Получение липосом на основе глицирретиновой кислоты с использованием метода лиофилизирующего монофазного раствора:предварительный состав, оптимизация и оценка in vitro

Фон

Глицирретиновая кислота (GA), один из видов тритерпеновых сапонинов, в основном извлекается из корней глицирризы традиционной китайской медицины [1]. Исследования показали, что GA обладает очевидным антимикробным, противовирусным и противоопухолевым действием и обычно используется для клинического лечения хронического гепатита и рака печени [2,3,4]. Согласно Системе биофармацевтической классификации, GA относится к препарату II типа. Из-за низкой полярности, высокой гидрофобности и плохой растворимости молекул GA его биодоступность при пероральном введении относительно невысока [5]. Более того, GA может вызывать задержку натрия и потерю калия [6], которые связаны с гипертензией, в то время как побочные эффекты GA, по-видимому, зависят от дозы. Следовательно, использование соответствующих стратегий рецептуры для увеличения абсорбции и поддержания эффективной концентрации GA значительно улучшит его биодоступность и безопасность.

Превосходство липосом как носителей лекарств широко признано [7,8,9]. Их функциональные преимущества в основном демонстрируются через следующие аспекты:(1) липосомы обладают хорошей биосовместимостью и безопасностью; (2) липосомы усиливают направленную доставку лекарств к лимфатическим узлам и уменьшают ингибирующие эффекты или повреждения, которые противораковые лекарственные средства оказывают на нормальные клетки и ткани; (3) липосомы-носители лекарственного средства подходящего размера обладают повышенной проницаемостью и удерживающими эффектами на участках солидных опухолей, инфекции и воспаления, где проницаемость капиллярных кровеносных сосудов увеличивается, демонстрируя способность пассивного нацеливания; (4) липосомы могут нести как гидрофобные, так и водорастворимые лекарственные средства; и (5) поверхность липосом может быть модифицирована и связана с функциональными группами. Благодаря этим преимуществам многие липосомные препараты были одобрены.

Продукты, полученные обычными способами получения липосом, представляют собой водные суспензии липосом. Однако водные суспензии липосом относительно нестабильны и могут протекать, сливаться и подвергаться гидролизу фосфолипидов во время хранения, что приводит к ограниченной способности к долгосрочному хранению [10]. В настоящее время эффективным способом решения этих проблем является получение пролипосом [11]. Пролипосома - это порошок с хорошей текучестью, который состоит из обезвоженных липосомальных компонентов и вспомогательных веществ. Липосомы можно реконструировать путем диспергирования пролипосомы в воде перед нанесением. Распылительная сушка и сублимационная сушка - два наиболее распространенных метода приготовления пролипосом [12], но они имеют несколько ограничений в применении. Например, сушка распылением не подходит для термочувствительных лекарств и часто может привести к таким проблемам, как прилипание к стенкам из-за низкого теплового КПД оборудования. Структурные перестройки липосомных бислоев могут происходить в процессе распылительной сушки [13]. Обычно используемый метод сублимационной сушки представляет собой систему водной суспензии, но для лиофилизации воды требуется много времени, поэтому этот метод является очень дорогостоящим и трудоемким.

В последние годы был разработан новый метод приготовления пролипосом (метод лиофилизации в монофазном растворе) [14, 15]. Этот метод включает растворение липидов, лекарственного средства и водорастворимых лиопротекторов в системах сорастворителей трет-бутиловый спирт (ТВА) / вода с последующим получением пролипосом сублимационной сушкой с последующим добавлением воды с образованием гомогенной суспензии липосом. Этот метод имеет несколько преимуществ:(1) добавление ТВА может значительно улучшить скорость сублимации льда, что приводит к быстрой и тщательной лиофилизации, что экономически выгодно. В то же время быстрая сублимация полезна для предотвращения разрушения комков [16]. (2) Метод монофазного раствора лиофилизации - это одностадийный процесс, который является высокоэффективным методом крупномасштабного приготовления липосом. (3) Хотя ТВА не указан в Руководстве ICH по остаточным растворителям, он, вероятно, попадет в категорию малотоксичных растворителей класса 3 на основании его сходства с LD ₅₀ данные о токсичности для других растворителей класса 3 [17]. (4) Этим методом можно получить стерильный порошок. (5) Он подходит для лекарств с плохой растворимостью в воде или низкой водостойкостью [18].

