Комбинированные нанолипосомы на основе ингибитора аутофагии (LY294002) и 5-фторурацила (5-FU) для повышения эффективности против плоскоклеточного рака пищевода

Фон

Плоскоклеточный рак пищевода (ESCC) - один из распространенных типов рака пищевода, который более распространен в Восточной Азии, например в Китае [1, 2]. Пятилетняя выживаемость ESCC составляет около 25%. Хирургическое вмешательство является основным методом лечения ESCC; однако считается, что адъювантная химиотерапия будет иметь большое влияние на лечение ESCC [3, 4]. Сообщалось, что химиотерапевтическое лечение, основанное на схеме с одним лекарством, привело к низкой терапевтической эффективности из-за гетерогенности раковых клеток [5]. Раковые клетки часто устойчивы к отдельным противоопухолевым препаратам и по своей природе неэффективны. В этом отношении комбинация двух или более лекарств будет действовать синергетически, воздействуя на различные клеточные мишени [6, 7]. Сообщалось, что ингибиторы аутофагии преодолевают множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) раковых клеток. Когда клетки имеют ограниченное питание и фактор роста, аутофагия обеспечивает столь необходимый гомеостаз раковой среде и способствует ее выживанию [8]. Аутофагия также служит для защиты раковых клеток от химиотерапевтических агентов. В этом исследовании мы выбрали LY294002 (LY) в качестве ингибитора аутофагии [9].

В нескольких исследованиях сообщалось, что ингибиторы аутофагии работают лучше всего в сочетании с противораковыми препаратами. В этом исследовании мы выбрали 5-фторурацил (5-FU) в качестве химиотерапевтического агента. 5-ФУ в основном показан для лечения плоскоклеточного рака и используется у пациентов с раком груди и другими видами рака [10]. 5-ФУ имеет атом фтора в положении С-5 урацила вместо водорода. Противораковый эффект 5-FU возникает в результате регуляции различных молекул, таких как Bax и Bcl-2, и вызывает апоптоз раковых клеток [11, 12]. Несмотря на потенциальный цитотоксический эффект 5-FU и LY, оба агента страдают от плохой растворимости в воде и стабильности, что приводит к короткому периоду полужизни в плазме и нежелательным токсическим эффектам для нормальных клеток [6]. Более того, простая коктейльная смесь обоих противоопухолевых агентов не вызывает синергетического эффекта из-за случайного высвобождения лекарств и неконтролируемого распределения лекарств в различных тканях [7]. Поэтому крайне важно доставлять оба противоопухолевых препарата запрограммированным и строго контролируемым образом, что повысит их терапевтическую эффективность.

Наночастицы широко исследовались в качестве носителей для доставки лекарств для нацеливания на рак [13]. Слабо растворимое лекарство может быть стабильно включено в наночастицы, и, таким образом, его растворимость и биодоступность могут быть улучшены. Среди всех носителей липосомы широко изучались на предмет пригодности для системного применения [14, 15]. Предыдущие исследования показали, что доступны многие коммерческие липосомальные препараты, включая Доксил, Миоцет, ЛипоПлатин и так далее. Системное кровообращение липосом может быть улучшено за счет поверхностного конъюгации полиэтилена (гликоля) (ПЭГ) в качестве гидрофильной оболочки [16]. Наноразмерный и гидрофильный слой PEG будет обеспечивать пролонгированное кровообращение и уменьшать плазменный клиренс, опосредованный ретикулоэндотелием (RES). Кроме того, NP могут пассивно накапливаться в опухолевых тканях за счет усиленного эффекта проницаемости и удерживания (EPR) [17, 18]. Следовательно, можно ожидать, что, если химиотерапевтическое лекарство и ингибитор аутофагии могут быть включены в один носитель, он будет иметь синергетический противораковый эффект в ESCC.

