Токсические эффекты, вызванные наночастицами диоксида циркония, в клетках 3T3-E1, подобных остеобластам

Введение

За последние несколько десятилетий применение созданных наночастиц (НЧ) расширилось в различных областях, таких как электроника, биомедицинские приложения и фармацевтика. Диоксид циркония (ZrO ₂ ) НЧ - один из основных наноматериалов, используемых для синтеза огнеупоров, формовочных песков и керамики. Из-за предпочтительной механической прочности этот материал также используется в биомедицине, включая биосенсоры, терапию рака, имплантаты, эндопротезы суставов и стоматологию [1, 2]. Однако широкое применение частиц вызвало озабоченность по поводу их потенциальных рисков для здоровья и окружающей среды, из которых обеспечение безопасности труда и потребителей является важной проблемой. Пока что токсикологические исследования ZrO ₂ Количество НП ограничено, и результаты были неоднозначными.

В некоторых исследованиях сообщается, что ZrO ₂ НЧ показали лучшую биосовместимость по сравнению с другими наноматериалами, включая оксид железа, диоксид титана (TiO ₂ ) и оксид цинка (ZnO) [3,4,5,6]. В соответствии с этими результатами, другие сообщили о ZrO ₂ NP может вызывать легкие [3, 7] или не вызывать цитотоксические эффекты [8, 9, 10], и только несколько исследований показали умеренный цитотоксический потенциал. Однако Stoccoro et al. [11] разработали токсические эффекты ZrO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ с покрытием или без него, они обнаружили, что все виды НЧ в разной степени проявляют токсическое действие. Более того, морфология клеток изменяется, и в другом исследовании после ZrO ₂ наблюдались трещины на поверхности клеток. Лечение НП в концентрациях до 1 мг / мл в эритроцитах [12]. Следовательно, в этом исследовании мы оценили цитотоксические эффекты ZrO ₂ НЧ, что дает полезную информацию для их будущего применения in vivo. Тем временем мы обработали клетки TiO ₂ . НП в качестве контрольной группы, токсикологический профиль которых хорошо разработан [13].

Предыдущие исследования показали, что НЧ широко используются в качестве материалов для тканевой инженерии и обладают способностью улучшать остеогенную дифференцировку остеобластов [14,15,16,17]. Одно сообщение показало, что наночастицы кремния (Si) могут обратить вспять возрастную потерю костной массы у мышей, вероятно, из-за образования кости, индуцированного Si NP [16]. Лю и др. [14] обнаружили, что сплав нержавеющей стали, покрытый НЧ серебра (Ag) / поли (DL-молочная и гликолевая кислота), обладает сильной антибактериальной способностью и может способствовать пролиферации и созреванию остеобластов клеток MC3T3-E1 in vitro. Кроме того, сообщалось, что углеродные нанотрубки вызывают кальцификацию костей, что, скорее всего, является результатом их наноразмерных структур, аналогичных размеру внутриклеточных органелл [18].

ZrO ₂ НЧ применялись в качестве основного компонента биокерамических имплантатов благодаря своей биосовместимости и устойчивости к биокоррозии [19]. Хотя большинство исследований сосредоточено на полезных свойствах ZrO ₂ НЧ нельзя игнорировать неблагоприятные биологические эффекты. Поэтому в этом исследовании мы использовали TiO ₂ , в качестве контрольной группы, который представляет собой традиционный наноматериал, показавший аналогичные физико-химические свойства. Мы стремились изучить эффекты TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ влияют на жизнеспособность клеток, окислительный стресс, морфологию клеток и остеогенные ответы остеобластов MC3T3-E1 после совместного культивирования и, таким образом, для выявления остеоиндуктивности TiO ₂ и ZrO ₂ Лечение НП.