Было несколько сообщений об использовании системы лиофилизации ТВА / вода для приготовления липосом. Однако исследования этой системы недостаточны, и многие вопросы все еще остаются. Например, изменение скорости сублимации систем ТВА / вода с разными концентрациями, изменения твердотельных свойств конкретного лекарственного средства после лиофилизации системами ТВА / вода с разными концентрациями, а также процесс гидратации и сборки лиофилизированного порошка. все еще неясно. С другой стороны, растворимость конкретного гидрофобного лекарственного средства в сорастворителе TBA / вода с различными пропорциями и температурами очень специфична. Приведенная выше информация имеет решающее значение для рецептуры и технологического проектирования липосом-носителей лекарственного средства. Таким образом, в настоящем исследовании мы использовали GA в качестве модельного лекарственного средства для проведения предварительного исследования рецептуры, как описано выше. Кроме того, используя средний диаметр и эффективность захвата в качестве основных критериев оценки, мы оптимизировали состав и переменные обработки GA-липосом, приготовленных методом лиофилизации в монофазном растворе, используя дизайн Бокса-Беннкена. Было оценено влияние типов защитных средств для лиофилизации на качество липосом, а также высвобождение липосом in vitro и их поглощение клетками гепатомы.

Методы / экспериментальные

Материалы

Глицирретиновая кислота (чистота> 98%) была получена от Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. (Далянь, Китай). Фосфатидилхолин сои (Lipoid S100) был приобретен у Lipoid GmbH (Людвигсхафен, Германия). Холестерин был приобретен в компании J&K Scientific Ltd. (Пекин, Китай). Контрольное соединение GA было приобретено в Национальном институте контроля пищевых продуктов и медикаментов (Пекин, Китай). FITC-PEG-DSPE (молекулярная масса 2000) был приобретен в Shanghai Ponsure Biotech, Inc. (Шанхай, Китай). Трет-бутиловый спирт (> 98%) и все другие реагенты, если не указано иное, были приобретены у Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Пекин, Китай). Деионизированная вода была приготовлена ​​с помощью системы очистки воды Milli-Q (Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США).

Исследование растворимости GA, SPC и холестерина в системе сорастворителей TBA / вода

Насыщенные растворы ТВА-вода (30 мл) ГА с различным объемным процентным содержанием ТВА были приготовлены путем перемешивания избытка лекарственного средства в соответствующем носителе при 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C и 45 ° C. за 72 ч. После центрифугирования (15 мин при 3000 об / мин) супернатант пропускали через микропористые фильтры 0,45 мкм. Растворимость при насыщении GA измеряли с помощью ВЭЖХ после адекватного разбавления. Было выполнено три повтора для каждого сорастворителя ТВА / вода. Анализ ВЭЖХ выполняли на системе ВЭЖХ LabAlliance (модель серии III) (Lab Alliance, Тяньцзинь, Китай), оснащенной четвертичным насосом, автосамплером и отсеком для колонки, соединенным с УФ-детектором. Разделение проводили на колонке C18 (4,6 мм × 250 мм; 5 мкм; Dikma Technologies, Пекин, Китай); метанол и вода (90:10 V / V ) использовали в качестве подвижной фазы при скорости потока 1,0 мл / мин. Аналиты определялись УФ-детектором при 250 нм.

Растворимость фосфатидилхолина сои (SPC) (или холестерина) в системе сорастворителей TBA / вода оценивалась турбидиметрическим методом [19, 20]. Вкратце, 10 мг SPC (или холестерина) растворяли в ТВА при 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C и 45 ° C с получением прозрачного раствора; температура поддерживалась на протяжении всего эксперимента. Увеличивающееся количество очищенной воды при той же температуре добавляли к раствору TBA SPC (или холестерина) при 25 ° C до тех пор, пока впервые не произошло помутнение и не было зарегистрировано значение критического объема воды. Мутность можно определить, определив значение поглощения при 655 нм (> 0,04) относительно контрольного раствора (очищенная вода) на спектрофотометре модели T6 UV-Vis (Purkinje General Instrument Co., Ltd., Пекин).

Приготовление липосом с использованием метода монофазного раствора лиофилизации

GA, SPC и холестерин растворяли в TBA при 45 ° C, а водорастворимый лиопротектор, такой как маннит, лактоза, сахароза и трегалоза, растворяли в воде при 45 ° C. Затем эти два раствора смешивали в соответствующих соотношениях, чтобы получить третий прозрачный изотропный однофазный раствор (общий объем 60 мл). После стерилизации однофазного раствора фильтрованием через поры 0,22 мкм им заполняли 10 мл флаконы для сублимационной сушки с объемом заполнения 2,0 мл. После предварительного замораживания в течение 12 часов при -40 ° C, лиофилизацию проводили при температуре полки -50 ° C в течение 24 часов при давлении в камере 1-20 Па в лиофилизаторе (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., Китай)

Измерение размера частиц и эффективности инкапсуляции липосом

Суспензию липосом готовили добавлением 5 мг порошка пролипосом к 5 мл очищенной воды и последующим перемешиванием на вортексе в течение 1 мин дважды с 15-минутным интервалом для полной гидратации. Для анализа размера липосом использовали лазерный анализатор размера частиц (Nano ZS90 Malvern Instruments, Великобритания).