До сих пор основной целью настоящего исследования было введение комбинации 5-FU и LY для лечения ESCC. Для этого 5-FU и LY были стабильно включены в ПЭГилированные нанолипосомы. Ожидалось, что раннее высвобождение ингибитора аутофагии (LY) нарушит защитный механизм раковых клеток, и после этого 5-ФУ будет действовать более сильным образом на раковые клетки. Липосомы, содержащие лекарственное средство, характеризовали с точки зрения размера, формы и характера высвобождения частиц. Анализ клеточного поглощения и жизнеспособности клеток был проведен в раковых клетках ESCC. Кроме того, был проведен анализ апоптоза с помощью окрашивания аннексином V / PI и окрашивания Hoechst 33382. Наконец, было проведено исследование противоопухолевой эффективности на животной модели ксенотрансплантата с клетками ESCC.

Методы

Материалы

5-Фторурацил был приобретен у Sigma-Aldrich, Китай. 2- (4-морфолинил) -8-фенил-4H-1-бензопиран-4-он (LY294002, LY) был приобретен у Beijing Huafeng United Technology Corporation, Китай. L-a-фосфатидилхолин (яйцо / курица) (EPC), дистероилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль (2000) (DSPE-PEG) и холестерин были приобретены у Avanti Polar Lipids, Китай. Все остальные химические вещества были реактивными и использовались для дальнейшей очистки.

Приготовление нанолипосом с двумя лекарственными средствами

EPC, DSPE-PEG и холестерин смешивали в смеси метанол-хлороформ (соотношение М 10:4:1 (всего 10 мг)), и к этой органической смеси добавляли 5-FU (1,5 мг) и LY (1,5 мг). добавлен. Органические растворители упаривали на роторном испарителе (Buchi, США) при 60 ° C в течение 1 ч. Тонкую липидную пленку гидратировали буфером PBS в течение 1 ч, а затем экструдировали через мини-экструдер через поликарбонатную мембрану (200 нм). Нанолипосомы, нагруженные лекарством, фильтровали через трубку Millipore с молекулярной массой 3500. Липосомы, нагруженные лекарством, собирали из верхней камеры, и неуловившееся лекарство определяли методом ВЭЖХ. Загрузка лекарственного средства и инкапсуляция рассчитывались с использованием следующих уравнений:

Анализ размера частиц

Размер частиц и распределение наночастиц по размерам определяли методом динамического рассеяния света (DLS) с использованием Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments, UK). Размер частиц измеряли при 25 ° C после соответствующего разбавления дистиллированной водой. Все измерения были выполнены в трех экземплярах.

Анализ морфологии

Морфология НЧ впервые была изучена с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ; H-7600, Hitachi, Tokyo, Japan) при ускоряющем напряжении 100 кВ. Образцы загружали в медную сетку с углеродным покрытием и сушили. Морфологию NP далее наблюдали с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). Образцы помещали на поверхность слюды.

Исследование выпуска in vitro

Высвобождение 5-FU и LY in vitro из нагруженных 5-FU и LY ПЭГилированных нанолипосом (ЛНП) изучали в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) при 37 ° C. Дисперсию NP (1 мл, содержащую 1 мг каждого лекарства в носителе) помещали в диализную мембрану (MW ~ 3500) и оба конца герметизировали. Диализную мембрану помещали в пробирку с 30 мл высвобождающей среды. Пробирку, содержащую диализную мембрану, помещали в шейкерную баню и давали инкубироваться в течение необходимого момента времени. В определенные моменты времени отбирали 100 мкл образца и заменяли равным количеством свежего буфера. Количество высвобождаемого в буфере лекарственного средства исследовали методом ВЭЖХ. Использовалась система высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Hitachi, Токио, Япония), состоящая из автосамплера L-2200 и детектора L-2420 UV-Vis. Колонку Inertsil C18 (150 мм × 4,6 мм, размер частиц 5 мкм; Cosmosil, Nacalai Tesque Inc., США) использовали при изократическом элюировании подвижной фазы при скорости потока 1,0 мл / мин и температуре колонки 25 ° С. С. Хорошая линейность наблюдалась между 0,025 и 2 мкг / мл для обоих препаратов с коэффициентом корреляции ( r ² ) около 0,9995. LOD (мкг / мл) для 5-FU и LY составляли 0,020 и 0,050 соответственно. ПКО (мкг / мл) для 5-FU и LY составляло 0,070 и 0,150 соответственно.