Материалы и методы

Подготовка материалов и их характеристика

TiO ₂ НП (номер CAS 637262) и ZrO ₂ НЧ (номер CAS 544760) были приобретены у Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и охарактеризованы с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ, MFP-3D-S, Asylum Research, Санта-Барбара, Калифорния, США). , Дзета-потенциал и измерения размеров частиц методом динамического рассеяния света (DLS) (Zetasizer Nano ZS, Малверн, Великобритания). НЧ диспергировали в спирте для обнаружения ПЭМ, что могло бы более четко показать морфологию и размер частиц НЧ. Кроме того, агрегированный размер частиц определяли с помощью DLS, где использовали полную культуральную среду, чтобы привести в соответствие с характеристиками частиц, применяемыми в культуре клеток. Перед обработкой клеток исходный раствор диспергировали с помощью ультразвуковой системы разрушения клеток (Ningbo Xinzhi Biotechnology, Китай) в течение 30 минут при охлаждении льдом и разбавляли до различных концентраций полной культуральной средой перед экспериментами с клетками.

Культура клеток 3T3-E1

Клеточная линия 3T3-E1 (Банк клеток Шанхайской инфраструктуры общественных исследований и разработок Китайской академии медицинских наук, Шанхай, Китай) культивировалась в минимально необходимой среде-альфа (α-MEM, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). , США), содержащий 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Thermo Fisher Scientific, США) и 1% антибиотика / антимикотика (Thermo Fisher Scientific, США). Клетки инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ . в 95% увлажненной атмосфере, а питательную среду заменяли через день.

Анализ пролиферации клеток

Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, город Кумамото, Япония). Клетки высевали в 96-луночные планшеты по 5000 клеток на лунку. TiO ₂ НЧ и ZrO ₂ Затем в 96-луночные планшеты добавляли НЧ при серийных концентрациях 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 и 150 мкг / мл с последующей инкубацией в течение 24 и 48 часов при 37 ° C с 5% CO <. sub> 2 , сопровождаемый N -ацетил-1-цистеин (NAC) или нет, которые использовались для ингибирования продукции ROS. Контрольную группу оставили без лечения. Затем был проведен тест CCK-8, добавив 110 мкл детектирующих реагентов в каждую лунку, и 96-луночные планшеты были затем инкубированы в течение дополнительных 2 часов при 37 ° C. Чтобы предотвратить вмешательство НЧ в этот аналитический анализ, реагенты для тестирования в 96-луночных планшетах были перенесены в новый 96-луночный планшет через 2 часа реакции; депонированные НЧ и клетки оставались в первичной пластине. Оптическую плотность (OD) каждой лунки измеряли на одной длине волны 450 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов (SpectraMax M5, Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США). Каждое лечение проводилось в шести повторностях.

Анализ апоптоза аннексина V с помощью проточной цитометрии

Клетки культивировали в 12-луночном планшете при плотности 30 000 клеток / лунку для слияния. После TiO ₂ НП и ZrO ₂ Обработка NP в течение 48 ч, клетки промывали PBS и собирали, используя буфер без трипсина EDTA. Клетки ресуспендировали в буфере PBS при концентрации 25000 клеток / мл и центрифугировали при 1000 × g . Затем клетки окрашивали FITC Annexin V и PI (Invitrogen ™, США) при комнатной температуре без воздействия света. Наконец, клетки были смешаны с 400 мкл буфера для связывания и немедленно проанализированы с помощью проточной цитометрии (BD FACSAria III, BD, Franklin Lakes, NJ, США).

Анализ генерации ROS

Формирование внутриклеточных АФК определяли с использованием набора для анализа активных форм кислорода (Beyotime, Шанхай, Китай). Вкратце, после промывки PBS клетки высевали в 6-луночный планшет из расчета 20000 клеток / лунку в 2 мл культуральной среды и обрабатывали TiO ₂ НЧ и ZrO ₂ НЧ в концентрации 0, 10, 50 и 100 мкг / мл в течение 48 ч, в сопровождении NAC или без него. После обработки TiO ₂ НЧ и ZrO ₂ НЧ, клетки собирали и инкубировали с 10 мкМ DCFH-DA в течение 30 мин при 37 ° C и 5% CO ₂ . . Интенсивность флуоресценции анализировали на BD FACSAria III (BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США).