Эффективность инкапсуляции GA в липосомы определяли методом ультрафильтрации-центрифугирования. Вкратце, с помощью пипетки внесите 1 мл липосомальной дисперсии (500 мкг пролипосом в 5 мл очищенной воды) в мерную колбу на 10 мл, затем добавьте 5 мл очищенной воды, 2 мл ацетона и разбавьте до 10 мл очищенной водой. Перенесите 0,5 мл этой суспензии в верхнюю камеру центрифужного фильтра (Amicon Ultra-0,5, Millipore, Cdduounty Cork, Ирландия) с отсечкой молекулярной массы 50 кДа, которую центрифугировали при 10000 об / мин в течение 30 минут при 15 ° C, используя ультрацентрифуга (CP70MX, Hitachi Koki Co., Ltd., Япония). Затем 20 мкл ультрафильтрата вводили в систему ВЭЖХ при длине волны УФ-поглощения 250 нм, и содержание GA было названо содержанием свободного лекарственного средства. Эффективность инкапсуляции (EE) рассчитывалась в соответствии со следующими уравнениями

где W _{бесплатно} это количество бесплатного препарата и W _всего - общее количество препарата.

Определение скорости сублимации смесей ТВА / воды

Один миллилитр смесей ТВА / вода с различным процентным содержанием ТВА (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% и 90%) помещали в 10 мл флаконы для сублимационной сушки. , соответственно. Смеси ТВА / вода предварительно замораживали при -40 ° C в течение 12 ч, а затем лиофилизировали с помощью лиофилизатора (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., Китай) при -50 ° C. Регистрировали время, когда смеси ТВА / вода полностью исчезали из флаконов для сублимационной сушки, и рассчитывали скорость сублимации путем деления объема (мкл) на время (мин).

Определение давления насыщенного пара смесей TBA / вода

Детали экспериментальной установки и процедуры работы описаны в [21, 22]. Давление паров системы ТВА / вода (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% и 90%) измеряли статическим методом. Устройство состояло из рабочего эбуллиометра, заполненного смесью ТВА / вода, эталонного эбуллиометра, заполненного чистой водой, буферной емкости, двух конденсаторов, двух датчиков температуры и системы контроля давления. Равновесное давление в системе определялось температурой кипения чистой воды в эталонном эбуллиометре в терминах зависимости температуры от давления, представленной уравнением Антуана [23].

Определение растворимости GA

Растворимость свободного GA в воде определяли добавлением избытка GA (10 мг) к 10 мл чистой воды при перемешивании магнитной мешалкой (300 об / мин) на водяной бане с термостатическим контролем (DF-101S, Henan Yuhua instrument Co., Ltd., Китай) при 25 ° C до достижения равновесия (48 ч). Образцы фильтровали через мембранный фильтр 0,45 мкм, разбавляли подходящим образом метанолом и анализировали с помощью ВЭЖХ [24]. Эксперименты проводились в трех экземплярах.

Наблюдение за морфологией поверхности предварительно замороженных смесей ТВА / воды

Пять миллилитров смеси вода / трет-бутанол наливали в чашку Петри диаметром 90 мм, затем замораживали в холодной ловушке (-40 ° C); замороженные образцы наблюдали с помощью оптического микроскопа XSP-4C (Shanghai Changfang Optical Instrument Co. Ltd., Шанхай, Китай).

Просвечивающая электронная микроскопия

Появление липосом наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии Hitachi HT7700 (TEM) (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 100 кВ. Суспензию липосом получали добавлением 5 мг порошка пролипосом к 5 мл очищенной воды при комнатной температуре, перемешивали на вортексе в течение 10 с и затем оставляли на 30 с. Каплю отбирали микропипеткой, затем помещали на медную сетку с углеродным покрытием. Избыток суспензии удаляли промоканием сетки фильтровальной бумагой. Отрицательное окрашивание с использованием 1% раствора фосфорновольфрамовой кислоты ( w / w , pH 7,1) наносили непосредственно на осадок. Избыток удаляли фильтровальной бумагой и оставляли осадок высыхать перед анализом.

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

Спектры инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) образцов получали на спектрофотометре Nicolet 6700 FTIR (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Каждый образец и бромид калия смешивали в агатовой ступке и прессовали в тонкий диск. Диапазон сканирования 4000–400 см ⁻¹ . и разрешение составляло 4 см ⁻¹ .

Дифференциальная сканирующая калориметрия

Измерения дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) проводили на сканирующем калориметре ДСК HSC-1 (Hengjiu Instrument, Ltd., Пекин, Китай). Образцы массой 15 мг помещали в алюминиевые поддоны и герметично закрывали прессом для образцов поддонов. Зонды нагревали от 25 до 350 ° C со скоростью 10 ° C / мин в атмосфере азота.

Дифракция рентгеновских лучей

Структурные свойства образцов получены на рентгеновском дифрактометре D8 Focus (Bruker, Германия) с Cu-Kα-излучением. Измерения проводились при напряжении 40 кВ и 40 мА. Образцы сканировали под углом от 5 ° до 60 °, скорость сканирования составляла 5 ° / мин.