Культура клеток

Клеточная линия рака пищевода, EC 9706, культивировалась в нормальной среде RPMI с 10% FBS и 100 ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина в 5% CO ₂ и влажность воздуха 95% в увлажнителе.

Анализ сотовой связи

Поглощение NP клетками наблюдали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM). Для этого получали NP, нагруженный родамином B, и очищали гель-фильтрацией с использованием колонки Sephadex G-50 с буфером HEPES. Клетки высевали в 12-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи. Затем клетки обрабатывали NP, нагруженным родамином B (10 мкг / мл), и инкубировали в течение 2 часов. Клетки трижды промывали PBS, фиксировали 2% параформальдегидом (PFA) и снова промывали PBS. Затем клетки окрашивали DAPI в качестве агента для окрашивания ядер. Клетки промывали и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (микроскоп Nikon TE2000-E).

Поглощение клетками дополнительно наблюдали с помощью проточного цитометра. Клетки высевали в 12-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи. Затем клетки обрабатывали NP, нагруженным родамином B, и инкубировали в течение 1 и 2 часов соответственно. Затем клетки экстрагировали и дважды промывали PBS. Клетки ресуспендировали в буфере PBS и анализировали с помощью активируемого флуоресценцией клеточного сортировщика Calibur, оснащенного программным обеспечением CELLQuest (Becton Dickinson Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США).

Анализ цитотоксичности

Цитотоксический потенциал индивидуальных составов оценивали с помощью анализа 3- (4,5-диметил-2-тиазоил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ). Вкратце, 1 × 10 ⁴ клетки высевали в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 24 часов. Затем клетки подвергали воздействию различных концентраций свободного 5-FU, LY, 5-FU + LY и FLNP, соответственно, и дополнительно инкубировали в течение 24 часов. Готовили растворы МТТ (5 мг / мл), в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора МТТ и инкубировали в течение 4 часов. Кристаллы формазана экстрагировали, добавляя ДМСО, и оптическую плотность изучали с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Synergy ™ HTX Multi-Mode Microplate Reader) (при 570 нм).

Анализ апоптоза

Апоптоз раковой клетки определяли по протоколу окрашивания аннексином-V / PI (BD Biosciences, США). Вкратце, ЕС 9706 высевали в 12-луночный планшет и инкубировали в течение 24 часов. Клетки инкубировали со свободными 5-FU, LY, 5-FU + LY и FLNP, соответственно, и дополнительно инкубировали в течение 24 ч (1 мкг эквивалентной концентрации лекарственного средства). Клетки экстрагировали и окрашивали аннексином V-FITC и PI в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем подсчитывали с помощью анализа проточной цитометрии с использованием программного обеспечения FACS CELLQuest (Becton Dickinson Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США).

Анализ Hoechst 33342

Апоптоз раковой клетки дополнительно определяли по протоколу окрашивания Hoechst 33342. Вкратце, ЕС 9706 высевали в 12-луночный планшет и инкубировали в течение 24 часов. Клетки инкубировали со свободными 5-FU, LY, 5-FU + LY и FLNP, соответственно, и дополнительно инкубировали в течение 24 ч (1 мкг эквивалентной концентрации лекарственного средства). Клетки фиксировали 2% PFA и инкубировали с Hoechst 33342 (1 мкг / мл) в течение 15 мин. Затем апоптоз клеток наблюдали под флуоресцентным микроскопом.