Конфокальная микроскопия

Из-за того, что большая часть клеток перешла в состояние апоптоза, в нашем исследовании мы выбрали 24 часа в качестве момента времени для наблюдения за изменениями структуры цитоскелета клеток. Клетки 3T3-E1 высевали на покровные стекла и культивировали в присутствии TiO ₂ НЧ и ZrO ₂ НП на 24 ч. Клетки промывали сразу после обработки буфером PBS три раза и фиксировали 4% параформальдегидом, пропитывали 0,1% Triton X-100 и блокировали PBS, содержащим 5% BSA. Затем клетки инкубировали с α-тубулином (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США, 1:4000) при 4 ° C в течение ночи и загружали вторичным антителом, связанным с FITC, при 37 ° C в течение 1 часа на следующий день после промывание PBS трижды. Следовательно, цитоскелет окрашивали родамин-фаллоидином (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, 1:1000) в течение 1 ч в темноте, а ядра окрашивали Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в течение 20 мин. Покровные стекла исследовали с помощью конфокального микроскопа FV10i (Olympus, Токио, Япония).

Обнаружение индукции минерализации

Клетки 3T3-E1 высевали в 6-луночный планшет при плотности 15000 клеток / лунку. Клетки обрабатывали TiO ₂ . НЧ и ZrO ₂ НЧ в концентрациях 10 и 100 мкг / мл и культуральную среду, содержащую наноматериалы, заменяли через день; клетки осторожно промывали PBS для удаления остаточных наноматериалов перед каждой заменой культуральной среды. После культивирования в течение 7, 14 и 21 дней в присутствии TiO ₂ НЧ и ZrO ₂ НЧ, клетки окрашивали ализариновым красным S. Вкратце, клетки фиксировали 4% параформальдегидом при 4 ° C в течение 30 минут и окрашивали раствором S ализаринового красного (40 мМ, pH 4,1) при температуре окружающей среды еще в течение 20 минут. После трехкратной промывки дистиллированной водой минерализованные узелки наблюдались с помощью светового микроскопа (Olympus, Япония).

Извлечение РНК и ОТ-ПЦР

Тотальную РНК экстрагировали с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Затем концентрацию РНК оценивали с помощью ультрафиолетового спектрофотометра. Выделенную РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора реагентов RT (TaKaRa Bio, Далянь, Китай). ПЦР в реальном времени проводили с использованием реактива SYBR green (TaKaRa Bio, Далянь, Китай). Были обнаружены гены, связанные с остеогенезом, в том числе связанный с runt фактор транскрипции 2 (RUNX2), коллаген 1α1 (Col1α1), щелочная фосфатаза (ALP), остеопонтин (OPN), остеокальцин (OC) и костный сиалопротеин (BSP). Данные были проанализированы с использованием 2 ^−ΔΔ КТ метод. Используемые праймеры перечислены в таблице 1.

Статистический анализ

Результаты были представлены как средние значения ± SEM. Все данные были статистически проанализированы с помощью теста ANOVA. Был проведен тест на однородность дисперсии, и тесты Бонферрони и Даннета T3 использовались, когда предполагалась равная дисперсия и когда не было однородности, соответственно. p значение менее 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Характеристика TiO ₂ и ZrO ₂ НП

Сначала мы охарактеризовали TiO ₂ НП и ZrO ₂ Порошки НЧ методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и динамического рассеяния света (ДРС) (рис. 1а, б, таблица 2). Изображения ПЭМ и СЭМ показали форму и размер частиц. TiO ₂ НЧ представляли собой небольшие стержневидные сферы со средним размером 25,4 ± 2,8 нм. ZrO ₂ НЧ представляли собой небольшие стержневидные сферы со средним размером 31,9 ± 1,9 нм. Для измерения размера TiO ₂ НЧ и ZrO ₂ НЧ в растворе использовали DLS и частицы TiO ₂ НЧ и ZrO ₂ НЧ увеличились до 81,2 нм и 93,1 нм соответственно, что указывает на эффект агломерации. Дзета-потенциалы TiO ₂ НЧ и ZrO ₂ НЧ составили 32,9 ± 5,4 мВ и 42,4 ± 7,4 мВ соответственно.

