Свойства получения и антибиотикопленки композитных пленок из оксида цинка / пористого анодного оксида алюминия

Фон

Как мы знаем, бактерии могут прилипать к твердым поверхностям и образовывать скользкую биопленку в соответствующих условиях [1]. Обычно биопленки бактерий прочно прилипают к поверхностям таких материалов, как нержавеющая сталь [2], резина [3], стекло [4] и полистирол [5]. Биопленка может привести к коррозии оборудования [6] и загрязнению пищевых продуктов [7], что приведет к огромным экономическим потерям. Многие исследования показали, что на адгезию биопленок влияют свойства поверхности материала, такие как шероховатость [8,9,10,11], микроструктура [12, 13], гидрофильность [14,15,16,17] и компоненты антибиотиков. [18,19,20]. Bohinc et al. [10] указали, что прилипание бактерий будет увеличиваться с увеличением шероховатости поверхности стекла. Singh et al. [12] продемонстрировали, что высокая шероховатость поверхности может улучшить адсорбцию белка и ускорить адгезию бактерий и образование биопленок. Bonsaglia et al. обнаружили, что Listeria monocytogenes адгезия к гидрофильным поверхностям (например, нержавеющей стали и стеклу) лучше, чем к гидрофобным (например, полистиролу) [14]. Другие исследования также доказали, что гидрофобная поверхность не способствует адгезии биопленок [16, 17]. Некоторые исследования показали, что компоненты антибиотиков могут ингибировать образование биопленок [18,19,20]. Триста четыре поверхности из нержавеющей стали, содержащие медь, обладают отличными антибактериальными и антибиотическими свойствами, благодаря антимикробной активности элемента Cu [18]. Короче говоря, свойства поверхности имеют решающее значение для антибиотикопленки материалов.

Алюминиевые материалы получили широкое распространение, и в последние годы пористый анодный оксид алюминия (PAA) привлек больше внимания в области электрической функции света, каталитической функции и сенсорной функции [21,22,23,24], и его антимикробная активность была значительно увеличена. сообщил. Ferraz et al. [24] сообщили, что PAA может вызывать активацию прикрепления моноцитов / макрофагов из-за их матричной фазы и нанопористости.

Кроме того, тонкие пленки оксида цинка (ZnO) были изучены как отличный материал для антибактериальных и противогрибковых средств. Приверженность синегнойной палочки для пленок ZnO с наностержневой структурой поверхности было слабее, чем у стекла и напыляемого ZnO, и более P. aeruginosa убиты в пленках ZnO [25]. Между тем, одно исследование показало, что покрытые ZnO поверхности резко ограничивают образование биопленок, а образование гидроксильных радикалов играет ключевую роль в активности антибиотиков, но не в существовании ионов цинка [26]. Кроме того, композитные пленки ZnO могут использоваться во многих областях для ограничения образования биопленок и будут иметь хорошие перспективы применения для сохранения водных продуктов [27]. ZnO является гидрофильным, тогда как гидрофобные пленки хорошо сдерживают адгезию биопленок. Таким образом, необходимо улучшить гидрофобные свойства пленки ZnO.

Водные продукты очень быстро портятся из-за их микробной порчи [28]. В аэробных условиях хранения Pseudomonas виды и Shewanella putrefaciens известны как доминирующие организмы порчи [29]. Shewanella putrefaciens имеет психротрофную природу и может восстанавливать триметиламин- N -оксид в триметиламин [30]. Итак, Shewanella putrefaciens будут использоваться в качестве индикаторных бактерий в этой статье.

Микроструктура пленок ZnO будет отличаться из-за их основы из ПАК, что повлияет на свойства антибиотикопленки. В данной работе пленки ZnO были приготовлены на ПАК различной морфологии и модифицированы для повышения гидрофобности. Антибиотические свойства Shewanella putrefaciens композитных пленок ZnO / PAA. Результаты представляют потенциальную ценность для применения в пищевой упаковке, пищевом оборудовании и других областях антибактериальных функциональных материалов.

Материалы и методы

Материалы

Все реагенты, использованные в этом исследовании, были аналитически чистыми. Деионизированная и стерильная вода использовалась для приготовления растворов с проводимостью менее 0,5 мСм / см. Shewanella putrefaciens ATCC8071 был приобретен в Американской коллекции типовых культур. Алюминиевая фольга толщиной 0,3 мм с чистотой алюминия более 99,99% была закуплена у Shengshida Metal Materials Co., Ltd. (Китай).