Вестерн-блоттинг

Клетки EC 9706 засевали и обрабатывали свободными 5-FU, LY, 5-FU + LY и FLNP, соответственно, и дополнительно инкубировали в течение 24 часов. Затем клетки лизировали и супернатант подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и наносили на поливинилидендифторидную мембрану (Millipore). Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком и затем инкубировали со специфическими первичными антителами в течение ночи при 4 ° C. После инкубации с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, блоты выявляли с использованием системы ECL (AbClon) для обнаружения сигнала. Фильмы были проявлены с использованием процессора Kodak M35-A X-OMAT.

Подавление роста опухоли in vivo

Исследования на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных Народной больницы Субэй провинции Цзянсу, Китай. Самкам бестимусных мышей в возрасте 6 недель прививали 1 × 10 ⁶ Клетки OE-19 на правом боку мышей в 100 мкл среды. Опухолям дали вырасти до 80 мм ³ . (день 10). Животное было разделено на пять групп по шесть мышей в каждой. Мышам вводили соответствующие препараты в фиксированной дозе 5 мг / кг и вводили трижды в течение первых 10 дней эксперимента. Размер опухоли измеряли в единицах объема опухоли с помощью штангенциркуля, а размер оценивали по формуле; Объем =(ширина ² × длина) / 2.

Статистический анализ

Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение. Статистическая значимость определялась с использованием t тест и дисперсионный анализ (ANOVA). P <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Раковые клетки часто устойчивы к отдельным противоопухолевым препаратам и по своей природе неэффективны. В этом отношении комбинация двух или более лекарств будет действовать синергетически, воздействуя на различные клеточные мишени. Сообщалось, что ингибиторы аутофагии преодолевают множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) раковых клеток. В нескольких исследованиях сообщалось, что ингибиторы аутофагии работают лучше всего в сочетании с противораковыми препаратами. В этом исследовании мы выбрали 5-фторурацил (5-FU) в качестве химиотерапевтического агента и LY294002 (LY) в качестве ингибитора аутофагии. Чтобы решить проблемы растворимости и стабильности свободных лекарств, которые, в свою очередь, приводят к короткому периоду полужизни в плазме и нежелательному токсическому эффекту, мы стабильно включили 5-FU и LY в ПЭГилированные нанолипосомы (рис. 1).

Схематическое изображение получения 5-фторурацила и LY-нагруженных ПЭГилированных нанолипосом

Подготовка и характеристика нанолипосом, нагруженных 5-FU и LY

Липосомы с двойным лекарственным средством получали методом тонкопленочной гидратации. Было обнаружено, что средний размер частиц пустой липосомы составляет ~ 110 нм с отличным индексом дисперсности. Размер частиц липосом с двойной загрузкой лекарственного средства (ЛНП) увеличился до ~ 150 нм с хорошим индексом полидисперсности (PDI ~ 150) (рис. 2а). Увеличение размера частиц в основном объясняется включением гидрофобных лекарственных средств в липосомы. Сообщалось, что размер частиц около 200 нм будет увеличивать накопление лекарства в опухолевых тканях благодаря усиленному эффекту проницаемости и удерживания (EPR). Липосомы, содержащие лекарственное средство, проявляли способность к долгосрочному хранению, обусловленную присутствием на их поверхности ПЭГ, который способствовал противообрастающему эффекту. Кроме того, средний поверхностный заряд ЛНФ составляет ~ 25 мВ, что указывает на его коллоидную стабильность. Отрицательный поверхностный заряд позволит избежать каких-либо взаимодействий в системном кровообращении.

Физико-химические характеристики ЛНФ. а Гранулометрический состав ЛНФ методом DLS. б ПЭМ-изображение ЛНФ. c АСМ-снимок ЛНФ

Морфология ЛНФ впервые наблюдалась с помощью ПЭМ (рис. 2б). Как видно, частицы имели типичную сферическую форму и равномерно диспергировались в медной сетке. Легкая сероватая раковина по окружности объяснялась наличием на ее поверхности ПЭГ. Размер частиц, наблюдаемый с помощью ПЭМ, был немного меньше по сравнению с размером частиц с помощью DLS. Размер частиц из ПЭМ составлял ~ 130 нм по сравнению с ~ 150 нм из DLS. Разницу в размере частиц при использовании двух методов можно объяснить состоянием измерения. ТЕМ измеряет частицу в высушенных условиях, в то время как DLS измеряет частицу в гидратированных условиях и удлинение цепи ПЭГ. Морфология частиц была дополнительно подтверждена АСМ (рис. 2с). Частицы были круглыми и представляли собой сплющенный объект на поверхности слюды.