Характеристики TiO ₂ и ZrO ₂ НП. TiO ₂ ( а ) и ZrO ₂ ( б ) Морфология и размер NP определялись с помощью ПЭМ. ( c Ситуация совместного культивирования клеток 3T3 и наноматериалов наблюдалась после TiO ₂ и ZrO ₂ Концентрации обработки NP 10, 50 и 100 мкг / мл. ( д ) Результаты ПЭМ были получены после TiO ₂ и ZrO ₂ Обработка НП в течение 1 ч

Затем мы наблюдали фотографию клеток 3T3 после TiO ₂ НП и ZrO ₂ Воздействие НП в различных концентрациях. Мы обнаружили, что НЧ равномерно распределяются по клеткам или вокруг них. НЧ проявляли сильную способность к агрегации при высоких концентрациях из-за небольшой доли НЧ с наблюдаемым микромасштабом, в то время как большая масса НЧ была небольшой с наноразмером и, вероятно, перемещалась в клетки, которые было трудно увидеть (рис. 1c). Кроме того, результаты ПЭМ ячеек после TiO ₂ и ZrO ₂ Получено лечение НП в течение 1 ч; Наши данные показали, что НЧ могут транслоцироваться в клеточные везикулы. Между тем, также наблюдаются некоторые повреждения органелл, например набухание митохондрий и образование вакуолей.

TiO ₂ и ZrO ₂ Токсические эффекты, вызванные NP в клетке 3T3-E1

Мы оценивали жизнеспособность клеток после TiO ₂ НП и ZrO ₂ Обработка НП в серийных концентрациях (10, 20, 40, 60, 80, 100, 150 мкг / мл). Для TiO ₂ НЧ (рис. 2а), через 24 ч инкубации мы обнаружили, что TiO ₂ НЧ были нетоксичны при более низких дозах (≤ 20 мкг / мл), тогда как очевидное снижение жизнеспособности клеток наблюдалось при более высоких концентрациях (> 20 мкг / мл) ( p <0,001). Более резкое снижение жизнеспособности клеток в группе лечения 20 мкг / мл наблюдалось через 48 ч инкубации; TiO ₂ НЧ в концентрации 20 мкг / мл индуцировали снижение жизнеспособности клеток ( p <0,01). Кроме того, более высокие дозы TiO ₂ НЧ (> 20 мкг / мл) показали значительное снижение жизнеспособности клеток через 48 ч ( p <0,001). Однако жизнеспособность клеток оставалась стабильной при обработке 10 мкг / мл TiO ₂ НП на 48 ч. Кроме того, для ZrO ₂ НЧ (рис. 2б), аналогичные результаты наблюдались при сравнении с TiO ₂ НП; более высокие токсические эффекты наблюдались при концентрации 150 мкг / мл в течение 48 ч, когда жизнеспособность клеток снижалась ниже 50%. Эти результаты показали, что TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ были биосовместимы при более низких дозах. Однако эти два наноматериала проявляли небольшую цитотоксичность при высоких токсичных концентрациях.

TiO ₂ и ZrO ₂ NP-индуцированное снижение жизнеспособности клеток 3T3-E1. Клетки 3T3-E1 обрабатывали TiO ₂ ( а ) и ZrO ₂ ( б ) НЧ в концентрациях 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 и 150 мкг / мл в течение 24 и 48 часов, а затем жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа CCK-8. Между тем, изменения жизнеспособности клеток были обнаружены после обработки NAC, которая могла устранить внутриклеточные ROS. Результаты представляют собой средние значения ± SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 по сравнению с контролем

Влияние ингибирования NAC на TiO ₂ и ZrO ₂ Цитотоксичность, индуцированная НЧ

Затем мы обнаружили ингибирующие эффекты NAC, который является агентом, улавливающим ROS. Результаты показали, что NAC потенциально ингибирует TiO ₂ (Рис. 2а), а ZrO ₂ НЧ (рис. 2б) индуцировали жизнеспособность клеток через 24 и 48 часов обработки. После ингибирования NAC жизнеспособность клеток поддерживалась в течение 24 часов при всех концентрациях TiO ₂ и ZrO ₂ Обработка НП, за исключением максимальной концентрации (150 мкг / мл). Хотя эффект ингибирования был немного снижен в клетках, обработанных высокими концентрациями TiO ₂ (100 и 150 мкг / мл) и ZrO ₂ НЧ (80, 100 и 150 мкг / мл) через 48 часов, никаких серьезных изменений жизнеспособности клеток не наблюдалось для концентраций ниже 80 мкг / мл, где жизнеспособность клеток была значительно выше, чем у клеток без NAC.

