тестов [26,27,28]. Принцип и инструкция для ридера плазмонного иммуноанализа были задокументированы в предыдущей публикации [29]. Напечатанный на 3D-принтере считыватель плазмонного иммуноанализа состоит из двух частей:часть 1 (100 мм × 40 мм × 40 мм) может быть закреплена на смартфоне для обеспечения стабильного источника света, питаемого от двух батарей (1,5 В), и часть 2 ( 76 мм × 13 мм × 12 мм) можно было использовать для размещения микролунок. После завершения плазмонного иммуноанализа микролунка была собрана на части 2, как показано на рис. 3а, а затем часть 2 была закреплена на части 1. Затем часть 1 была прикреплена к ALS смартфона. В этой конструкции светодиод был совмещен с ALS смартфона. После включения переключателя свет от светодиода передавался через AuNR и измерялся с помощью ALS. Интенсивность проходящего света каждой микролунки можно было определить, сдвинув часть 2. Через приложение для Android Light Meter результаты измерений можно было представить на экране смартфона. В плазмонном иммуноанализе максимальный спектр поглощения AuNR составлял 850 нм, и с увеличением H ₂ О ₂ концентрации, поглощение AuNR при 850 нм постепенно уменьшалось. Поэтому длина волны 850 нм была выбрана в качестве длины волны возбуждающего света светодиода в считывающем устройстве для плазмонного иммуноанализа. Общая стоимость считывающего устройства для плазмонного иммуноанализа на базе смартфона составляла около двух долларов. Чтобы сравнить результаты измерений с помощью считывающего устройства для плазмонного иммуноанализа на базе смартфона и коммерческого считывающего устройства для микропланшетов, были измерены интенсивность прошедшего света и поглощение AuNR в микролунке. Результаты, полученные с помощью этих устройств, были согласованы и показали корреляцию 99,1% (рис. 3b), что указывает на то, что считывающее устройство для плазмонного иммуноанализа на смартфоне было сопоставимым инструментом с точки зрения точности.

Механизм считывателя плазмонного иммуноанализа на базе смартфона. а Схема напечатанного на 3D-принтере устройства считывания плазмонного иммуноанализа на базе смартфона. Интенсивность проходящего света AuNR измеряли с помощью ALS смартфона, и значение отображалось на экране. б Корреляция между результатами, полученными с помощью считывающего устройства для плазмонного иммуноанализа на смартфоне, и результатов, полученных с помощью считывающего устройства для микропланшетов. Каждое значение представляет собой среднее значение для трех повторов

Аналитические характеристики плазмонного иммуноанализа для обнаружения мио

Для проведения плазмонного иммуноанализа на основе AuNR были проанализированы различные концентрации Myo. LSPR-спектр AuNR регистрировали коммерческим спектрометром, а интенсивность прошедшего света LSPR-спектра AuNR измеряли с помощью считывающего устройства для плазмонного иммуноанализа на базе смартфона. С увеличением концентрации Myo спектр LSPR AuNR смещался в синий цвет, а поглощение спектра LSPR AuNR уменьшалось (рис. 4a). LSPR синий сдвиг AuNR использовали для количественного анализа концентрации Myo. Когда концентрация Myo была на уровне 0 пг / мл ^-1 синий сдвиг LSPR AuNR составлял 0 нм. С увеличением концентрации Myo пики LSPR AuNR были смещены в синий цвет (дополнительный файл 1:Рисунок S1). Измеренные интенсивности прошедшего света использовали для количественного определения концентраций Myo. Линейный диапазон обнаружения AuNR на основе плазмонного иммуноанализа, количественно определяемый синим сдвигом спектра LSPR, составлял 0,1–1000 нг / мл ^-1 (Дополнительный файл 1:Рисунок S2-S3) с пределом обнаружения 57,81 пг / мл ⁻¹ . Измеренная интенсивность проходящего света AuNR уменьшалась с увеличением концентрации Myo (рис. 4b). Измеренные интенсивности прошедшего света использовали для количественного определения концентраций Myo. Линейный диапазон обнаружения плазмонного иммуноанализа, количественно определяемый по интенсивности проходящего света AuNR, составлял 0,1–1000 нг / мл ^-1 (Рис. 4c) с пределом обнаружения 64,13 пг / мл ⁻¹ . ОИМ определялся как концентрация Myo в сыворотке крови выше 90 нг / мл ^-1 . Для обнаружения Myo в клинических образцах сыворотку перед анализом разводили в десять раз, чтобы улучшить согласованность результатов измерений.