Загрузка лекарств и выпуск лекарств in vitro

ЛНФ показал высокую эффективность улавливания обоих препаратов (92,5% для 5-FU и 86% для LY) с активной загрузкой лекарственного средства около ~ 16% w / w . Характер высвобождения 5-FU и LY из ЛНФ in vitro наблюдали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4). Два компонента из ЛНП высвобождаются контролируемым образом в условиях pH 7,4. Например, ~ 30% 5-FU и ~ 40% LY высвобождаются из липосомы к концу 24 часов. Высвобождение лекарств продолжалось до 90 ч с высвобождением ~ 60% 5-ФУ и ~ 75% LV (рис. 3). Следует отметить, что скорость высвобождения значительно снизилась через 24 часа до 90 часов, что указывает на медленную диффузию лекарств из системы NP. Такое контролируемое высвобождение лекарственного средства было бы полезным для применений, направленных на борьбу с раком. Кроме того, медленное высвобождение лекарства в нейтральных условиях указывает на меньшие побочные эффекты для нормальных тканей. Стоит отметить, что LY выпускается относительно быстрее, чем 5-FU. Это будет благоприятная ситуация, поскольку LY сделает раковые клетки более чувствительными к 5-ФУ, что приведет к усилению цитотоксического эффекта в опухолевых тканях.

Профили высвобождения 5-FU и LY из ЛНФ в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4). Количество высвобожденного лекарственного средства определяли количественно с помощью анализа ВЭЖХ

Исследование интернализации сотовой связи

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) была проведена для определения субклеточного паттерна ЛНП. Родамин B использовали в качестве флуоресцентного зонда для отслеживания внутриклеточного поглощения NP в ESCC. Как видно (фиг. 4), сильный красный сигнал флуоресценции наблюдался в клеточной цитоплазме по окружности ядра, что указывает на типичное опосредованное эндоцитозом поглощение клетками. Опосредованное рецептором клеточное поглощение позволяет постепенно высвобождать лекарство в кислой среде. Наноразмер частицы позволил легко интернализовать систему НЧ. Результаты ясно показали, что лекарство попадает в раковые клетки специфическим путем, а не простой диффузией. Поглощение клетками дополнительно контролировали с помощью FACS. Как видно, заметное поглощение NP наблюдалось после 1 часа инкубации, а поглощение клетками увеличивалось с увеличением времени инкубации (2 часа). Увеличение клеточного поглощения NP увеличит внутриклеточную концентрацию инкапсулированных противоопухолевых препаратов, что еще больше повысит терапевтическую эффективность при ESCC.

а Изображение раковых клеток HT-29 после инкубации с ЛНФ в течение 2 часов с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ). Ядро окрашивали DAPI, и родамин B использовали в качестве флуоресцентного зонда. б Анализ ЛНП на проточном цитометре при инкубации в разные моменты времени