TiO ₂ и ZrO ₂ Генерация АФК, индуцированная NPs, в клетке 3T3-E1

Мы также обнаружили генерацию ROS после TiO ₂ и ZrO ₂ Экспозиция НЧ в клетках 3T3-E1 (рис. 3). Наши результаты показали, что TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ индуцировали генерацию АФК через 24 ч, что было наиболее значимым при концентрации 100 мкг / мл. Для TiO ₂ не было значительного образования ROS. НЧ в концентрации 10 мкг / мл, а ZrO ₂ НЧ при той же концентрации индуцировали мощную генерацию АФК. Между тем, NAC может значительно ингибировать TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ-индуцированная генерация АФК в клетках 3T3-E1 при всех концентрациях.

TiO ₂ и ZrO ₂ NP-индуцированная генерация АФК в клетках 3T3-E1. Клетки 3T3-E1 обрабатывали TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ в различных концентрациях в течение 48 ч и NAC (10 мМ) инкубировали одновременно, а затем определяли уровни ROS в клетках 3T3-E1. Результаты представляют собой средние значения ± SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 по сравнению с контролем

TiO ₂ и ZrO ₂ Апоптоз и некроз, индуцированный НЧ в клетке 3T3-E1

Апоптоз и некроз клеток были обнаружены после различных концентраций TiO ₂ и ZrO ₂ Воздействие НЧ через 48 ч (рис. 4). Красные точки, расположенные в третьем квадранте, представляли нормальные клетки, а красные точки, расположенные в первом квадранте и четвертом квадранте, представляли ранние апоптотические клетки и поздние апоптотические или некротические клетки, соответственно. Интересно, что наши результаты показали, что TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ могут вызывать апоптоз в зависимости от концентрации и времени. После TiO ₂ Воздействие НЧ в течение 48 ч, при концентрациях 10 мкг / мл значительного апоптоза клеток не обнаружено; однако при концентрациях 50 и 100 мкг / мл процент поздних апоптозных или некротических клеток достигал высокого уровня. После ZrO ₂ Воздействие НЧ в течение 48 часов, мы не обнаружили апоптоза клеток и при концентрации 10 мкг / мл, но процент поздних апоптозных или некротических клеток составил 43,7% в группе 50 мкг / мл. Что наиболее интересно, значительный ранний апоптоз наблюдался (34,1%) при концентрации 100 мкг / мл после 48 ч лечения. Мы обнаружили, что ранние уровни апоптоза TiO ₂ НЧ были значительно выше, чем ZrO ₂ НП; однако уровни позднего апоптоза или некроза были в стихах.

TiO ₂ и ZrO ₂ NP-индуцированный апоптоз в клетках 3T3-E1. а После обработки клеток 3T3-E1 TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ в различных концентрациях в течение 48 ч, уровни апоптоза клеток не определялись. б Были рассчитаны уровни апоптоза, включая уровни раннего апоптоза и позднего апоптоза, а затем данные провели статистику. Результаты представляют собой средние значения ± SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 по сравнению с контролем

TiO ₂ и ZrO ₂ NP-индуцированные морфологические изменения в клетках 3T3-E1

Изучить морфологические изменения клеток 3T3-E1 после воздействия TiO ₂ . и ZrO ₂ НЧ проводили флуоресцентное окрашивание с последующей конфокальной микроскопией (рис. 5 и 6). По сравнению с необработанными контрольными клетками не было морфологических изменений после 10 мкг / мл TiO ₂ и ZrO ₂ Обработка NP через 24 часа, в то время как клетки стали круглыми и меньше после 100 мкг / мл TiO ₂ и ZrO ₂ Лечение НП. Что наиболее интересно, небольшое уменьшение площади клеток наблюдалось после 50 мкг / мл TiO ₂ и ZrO ₂ Обработка НП, где TiO ₂ показали более сильное уменьшение площади клеток. Соответственно, количественные результаты подтвердили значительное уменьшение площади клеток после приема 100 мкг / мл TiO ₂ и ZrO ₂ Обработка НП (рис. 5).