Стабильность пролипосомы GA

Порошки пролипосом GA переносили в стеклянный флакон, заполняли азотом, герметично закрывали и хранили вдали от света при комнатной температуре. Тестирование стабильности проводилось в течение 6 месяцев с использованием в качестве показателей эффективности захвата и размера частиц восстановленных липосом.

Выпуск лекарства in vitro

Высвобождение ГА из липосом наблюдали методом диализа при 37 ± 0,5 ° C. После восстановления липосом в PBS (pH 7,4) или физиологическом растворе для получения 0,5 мг / мл GA аликвоту каждой липосомальной дисперсии (5 мл) помещали в диализный мешок (отсечение молекулярной массы 8000–14000 Да) и подвергали анализу. плотно закрытый. Затем пробирку погружали в 150 мл среды для высвобождения, PBS (pH 7,4) или физиологического раствора, содержащего 0,1% ( v / v ) Твин 80 для поддержания состояния стока [25, 26]. При перемешивании высвобождающей среды с использованием магнитной мешалки при 300 об / мин образцы (1,5 мл) отбирали через заранее определенные интервалы времени из высвобождающей среды в течение 12 ч, которые повторно заполняли тем же объемом свежей среды. Концентрацию GA определяли с помощью ВЭЖХ после соответствующего разбавления метанолом.

Использование клеток in vitro

Флуоресцентные липосомы получали методом лиофилизации в монофазном растворе. Вкратце, смесь 30 мг GA, 254 мг SPC, 75,5 мг холестерина и 21,2 мг FITC-PEG-DSPE растворяли в TBA. Далее 1016 мг трегалозы растворяли в воде. Затем эти два раствора смешивали, чтобы получить прозрачный однофазный раствор (общий объем 30 мл). После стерилизации однофазного раствора фильтрованием через поры 0,22 мкм его разливали в 10-миллилитровые флаконы для лиофилизации с объемом заполнения 2,0 мл, затем лиофилизировали в течение 24 часов и добавляли воду для восстановления липосом до использования.>

Клетки HepG2 (Wanleibio, Co., Ltd., Шэньян, Китай) культивировали в DMEM с 10% FBS (фетальная бычья сыворотка). Клетки высевали до достижения 90% слияния в 6-луночные планшеты, и клетки культивировали в увлажненном инкубаторе при 37,0 ° C с 5,0% CO ₂ . После 24-часовой инкубации 200 мкл суспензии липосом FITC-GA добавляли к 1 мл суспензии клеток HepG2 (1 × 10 ⁴ клеток на лунку). После инкубации в течение 0,5 ч, 1 ч, 2 ч и 4 ч клетки промывали трижды PBS с pH 7,4 и гасили внеклеточную флуоресценцию 0,4% ( w / v ) Трипановый синий раствор. Клетки лизировали 1% ( w / v ) Тритон Х100. Интенсивность флуоресценции клеточного лизата при возбуждении 495 нм и эмиссии 520 нм измеряли с использованием флуоресцентного спектрофотометра RF5301 (Shimadzu, Tokyo, Japan). Значения относительной флуоресценции были преобразованы в концентрации фосфолипидов на основании стандартной кривой зависимости концентрации фосфолипидов от интенсивности флуоресценции FITC, измеренной в буфере для лизиса клеток. Концентрацию белка определяли с использованием набора для анализа белка BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). Поглощение выражали как количество фосфолипидов по сравнению с миллиграммами клеточного белка [27].

Результаты и обсуждение

Предварительное исследование

Исследование растворимости

Поскольку липосомы получают с использованием метода монофазного раствора для лиофилизации, было проведено исследование растворимости, чтобы убедиться, что лекарственное средство и материал носителя могут растворяться в растворе ТВА / вода перед лиофилизацией.

На рис. 1 показаны изменения растворимости при насыщении ГА в системе сорастворитель ТВА / вода с различным объемным процентным содержанием. В пределах от 25 ° C до 45 ° C растворимость GA в насыщенном состоянии непрерывно увеличивалась с увеличением процентного содержания TBA от 10 до 60%, а растворимость GA в насыщении составляла> 0,5 мг / мл, когда процентное содержание TBA по объему было> 40%. С другой стороны, растворимость GA при насыщении увеличивается с увеличением температуры раствора ТВА / вода при сохранении того же объемного процента. Разница в растворимости при разных температурах стала более очевидной, когда объемный процент ТВА достиг 30%. Растворимость фосфолипидов и холестерина соевых бобов в системе сорастворителей ТВА / вода показана на столбчатом графике (рис. 2). На рис. 2а, b представлен объем смеси ТВА / вода, необходимый для единицы (1 мг) фосфолипидов и холестерина для достижения насыщенной растворимости при различных температурах соответственно. Серая область представляет объем воды, а черная область представляет объем ТВА. По мере постепенного повышения температуры от 25 до 45 ° C общий объем сорастворителя ТВА / вода и объемный процент ТВА (метки на колонках), необходимый для растворения 1 мг фосфолипида, постепенно уменьшались (рис. 2а). Когда температура повышалась выше 35 ° C, необходимый объем ТВА значительно уменьшался и составлял менее 0,15 мл. Точно так же, когда температура постепенно повышалась с 25 до 45 ° C, наблюдалось уменьшение объема ТВА, необходимого для растворения 1 мг холестерина, тогда как процентное содержание ТВА показало тенденцию к постепенному снижению. Приведенные выше результаты продемонстрировали, что температура и объемный процент ТВА сильно влияют на растворимость фосфолипидов, холестерина и GA.