Противораковый эффект in vitro

Цитотоксический эффект отдельных составов изучали с помощью МТТ-анализа (фиг. 5). Как показано, свободные лекарственные средства, а также комбинационные NP проявляли типичный зависимый от концентрации цитотоксический эффект в ESCC. 5-ФУ проявлял относительно более высокий противораковый эффект по сравнению с LY в раковых клетках. Комбинация 5-FU и LY приводила к более высокому цитотоксическому эффекту по сравнению с таковыми отдельных препаратов. Что наиболее важно, ЛНП продемонстрировал значительно более высокий противоопухолевый эффект в отношении раковых клеток по сравнению с действием свободных коктейльных комбинаций. Значение IC50 для 5-FU, LY, 5-FU + LY и FLNP составляло 2,68 мкг / мл, 5,98 мкг / мл, 1,54 мкг / мл и 0,58 мкг / мл соответственно. Это можно объяснить тем фактом, что LY может ингибировать аутофагию в раковых клетках и делать их более чувствительными к 5-ФУ. Следует отметить, что ЛНФ оказался более эффективным, чем комбинации бесплатных коктейлей, за счет более запрограммированного контролируемого высвобождения лекарств. Более быстрое высвобождение LY из ЛНП приводит к ингибированию аутофагии, что повышает чувствительность раковых клеток к 5-ФУ, что приводит к большей гибели клеток [19]. Сообщалось, что 5-ФУ после попадания в раковые клетки превращается в фторуридинтрифосфат (FUTP) через фторуридинмонофосфат (FUMP) или метаболизируется в фтордезоксиуридинтрифосфат (FdUTP) двумя разными путями. FdUTP действует как субстрат для тимидилатсинтазы (TS) и блокирует синтез нуклеотидов. Метаболит 5-FU связывается с сайтом связывания нуклеотидов TS и ингибирует синтез нуклеотидов. Этот цикл приводит к истощению дезокситимидинтрифосфата (dTTP), что предотвращает синтез ДНК и приводит к усилению гибели раковых клеток [20, 21].

Жизнеспособность раковых клеток HT-29 при инкубации со свободным 5-FU, LY, 5-FU + LY и FLNP, соответственно. Жизнеспособность клеток определяли методом МТТ

Очерк апоптоза

Эффект апоптоза композиции оценивали методом окрашивания аннексином-V / PI (фиг. 6a, b). Это позволит определить эффект апоптоза индивидуума, а также комбинированной лекарственной системы. В соответствии с тестом MTT, 5-FU (~ 20%) приводил к большему апоптозу раковых клеток по сравнению с LY (~ 12%), в то время как комбинация 5-FU + LY вызывала большую апоптозную гибель клеток (~ 30%). По сравнению с любой другой группой, ЛНП индуцировал больший апоптоз (~ 48%) раковых клеток, предполагая, что опосредованное рецептором клеточное поглощение значительно увеличивает внутриклеточную концентрацию противоопухолевых препаратов, что приводит к более высокому терапевтическому эффекту. Важная причина более высокого противоопухолевого эффекта ЛНП в основном связана с последовательным высвобождением инкапсулированных лекарств, в которых LY будет сенсибилизировать опухолевые клетки, а 5-FU будет вызывать его сильные цитотоксические эффекты. Противоопухолевые методы лечения работают, вызывая апоптоз в раковых клетках, не повреждая окружающие нормальные клетки. Заметная апоптотическая активность ЛНП в основном объясняется более высоким накоплением наночастиц в клетках за счет поглощения эндоцитоза и последовательным высвобождением лекарств во внутриклеточной среде, что приводит к синергетическому терапевтическому эффекту. Ожидалось, что раннее высвобождение ингибитора аутофагии (LY) нарушит защитный механизм раковых клеток, и после этого 5-ФУ будет действовать более сильным образом на раковые клетки.

Типичные результаты проточно-цитометрического анализа апоптоза раковых клеток HT-29 при инкубации со свободными 5-FU, LY, 5-FU + LY и FLNP, соответственно. Слева внизу живые клетки; внизу справа, ранние апоптотические клетки; вверху справа - клетки позднего апоптоза; и вверху слева, некротические клетки

Вестерн-блоттинг

Механизм действия составов определяется методом вестерн-блоттинга (фиг. 7). Экспрессия уровней проапоптотических и антиапоптозных белков при воздействии соответствующих составов представлена ​​на фиг. 8. p53 является одним из важных регуляторов клеточного цикла, и его подавление связано с увеличением выживаемости раковых клеток. Можно видеть, что составы значительно снижали уровни экспрессии р53, указывая на заметное влияние на клетки ESCC. Сообщалось, что повреждение ДНК приводит к активации каспазного каскада, что приводит к расщеплению PARP-1, что считается признаком апоптоза клеток [22, 23]. Наши результаты ясно показали, что 5-FU и LY индивидуально увеличивали экспрессию каспазы-3 и PARP, в то время как, как и ожидалось, ЛНП индуцировал значительную экспрессию этих белковых маркеров, указывая на превосходный противораковый эффект. Соответственно, ЛНП значительно подавляет экспрессию антиапоптотического белка (Bcl-2), что указывает на его эффективность в улучшении терапевтической эффективности при ESCC.