TiO ₂ и ZrO ₂ NP-индуцированные изменения площади клеток в клетках 3T3-E1. После обработки клеток 3T3-E1 TiO ₂ ( а ) и ZrO ₂ ( б ) НЧ в концентрациях 10 и 100 мкг / мл в течение 24 ч, клетки были загружены тубулином (зеленый), актином (красный) и Hoechst 33342 (синий). Морфологию клеток наблюдали на основе изменений систем актина (красный) и тубулина (зеленый), а также рассчитывали изменения распределения клеток по площади

TiO ₂ и ZrO ₂ NP-индуцированные изменения цитоскелета в клетках 3T3. После обработки клеток 3T3-E1 TiO ₂ ( а ) и ZrO ₂ ( б ) НЧ в концентрациях 10 и 100 мкг / мл в течение 24 ч, изменения цитоскелета оценивались на основе изменений актиновой (красный) и тубулиновой систем (зеленый)

Мы далее изучили изменения цитоскелета как в актиновых филаментах, так и на уровнях микротрубочек (рис. 6). Точно так же не было показано значительных различий между контрольной группой и 10 мкг / мл TiO ₂ . и ZrO ₂ Обработка NP и клетки в обеих группах выявили явные структуры актиновых филаментов и системы микротрубочек. Напротив, 100 мкг / мл ZrO ₂ Обработка NP вызвала сокращение клеток 3T3-E1 вместе с пикнозоподобными ядрами и конденсированными нечеткими актиновыми филаментами и структурами микротрубочек. Для TiO ₂ НЧ, наблюдалось так много актиновых точек, а актиновые филаменты, расположенные на клеточной мембране, были туманными и шероховатыми. Для ZrO ₂ НЧ, было обнаружено более сильное разрушение цитоскелета, а структура актина и микротрубочек была шероховатой и дефектной.

TiO ₂ и ZrO ₂ Минерализация, индуцированная NP в клетках 3T3

Затем мы определили статус минерализации клеток 3T3 с помощью окрашивания ализарином красным и наблюдали образование минерализованных узелков под световой микроскопией (рис. 7). Клетки окрашивали после остеогенной индукции в течение 7, 14 и 21 дней в присутствии различных концентраций TiO ₂ и ZrO ₂ НП. Мы обнаружили, что минерализованные узелки стали видимыми после 14 и 21 дня индукции. Не было значительной разницы в минерализации после 14 и 21 дня индукции между контрольной группой и TiO ₂ и ZrO ₂ Обработка НП при 10 мкг / мл. Однако уменьшение минерализации, вероятно, наблюдалось после TiO ₂ и ZrO ₂ Обработка НП в дозе 100 мкг / мл из-за того, что минерализованный узелок стал меньше и расплывчатым.

TiO ₂ и ZrO ₂ NP-индуцированные эффекты минерализации в клетках 3T3. После того, как клетки 3T3-E1 были дифференцированы с использованием минерализованного раствора в течение 7 дней, 14 дней и 21 день в сочетании с TiO ₂ ( а ) и ZrO ₂ НП ( b ) в различных концентрациях. Окрашивание ализарином красным использовалось для обнаружения минерализованных узелков (черная стрелка)

TiO ₂ и ZrO ₂ NP-индуцированная экспрессия генов, связанных с остеогенезом, в клетках 3T3

Чтобы исследовать механизм TiO ₂ и ZrO ₂ NP-индуцированный остеогенез в клетках 3T3, мы обнаружили уровни генов, связанных с остеогенезом, в клетках 3T3 после TiO ₂ и ZrO ₂ Лечение NP, включая гены, которые преимущественно активируются в начале ( Runx2 , Col1α1 , и Альп ) и поздно ( Опн , ОК и Bsp ) фазы остеогенеза (рис. 8). Мы обнаружили, что 10 мкг / мл TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ индуцировали самый высокий уровень экспрессии Runx2 через 3 дня лечения, а на 7 день Runx снизился до самого низкого уровня после ZrO ₂ Обработка НП при 100 мкг / мл. Col1α1 увеличивается после 10 мкг / мл TiO ₂ и ZrO ₂ Обработка NP как на 3-й, так и на 7-й дни, в то время как для клеток, обработанных 100 мкг / мл TiO ₂ и ZrO ₂ НП, Col1α1 сначала значительно усилилась на 3-й день, но резко снизилась через 7 дней. Мы также обнаружили значительное уменьшение Alp выражение после TiO ₂ и ZrO ₂ Лечение НП в дозе 100 мкг / мл в течение 3 дней.