Насыщенная растворимость GA в сорастворителе TBA / вода с различным объемным процентным содержанием (среднее ± стандартное отклонение, n =3)

Растворимость SPC ( a ) и холестерин ( b ) в сорастворителе TBA / вода с разным объемным процентным содержанием

Сравнение скорости сублимации системы сорастворителя ТВА / вода с различным процентным содержанием

Скорость сублимации напрямую влияет на эффективность производства лиофилизированного порошка. Более высокая скорость сублимации более экономична и может предотвратить разрушение материалов [16]. В этом исследовании мы изучили скорость сублимации различных концентраций систем TBA / вода. Как показано на фиг. 3, скорость сублимации смешанного растворителя постепенно увеличивалась по мере увеличения объемного процентного содержания ТВА с 10 до 90%. Кроме того, скорость сублимации превышала 10 мкл / мин, а объемный процент превышал 60%.

Скорость сублимации сорастворителя ТВА / вода с различным объемным процентным содержанием (среднее ± стандартное отклонение, n =3)

Чтобы определить причину разницы в скорости сублимации ТВА с разным объемным процентным содержанием, мы сначала исследовали морфологию поверхности замороженных образцов. На рис. 4 представлены оптические микроскопические изображения раствора ТВА / вода с объемным процентным содержанием от 40% до 80% (ТВА с объемным процентным содержанием <30% не может быть исследован, поскольку он быстро тает под оптическим микроскопом). По сравнению с ТВА с объемным процентом 40%, ТВА с объемом> 50% имеет четкие и разбросанные игольчатые структуры. Мы предполагаем, что по мере увеличения объемного процента ТВА диаметр игольчатых кристаллов становится меньше, что приводит к увеличению удельной поверхности и, следовательно, к увеличению скорости сублимации.

Морфология поверхности сорастворителя ТВА / воды с различным процентным содержанием ТВА по оптическому микроскопу (увеличение × 100). а 40%. б 50%. c 60%. г 70%. е 80%

Кроме того, мы также измерили давление насыщенного пара системы сорастворитель ТВА / вода с различным объемным процентным содержанием при 25 ° C. Фиг. 5 представляет собой гистограмму изменений давления насыщенного пара системы сорастворитель ТВА / вода с различным объемным процентным содержанием ТВА. Как показано на рисунке, давление насыщенного пара смешанного растворителя имеет тенденцию постепенно увеличиваться по мере увеличения объемного процента ТВА. Поскольку температура положительно коррелирует с давлением насыщенного пара, согласно уравнению Антуана (уравнение 2), мы можем сделать вывод, что давление насыщенного пара в системе сорастворителей при температуре лиофилизации (-50 ° C) будет увеличиваться в процентном отношении к объему. TBA увеличивается, и это может быть одной из причин постепенного увеличения скорости сублимации.

где p давление пара, T это температура, A и B являются константами для конкретных компонентов.

Давление насыщенного пара ТБА / сорастворителя воды с различным объемным процентным содержанием (среднее ± стандартное отклонение, n =3)

Влияние лиофилизации на физические и химические свойства ГА в системе сорастворителей ТВА / вода с различным объемным процентным содержанием

Чтобы исследовать влияние лиофилизации на физико-химические свойства GA в системе сорастворителей TBA / вода, был проведен следующий эксперимент. Десять миллиграммов GA растворяли в 8 мл сорастворителя ТВА / вода с различными объемными процентами ТВА (40%, 50%, 60%, 70% и 80%). После стерилизации однофазного раствора фильтрованием через поры 0,22 мкм им заполняли 10 мл флаконы для сублимационной сушки с объемом заполнения 2,0 мл. Сублимационную сушку проводили при -50 ° C в течение 24 часов с помощью лиофилизатора.

Спектры DSC лиофилизированного порошка после растворения GA в системе сорастворителей TBA / вода с различным объемным процентным содержанием TBA показаны на фиг. 6a. Кривая DSC необработанного лекарственного средства показывает очевидный эндотермический пик при 301 ° C, что является точкой плавления GA. Лиофилизация в системе сорастворителей ТВА / вода с различным объемным процентным содержанием ТВА вызвала прямой сдвиг пика плавления ГА. Величина сдвига пика плавления увеличивалась по мере уменьшения объемного процента TBA.