Подготовка композитных пленок ZnO / PAA

Приготовление пленок из пористого анодного оксида алюминия (PAA)

Алюминиевая фольга высокой чистоты была разрезана на небольшие кусочки размером 10 × 30 мм ² и была отполирована полировальной пастой из диоксида кремния 50 нм с помощью полировальной машины (WV80, Positec Machinery Co., Ltd., Китай) и обезжирена ультразвуком в ацетоне при 53 кГц, 280 Вт в течение 15 мин (SK8210HP, Kudos Ultrasonic Instruments Co. Ltd. ., Шанхай). Затем фольги дважды промывали этанолом и водой соответственно. Предварительно обработанная алюминиевая фольга использовалась в качестве анода, графитовый лист с равной площадью в качестве катода и раствор щавелевой кислоты 0,3 моль / л в качестве электролита. Первое анодирование проводилось при 30 ° C и 40 В в течение 90 мин. После этого алюминиевые листы были погружены в смешанный раствор 6,0 мас.% H ₃ . ЗП ₄ и 1,8 мас.% H ₂ CrO ₄ при 60 ° C в течение 4 ч для удаления слоев оксида алюминия. Затем было проведено второе анодирование в тех же условиях, но в течение 0, 40, 60 и 80 мин соответственно. Были получены пленки пористого анодного оксида алюминия (ПАК) с другой моделью порта.

Подготовка композитных пленок ZnO / PAA

Сначала равный объем этанольного раствора ацетата цинка 0,02 моль / л и этанольного раствора 0,04 моль / л NaOH смешивали при быстром перемешивании при 70 ° C в течение 5 мин, а затем пленки ПАК (алюминиевая фольга) погружали в смешанный раствор. при степени вакуума - 0,085 МПа. После этого раствор нагревали до кипения. После того, как золь стал жидким синим, алюминиевую фольгу вынули и промыли деионизированной водой. Затем образцы сушили в вакууме при -0,085 МПа, 80 ° C в течение 6 часов и получали композитные пленки ZnO / PAA после прокаливания при 480 ° C в течение 2 часов в атмосфере воздуха. Одновременно готовили порошки оксида цинка. Наконец, композитные пленки ZnO / PAA и порошки были модифицированы 1,0 мас.% Раствором Si69 этанола при 65 ° C в течение 2 часов, а затем высушены в вакууме при -0,085 МПа, 40 ° C в течение 12 часов.

Характеристика композитных пленок ZnO / PAA

Рентгеновскую дифракцию порошков оксида цинка проводили с использованием порошкового рентгеновского дифрактометра (Rigaku Ultima IV, Rigaku, Japan) с шагом 0,02 ° и 2 θ диапазон 10–80 ° при CuKa-излучении 40 кВ, 50 мА. Температурные изменения и потерю веса образцов анализировали с помощью термогравиметрического / дифференциального термического анализатора (TG / DTA, Perkin Elmer Diamond). Инфракрасные спектры с преобразованием Фурье (FT-IR) регистрировали с помощью спектрометра ближнего FT-IR Scimitar 2000 (Agilent, American) в диапазоне 4000–400 см ^-1 . Микрофотографии поверхности пленок PAA и композитных пленок ZnO / PAA получали с помощью автоэмиссионной сканирующей электронной микроскопии (FESEM, S-4800, Hitachi, Япония). Морфология наночастиц, вырезанных из композитных пленок ZnO / PAA, измеряется с помощью полевой эмиссионной просвечивающей электронной микроскопии (FETEM, Jem-2100F, JEOL, Япония) и дифракции электронов на выбранной площади (SAED, Jem-2100F, EOL, Япония) образцы были исследованы. Краевые углы смачивания водой (CA) композитных пленок (до / после модификации) были измерены методом лежащей капли в нескольких различных местах на каждой поверхности образца с использованием 3,0-мкл капель деионизированной воды (SL200B, США).

Антибиотические свойства композитных пленок ZnO / PAA

Выращивание Shewanella putrefaciens Биопленка

Бактериальная суспензия вторичной активации Shewanella putrefaciens (OD ₅₉₅ ≈ 0,5) и щелочная пептонная вода (APW) 3% (м / об) NaCl были смешаны до однородности в соотношении 1:200 ( v / v ). Композитные пленки ZnO / PAA (0,5 × 0,5 см) погружали в разбавленные посевные материалы объемом 3 мл и инкубировали при 28 ° C в течение определенного времени. При этом условии Shewanella putrefaciens рос хорошо и показал сильную способность к размножению.