TiO ₂ и ZrO ₂ NP-индуцированные изменения генов, связанных с остеогенезом, в клетках 3T3. После того, как клетки 3T3-E1 были дифференцированы с использованием минерализованного раствора в течение 3, 7, 14 и 21 дня в сопровождении TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ в различных концентрациях. Связанные с остеогенезом изменения генов выявляли с помощью ОТ-ПЦР. Результаты представляют собой средние значения ± SEM трех независимых экспериментов. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 по сравнению с контролем

Для генов, активированных в поздней фазе остеогенной индукции, уровни экспрессии Opn , ОК и Bsp значительно увеличился после 10 мкг / мл TiO ₂ и ZrO ₂ Лечение НП в течение 14 дней и Опн постоянно повышается до более высокого уровня на 21 день. Эти результаты свидетельствуют о том, что по сравнению с Ocn и Bsp , Опн был маркером более поздней стадии TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ-индуцированный остеогенез. Интересно, что 100 мкг / мл TiO ₂ и ZrO ₂ NP не смогли усилить выражение Opn , ОК , или Bsp на 14 день; более того, на 21-й день активность этих генов значительно снизилась.

Обсуждение

ZrO ₂ НЧ были важными компонентами огнеупоров, керамики и биомедицинских устройств, включая имплантаты, эндопротезы суставов и стоматологические материалы. До сих пор TiO ₂ НЧ, как одна из других НЧ со схожими физико-химическими свойствами, многие исследования были сосредоточены на ее токсикологических данных. Они обнаружили, что TiO ₂ НЧ могли перемещаться в клетки и демонстрировали потенциальное повреждение клеток из-за различных физико-химических характеристик [20, 21]. Между тем токсикологические данные для НЧ ZrO2 отсутствовали. В нашем исследовании мы рассматривали TiO ₂ НП в качестве контрольной группы и исследовали токсикологические эффекты TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ на клетках 3Т3-Е1. Известно, что физико-химические свойства НЧ, особенно размер и морфология, эффективно влияют на биобезопасность. Некоторые исследования показали, что наноразмерные частицы были значительно более токсичными, чем микрочастицы [22, 23]. В большинстве случаев морфология частиц также влияет на токсичность [24,25,26]. В нашем исследовании мы показали, что TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ представляли собой стержневидные сферы. По сравнению с предыдущими отчетами [5, 27, 28], наш TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ имели относительно более слабый эффект агломерации в воде, где размер частиц увеличивался до 81,2 и 93,1 нм, в то время как мы также могли наблюдать некоторые микромасштабные материалы в культуральной среде после воздействия НЧ в зависимости от концентрации, что подтверждает эффект агломерации в этом исследовании даже после использования технологии ультразвукового диспергирования. Однако эффект агломерации не мог ингибировать транслокацию NP в цитоплазму, поскольку мощные NP были обнаружены во внутриклеточных везикулах. Органеллы, как и митохондрии, вероятно, были одной из основных целей.

Мы обнаружили жизнеспособность клеток 3T3-E1 при различных концентрациях TiO ₂ и ZrO ₂ Лечение НП. Наши результаты показали, что 10 мкг / мл TiO ₂ и ZrO ₂ НЧ - это концентрация биобезопасности для клеток 3T3-E1. Жизнеспособность клеток снижалась в зависимости от времени и концентрации, что означает, что TiO ₂ и ZrO ₂ NPs were potentially cytotoxic after longer exposure of higher doses compared with other oxide metal nanoparticles, such as silicon dioxide and ZnO [4, 28, 29]. Moreover, ZrO₂ NPs showed more potent toxic effects than TiO₂ NPs in our study at high toxic concentrations.