DSC ( а ), XRD ( b ) и FTIR ( c ) ГК после лиофилизации в сорастворителе ТВА / вода с различным объемным процентным содержанием; (a) GA, (b) 40% TBA, ( c ) 50% ТВА, (г) 60% ТВА, (д) ​​70% ТВА, и (е) 80% ТВА

Предыдущие исследования уже показали, что концентрация ТВА может глубоко влиять на образование сложной смеси кристаллических, аморфных или метастабильных фаз [28]. В некоторых случаях использование ТВА может привести к снижению кристалличности, а в другом случае - наоборот [29].

Спектры дифракции рентгеновских лучей (XRD) лиофилизированного порошка после растворения GA в системе сорастворителей TBA / вода с различным объемным процентным содержанием TBA показаны на фиг. 6b. Спектр XRD необработанного лекарственного средства показывает несколько отчетливых пиков дифракции кристаллов между 5 ° и 20 °. Лиофилизация в системе сорастворителей ТВА / вода с различным объемным процентным содержанием ТВА вызвала исчезновение дифракционных пиков при 5-20 ° в спектрах XRD образцов. Это указывало на то, что исходный кристалл лекарства стал аморфным.

Спектры FTIR лиофилизированного порошка после растворения GA в системе сорастворителей TBA / вода с различным объемным процентным содержанием TBA показаны на фиг. 6c. Форма спектра FTIR необработанного лекарственного средства соответствует форме спектра лиофилизированного порошка в системе сорастворителей ТВА / вода с различным объемным процентным содержанием ТВА в пределах 4000–400 см ^-1 диапазон. Не наблюдалось появления характерных пиков для новых функциональных групп, что свидетельствует о том, что химическая структура GA оставалась такой же после лиофилизации в TBA с различным объемным процентным содержанием.

Переход от кристаллической формы к аморфной может изменить растворимость лекарства, тем самым влияя на инкапсуляцию пролипосом во время гидратированной реконструкции. В этом исследовании мы измерили растворимость в воде лиофилизированного порошка GA при 25 ° C. Мы обнаружили, что растворимость лиофилизированного GA в воде при насыщении постепенно снижалась с 64,10 до 19,27 мкг / мл по мере увеличения объемного процента ТВА с 40 до 80%. Однако она все еще была значительно выше, чем растворимость сырого лекарственного средства в воде (6,36 мкг / мл), что указывает на то, что изменение кристаллической структуры в аморфную во время лиофилизации действительно влияет на растворимость сырого лекарственного средства (рис. 7). P>

Растворимость в воде лиофилизации GA в сорастворителе TBA / вода с различным объемным процентным содержанием (среднее ± стандартное отклонение, n =3)

Однофакторный эксперимент

Есть много факторов, которые могут повлиять на качество липосом. Хорошо известно, что соотношение фосфолипид / лекарство влияет на качество инкапсулята лекарственного средства [30]. Умеренное количество холестерина может улучшить упорядоченное расположение липидной мембраны и ее стабильность. However, high content of cholesterol in the liposome can decrease the flexibility of membrane and thereby hinder the penetration of drug into the lipid bilayer [31]. In this study, we selected three factors that impact on liposome quality and performed a single-factor study to determine the appropriate values for subsequent optimization tests, including quantity of SPC, quantity of cholesterol, and volume percentage of TBA in the co-solvent. The quality of liposomes was evaluated in terms of encapsulation efficiency and mean diameter. Each experiment was performed in triplicate with all other parameters set to constant value, GA 60 mg, pre-freeze temperature − 40 °C, pre-freeze time 12 h. In this study, we compared the results via a scoring system, giving equal weight to both encapsulation rate and mean diameter. Scoring was conducted as follows:

where EE is encapsulation efficiency, MEE is maximum encapsulation efficiency of the group, MD is mean diameter, and MMD is maximum mean diameter of the group.

The experimental design and result are shown in Table 1. As can be seen in the table, within the range tested in this experiment, the highest score can be obtained separately when the amount of SPC is 480 mg (drug-SPC ratio of 1:8, w / w ), the amount of cholesterol is120 mg (cholesterol-SPC ratio of 1:4, w / w ), and volume percentage of TBA in the co-solvent is 50%. Therefore, these parameters were chosen as the center level of response surface optimization design, respectively.