Плазмонный иммуноанализ для выявления Myo. а Сдвиги пиков LSPR AuNR при различных концентрациях Myo. б Поглощение AuNR для обнаружения различных концентраций Myo. c Калибровочная линия плазмонного иммуноанализа для обнаружения Myo, считанная считывателем на смартфоне. Каждое значение представляет собой среднее значение для трех повторов

Сравнение плазмонного иммуноанализа и ELISA

ИФА - один из наиболее широко используемых методов клинической диагностики. В этой работе мы сравнили эффективность обнаружения ELISA и плазмонного иммуноанализа для Myo-анализа. В обоих методах использовали одни и те же антитела и антигены. Линейный диапазон обнаружения ELISA составлял 25–1000 нг / мл ^-1 . и LOD составлял 22,7 нг / мл ^-1 (Рис. 5a, Дополнительный файл 1:Рисунок S4). По сравнению с ELISA, иммуноферментный плазмонный анализ был более чувствительным и демонстрировал более широкий диапазон обнаружения. Кроме того, чтобы продемонстрировать возможность использования плазмонного иммуноанализа для клинического применения, Myo в клинических образцах сыворотки измеряли с помощью плазмонного иммуноанализа и ELISA. Результаты плазмонного иммуноанализа считывались коммерческим ридером для микропланшетов и считывающим устройством для плазмонного иммуноанализа на смартфоне, соответственно. Результаты этих двух методов хорошо коррелировали (рис. 5b), что указывает на то, что иммуноферментный плазмонный анализ на основе AuNR может быть использован для клинической диагностики ОИМ.

Сравнение плазмонного иммуноанализа и обычного ELISA для обнаружения Myo. а Калибровочная линия ELISA для обнаружения Myo. б Сравнение плазмонного иммуноанализа и стандартного ELISA при тестировании образцов сыворотки. Поперечная ось представляет результаты ELISA, а вертикальная ось представляет результаты плазмонного иммуноанализа. Каждое значение представляет собой среднее значение для трех повторов

Выводы

Воспользовавшись уникальными оптическими свойствами AuNR, мы успешно разработали плазмонный иммуноанализ для выявления острого инфаркта миокарда в клинических образцах. Чтобы повысить эффективность иммуноанализа при тестировании на месте, мы подготовили на смартфоне устройство считывания плазмонного иммуноанализа, которое использует ALS смартфона для измерения интенсивности проходящего света AuNR. Предел обнаружения иммуноферментного плазмонного анализа на основе AuNR, считываемого устройством считывания на смартфоне, составлял 0,057 нг / мл ^-1 . . Этот биосенсор был более чувствительным, чем обычный ELISA, что делало его многообещающей платформой для биомедицинских приложений. Кроме того, благодаря использованию считывающего устройства для плазмонного иммуноанализа на базе смартфона биосенсор не требует сложного экспериментального оборудования, что делает его более доступным в регионах с ограниченными ресурсами.

Сокращения

Ab1:

Антитело против Myo

Ab2:

Антитело против Myo 2

AgNPR:

Треугольные серебряные нанопризмы

ALS:

Датчик внешней освещенности

AMI:

Острый инфаркт миокарда

AuNP:

Наночастицы золота

AuNR:

Золотые наностержни

ELISA:

Иммуноферментный анализ

GOx:

Глюкозооксидаза

H ₂ О ₂ :

Перекись водорода

HRP:

Пероксидаза хрена

LSPR:

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс

Myo:

Сывороточный миоглобин

POCT:

Тестирование на месте