Oxidative stress, a byproduct of outpaced ROS generation and decreased antioxidant factors, is known as one crucial factor in nanomaterial-induced cytotoxicity, and it is reported to trigger cell apoptosis through distinct mechanism [30, 31]. Furthermore, Kozelskaya et al. [12] observed that ZrO₂ NPs induced the increase of membrane microviscosity, cell morphology changes, and surface cracks on the red blood cells due to the oxidative stress. In agreement with these studies, we detected the ROS levels in 3T3-E1 cells after TiO₂ and ZrO₂ NP treatment and found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce significant ROS generation in concentration-dependent manners, and ZrO₂ NPs induced more potent oxidative stress effects. Moreover, the elevated ROS levels could be eliminated by NAC which is a ROS scavenger. These results suggested the important role of ROS in TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cell cytotoxicity.

Apoptosis is a type of cell death which clears the senescent and abnormal cells, so as to sustain the cell biological functions [32]. Some studies have reported that apoptosis was one of the main toxic responses after treating with oxide metal nanomaterials, such as TiO₂ , ZnO, Si, and Ag [33,34,35,36]. In our study, we found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce apoptotic/necrotic body formation in 3T3-E1 cells in time/concentration-dependent manners, which was correlated with the decreased cell viability shown previously. Moreover, we found that when large parts of late apoptotic or necrotic cells were observed after ZrO₂ NP treatment, the cell status for TiO₂ NPs largely was early apoptosis. These phenomena applied that ZrO₂ NPs induced more rapid and potent apoptosis effects. Similarly, other studies also showed that ZrO₂ NPs induced significant apoptotic and necrotic processes in MSTO cells [4, 11].

The cytoskeleton metabolism is a dynamic biological process involving polymerization and depolymerization, which could sustain cell morphology and promote cell function. Some studies have shown that nanomaterials could affect the cell morphology and cytoskeleton system [37,38,39]. We found 3T3-E1 cells became smaller and rounded in the high-dose group of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL), along with decreased cell area due to cytoskeleton disruptions. These findings were also supported by previous reports that ZrO₂ NP treatment could induce cell morphology changes in MSTO cells at higher concentration [4]. Another study showed the disrupted blood cell morphology after ZrO₂ NP treatment [12].

Alizarin red staining is a key indicator of osteogenic responses. In our study, no impact on osteogenic induction has been shown by TiO₂ and ZrO₂ NP treatment (10 μg/mL), except that cells treated with a cytotoxic dose of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL) had a significant decrease of mineralized nodules due to the potential inhibition of osteoinductive properties. In addition, the expression level of osteogenesis-related genes was important biomarkers. Our results showed that lower concentration (10 μg/mL) of TiO₂ and ZrO₂ NPs promoted the expression of osteogenesis-related genes; however, TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations (100 μg/mL) could significantly inhibit gene expression for both early- and late phases of mineralization, indicating that TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations indeed inhibited osteoinductive properties. Other studies also obtained similar results; they claimed that TiO₂ NPs inhibited the osteogenesis of osteoblasts in a size-dependent manner while potentially promoted osteoclastogenic process [33]. Sengstock et al. [40] found that sub-toxic concentrations of Ag NPs and Ag ions could significantly impair the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. More ongoing or newly initiated researches are focused on developing nanoparticles with acceptable biosafety and osteogenic potential to promote osseointegration for in vivo application [18, 41].

Conclusion

In conclusion, our data indicated that ZrO₂ NPs were nanoparticles with good biocompatibility, just like TiO₂ NPs, while they could induce toxic effects at high toxic concentrations on 3T3-E1 cells. ROS played a key role on TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cytotoxicity, including cell viability, apoptosis and necrosis, and changes in cell morphology. Moreover, TiO₂ and ZrO2 NPs at high concentrations showed inhibitory effects on osteogenic differentiation of 3T3-E1 cells. Our findings could provide deep insights into the biocompatibility and potential application of ZrO2 NPs.

Сокращения

Ag:

Silver

ALP:

Щелочная фосфатаза

Col1α1:

Collagen 1α1

DLS:

Динамическое рассеяние света

FBS:

Fetal bovine serum

NAC:

N -acetyl-l-cysteine

НП:

Наночастицы

OC:

Osteocalcin

OD:

Optical density

OPN:

Osteopontin

PBS:

Phosphate-buffered saline solution

ROS:

Активные формы кислорода

RUNX2:

Runt-related transcription factor 2

Si:

Silica

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

TiO ₂ :

Диоксид титана

ZrO₂ :

Zirconia

α-MEM:

Minimum essential medium-alpha