Parameter Optimization by Box-Benhnken Design

To further study the interactions between the various factors, parameter optimization was performed by Box-Benhnken design. Based on the results of single-factor experiments, we investigated and optimized the interactions between the parameters, including quantity of SPC (X ₁ ), quantity of cholesterol (X ₂ ), volume percentage of TBA (X ₃ ) by Box-Benhnken design (BBD). Encapsulation efficiency (Y ₁ ) and mean diameter (Y ₂ ) were selected as responses. Optimization process was undertaken with desirability function to optimize the two responses simultaneously. We suppose that Y ₁ and Y ₂ have the same weightiness (importance). Y ₁ had to be maximized, while Y ₂ had to be minimized. The desirable ranges are from 0 to 1 (least to most desirable). Experimental design and results are shown in Table 2. To find the most important effects and interactions, analysis of variance (ANOVA) was calculated by statistical software, Design Expert trial version 8.03 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA). Two quadratic models were selected as suitable statistical model for optimization for two responses encapsulation efficiency and mean diameter. The results of ANOVA relating encapsulation efficiency as response were shown in Table 3, indicating that the model was significant for all factors investigated with F value of 12.81 (P <0,05). In this case, X ₁ , X ₂ , X ₁ X ₂ , X ₁ X ₁ , X ₂ X ₂ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that the influences of the factors (X ₁ and X ₂ ) on encapsulation efficiency were not simply linear. The interaction terms were notably significant, indicating good interactions between the factors. On the contrary, the ANOVA results relating mean diameter as response (Table 3) indicated that the model was not significant for all factors investigated with F value of 1.9 (P> 0,05). In this case, X ₃ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that volume percentage of TBA have significant influence on mean diameter, while quantity of SPC (X ₁ ) and quantity of cholesterol (X ₂ ) do not have a significant effect (P> 0,05). Moreover, there were no significant interactions between the three variables.

In order to provide a better visualization of the effect of the independent variables on the two responses and desirability value, three-dimensional profiles of multiple non-linear regression models are depicted in Fig. 8. Figure 8a–f presented the interaction of X ₁ , X ₂ , and X ₃ under encapsulation efficiency and mean diameter as response respectively. The three-dimensional profiles demonstrated how three pairs of parameters affect the encapsulation efficiency and mean diameter of reconstituted liposomes. For encapsulation efficiency, all the three surfaces are upper convex (Fig. 8a–c), with a maximum point in the center of the experimental domain, which demonstrated that there are good interactions between the three variables. For mean diameter, the shape of Fig. 8d is similar to flat surface, indicating that X ₁ and X ₂ have less effect on mean diameter. The surface contours of Fig. 8e, f both showed a slope; the mean diameter was decreased by increasing the volume percentage of TBA, indicating that factor X ₃ had an obvious effect on mean diameter but there was no obvious interaction between X ₃ and the other two factors.

Three dimensional plots of the effect of X X (a ), X X (b ) and X X (c ) on encapsulation efficiency and the effect of X X (d), X X (e) and X X (f) on mean diameter

Based on the quadratic model, the optimal conditions for liposomes preparation calculated by software were as follows:508 mg phospholipid quantity, 151 mg cholesterol quantity, and 55% volume percentage of TBA. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were found to be 68.55% and 220 nm, respectively.

Selection of the Type and Dosage of Lyoprotectant

Competition for liquid water between the growing ice crystals and the hydrophilic substances (including the hydrophilic portion of the lipid membrane) during freezing leads to adhesion of ice crystals to the phospholipid groups. This can result in damage to the lipid membrane. Lipid membrane fusion following rehydration causes an increase in particle size and leakage of encapsulated drug. Lyoprotectant can reduce liposomal damage during the freeze-thaw process [32]. In this study, we investigated the effect of various types (lactose, sucrose, trehalose, mannitol) and dosage (lyoprotectant to SPC ratio was 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, and 6:1 w / w ) of lyoprotectant on scores of reconstituted liposome. Single-factor experiments were performed while maintaining all other variables constant:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, pre-freeze temperature of − 40 °C, pre-freeze time of 12 h. Experimental results are shown in Fig. 9. The encapsulation efficiency increases firstly and then decreases by decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio from 1:2 to 1:6, wherein lactose, sucrose, and mannitol are respectively used as lyoprotectant. However, the encapsulation efficiency of the trehalose group increases constantly with decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio (Fig. 9a). In terms of the mean diameter (Fig. 9b), it was found that the mean diameter was greater than 218 nm for lactose, sucrose, and mannitol group in the range from 1:2 to1:6. Nevertheless, the mean diameter of trehalose group can be reduced to less than 190 nm when lyoprotectant/SPC weight ratio is more than 4:1; obviously, the protective effect of trehalose is better than other lyoprotectants tested. Trehalose has a good protection ability for membrane, perhaps because of the formation of hydrogen bonds with the polar head groups of lipids, and disruption of the tetrahedral hydrogen bond network of water [33]. According to scores (Fig. 9c), the highest score (0.24) was obtained when trehalose/SPC weight ratio is 4:1 and 6:1. Finally, we choose trehalose and 4:1 (trehalose/SPC weight ratio) for following experiments from the perspective of cost and increasing drug loading.