Вестерн-блоттинг раковых клеток HT-29 при инкубации со свободным 5-FU, LY, 5-FU + LY и FLNP, соответственно. Был определен вестерн-блоттинг расщепленной каспазы-3, PARP, Bcl-2 и p53

Исследование противоопухолевой эффективности in vivo на модели животных. Препараты, не содержащие 5-FU, LY, 5-FU + LY и FLNP, соответственно, вводили опухолевым мышам, и эффективность изучалась в течение 20 дней

Анализ ингибирования роста опухоли in vivo

Мышам вводили соответствующие препараты мышам, и объем опухоли регистрировали до 20 дней. Как видно (фиг. 8), контрольная группа показывала устойчивое увеличение объема опухоли с каждой временной точкой до 18 дня. По сравнению с контролем, свободные лекарства действительно контролировали рост опухоли; однако это не было удовлетворительным. Смесь двух препаратов была относительно более эффективной, чем отдельные препараты в контроле объема опухоли. Важно отметить, что ЛНФ показала значительно ( p <0,05; p <0,0001) более высокая противоопухолевая эффективность по сравнению с любой другой группой. Конечный объем опухоли составил ~ 500 мм ³ . по сравнению с ~ 1400 мм ³ для нелеченных мышей. Значительно более высокий противоопухолевый эффект в модели опухоли объясняется наноразмером частиц, которые могут накапливаться в тканях опухоли из-за усиленного эффекта проникновения и удерживания. Контролируемое высвобождение лекарств в опухолевые ткани также способствовало его более высокой эффективности [24].

Выводы

В заключение, 5-фторурацил (5-FU) и LY294002 (LY)-загруженные ПЭГилированные нанолипосомы были успешно приготовлены для нацеливания на плоскоклеточный рак пищевода (ESCC). ЛНФ показал опосредованное рецептором клеточное поглощение, которое позволяет постепенно высвобождать лекарство в кислой среде. Комбинация 5-FU и LY приводила к более высокому цитотоксическому эффекту по сравнению с таковыми отдельных препаратов. Что наиболее важно, ЛНП продемонстрировал значительно более высокий противоопухолевый эффект в отношении раковых клеток по сравнению с действием свободных коктейльных комбинаций. Более быстрое высвобождение LY из ЛНП приводит к ингибированию аутофагии, что повышает чувствительность раковых клеток к 5-ФУ, что приводит к большей гибели клеток. Соответственно, ЛНП индуцировал больший апоптоз (~ 48%) раковых клеток по сравнению с апоптозом любых других групп. Вестерн-блот-анализ ясно показал, что 5-FU и LY индивидуально увеличивали экспрессию каспазы-3 и PARP, в то время как, как и ожидалось, ЛНП индуцировал значительную экспрессию этих белковых маркеров, указывая на превосходный противораковый эффект. Мы полагаем, что запрограммированное высвобождение ингибитора аутофагии и химиотерапевтического препарата из одного наноносителя увеличит перспективы противоопухолевой терапии при ESCC. Более широкое исследование различных плоскоклеточных карцином и разработка ортотропной модели и модели ксенотрансплантата (PDX), полученной от пациента, станут предметом будущих исследований.

Сокращения

5-FU:

5-фторурацил

EPR:

Улучшенный эффект проницаемости и удерживания

ESCC:

Плоскоклеточный рак пищевода

ЛНФ:

Липидные наночастицы, нагруженные 5-ФУ и LY