The effect of mass ratio between cryoprotectant and SPC on encapsulation efficiency (a ), mean diameter (b ) and scores (c ) of reconstituted liposomes (mean  ±  SD, n =3)

Through the above Box-Benhnken design and lyoprotectant screening experiment, the experimental conditions were determinated:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, weight ratio of trehalose to SPC was 4:1. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were 74.87% and 191 nm, respectively.

Transmission Electron Microscopy

In this study, TEM of liposomes suspension was taken at the same time point (same hydration time). We have observed different states in the sample, which could explain the self-assembly behavior of the liposomes. Figure 10a shows the initial state of hydration; it can be seen that a large amount of GA (black dots) is wrapped in dispersed phospholipids (translucent material), and spontaneous aggregation of the phospholipid fragments occurs. Figure 10b shows the morphology of fully assembled liposomes (average diameter of about 200 nm), which were nearly spherical with a phospholipid bilayer structure (the light-gray portion). Moreover, the drug particles (dark gray dots) were entrapped in the lipid bilayer.

Transmission electron micrographs of reconstituted liposomes, (a ) initial state of hydration of proliposomes, (b ) fully assembled liposomes

Stability of GA Proliposome

After 6 months, the proliposome powders have a good mobility and an unaltered appearance. The liposome suspension formed automatically when in contact with purified water. The entrapment efficiency and particle size of the reconstituted liposome were 72.82% and 198 nm. There is no significant difference from the data of the reconstituted liposome 6 months before. Therefore, the GA proliposome could be considered stable at 25 °C for over 6 months.

In Vitro Drug Release Studies

Evaluation of in vitro drug release from encapsulated liposome was done by dialysis method. The in vitro release profiles of GA from GA-loaded liposomes at 37 °C in PBS (pH 7.4) and physiological saline solution are shown in Fig. 11. The release profile of both group showed a fast release (the larger slope) within 1 h, then curve slope becomes smaller after 1 h, the release rate begins to slow down. The drug-release curve shapes of physiological saline solution group are similar to PBS group. The in vitro release of GA from the GA-loaded liposomes was 65.25 ± 4.82% and 69.46 ± 4.32% from PBS and physiological saline solution in 12 h. No significant difference (P  = 0.088, paired t test, SPSS software17.0) was found for the release of GA at different release medium over the entire study period, which demonstrated that the reconstituted liposomes have both sustained-release performance in two kinds of release medium.

In vitro dissolution profiles of GA from GA-loaded liposomes in a PBS and b physiological saline solution (mean ± SD, n =3)

In Vitro Cell Uptake

Figure 12a showed that the uptake process of GA-liposomes by Hep G2 cells is time-dependent under the experimental concentrations. After incubation for 30 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) by Hep G2 cells were 1480 ng. In the range from 30 to 240 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) were gradually increased from 1480 to 2030 ng. Figure 12b–e showed fluorescence microscopy images of Hep G2 cells at 30, 60, 120, and 240 min after ingestion of drug-loaded liposomes, and it is observed that the fluorescence intensity is also gradually increased over time. This result indicates that the reconstituted liposomes prepared by monophase solution method can be effectively uptaken by the hepatoma cells.

In vitro cellular uptake of GA-loaded liposomes by Hep G2 cells. а The uptake amount versus incubation time. б - е Fluorescence microscopy images at 30, 60, 120, and 240 min

Conclusions

In the present work, preformulation investigation, formulation design along with in vitro characterization of GA-loaded liposomes by lyophilization monophase solution method have been done. After carrying out a preformulation study, we found that solubility of GA, cholesterol, and SPC in TBA/water co-solvent was substantially increased when temperature was over 40 °C. Sublimation rate of co-solvent gradually increased with increasing TBA volume percentage, which perhaps relate to surface morphology of the frozen co-solvent and saturated vapor pressure. After lyophilization using TBA/water co-solvent system, GA became amorphous structure; moreover, water solubility increased. This may have an effect on proliposome encapsulation during hydrated reconstruction. After optimization by Box-Benhnken design and screening of lyoprotectant, the optimum conditions (508 mg SPC, 151 mg cholesterol, 55% volume percentage of TBA, 4:1 trehalose/SPC weight ratio) for lyophilization monophase solution process were achieved. Under the optimum conditions, satisfactory encapsulation efficiency (74.87%) and mean diameter (191 nm) of reconstituted liposomes were obtained. The reconstituted liposomes resulted in initial assemble and final spherical shape, as confirmed by TEM analysis. The in vitro release profile of the produced GA-loaded liposome was investigated in the two media and it both showed prolonged release during 12 h. Cellular uptake studies showed that the uptake process of reconstituted liposomes by Hep G2 cells is time-dependent.

Сокращения

BBD:

Box-Benhnken design

DSC:

Дифференциальная сканирующая калориметрия

EE:

Encapsulation efficiency

FTIR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

GA:

Glycyrrhetinic acid

MD:

Mean diameter

SPC:

Soybean phosphatidylcholine

TBA:

Tert-butyl alcohol

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

XRD:

Рентгеновская дифракция