Анализ адгезии Shewanella putrefaciens Биопленки на композитных пленках ZnO / PAA

После культивирования в бактериальной суспензии Shewanella putrefaciens На определенное время композитные пленки ZnO / PAA с биопленкой переносили в другие стерильные центрифужные пробирки и трижды промывали 1 мл 0,85% (м / об) стерильного раствора NaCl для удаления свободных бактерий. Биопленку окрашивали 1 мл 0,2% мас. / Мас. кристаллический фиолетовый в течение 15 минут при комнатной температуре и трижды промывали 1 мл 0,85% (м / об) стерильного раствора NaCl для удаления избыточного кристаллического фиолетового. Затем окрашенные биопленки удаляли ультразвуком в 33% ( v / v ) уксусная кислота 200 мкл при 53 кГц, 280 Вт в течение 10 мин. ОД ₅₉₅ (оптическая плотность при 595 нм) вышеуказанного раствора регистрировали с помощью микропланшетного ридера VICTOR ™ X3 (Perkin Elmer, America) в 96-луночных микротитровальных планшетах. Результаты были представлены как «средние значения ± стандартное отклонение» трех параллельного эксперимента.

Анализ общего количества бактерий Shewanella putrefaciens Биопленка на композитных пленках ZnO / PAA

Композитные пленки ZnO / PAA с биопленкой трижды промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7,4; 137 ммоль / л NaCl, 2,7 ммоль / л KCl, 10 ммоль / л Na ₂ HPO ₄ , и 1,8 ммоль / л KH ₂ ЗП ₄ ), чтобы удалить плавающие бактерии, и окрашенные биопленки подвергали ультразвуковой очистке в 10 мл стерильного PBS при 53 кГц, 280 Вт в течение 10 мин. Впоследствии общее количество бактерий в биопленках измеряли методом подсчета на чашках. В трех параллельном эксперименте результаты были представлены в виде «средних значений ± стандартное отклонение», и была построена кривая роста колоний биопленочных бактерий.

Измерение на микрофотографиях Shewanella putrefaciens Биопленки

После удаления плавающих бактерий композитные пленки ZnO / PAA с биопленкой были погружены в 2,5% ( w / v ) глутарового альдегида при 4 ° C в течение 4 ч. Впоследствии образцы обезвоживались каждые 30 минут при 50, 70, 80 и 90% ( v / v ) этанол соответственно. После погружения в абсолютный этиловый спирт на 1 ч образцы сушили естественным образом на чистом столе. Микрофотографии поверхности образцов были получены с помощью FESEM (S-4800, Hitachi, Япония) после нанесения золотого напыления при 3 кВ в течение 40 с.

Измерение CLSM Shewanella putrefaciens Биопленки

Композитные пленки ZnO / PAA с биопленкой трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS, pH =7,4) для удаления плавающих бактерий, и образцы окрашивали в темноте в течение 15 мин в смешанном растворе 0,01% масс. акридиновый апельсин (АО, Sigma, Америка) и 0,1 мас.% йодида пропидия (PI, Sigma, Америка). После этого образцы трижды промывали PBS, чтобы удалить избыточный красящий раствор, и удаляли избыточную влагу. На биопленки капали десять микролитров антифлуоресцентных герметизирующих агентов (Biosharp BL701A, Китай), и образцы хранили при 4 ° C без света. Пропорции живых и мертвых клеток биопленок наблюдали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM, TCS-SP5 II, Германия Leica Instrument Co., Ltd.) [31, 32].

Результаты и обсуждение

Характеристика пленок ZnO

Рентгеноструктурный анализ порошков ZnO, полученных с помощью золь-гель процесса

На антибактериальные и антибиотикопленочные свойства оксида цинка влияет его кристаллическая структура [33, 34]. На рис. 1 показано, что кристаллическая структура образцов трансформируется после прокаливания. Перед прокаливанием образцы содержались в гексагональной вюрцитной структуре ZnO. Пики дифракции при 31,70 °, 34,52 °, 36,31 °, 47,68 °, 56,82 °, 62,92 ° и 67,92 ° для 2 θ соответствуют плоскостям кристалла оксида цинка (100), (002), (101), (102), (110), (103) и (112) (PDF № 36-1451, a = b =3,250 и c =5,207) соответственно. Широкие дифракционные пики указывают на низкую кристалличность и мелкие частицы ZnO. Между тем, менее примесные пики показывают промежуточное соединение в образце. После прокаливания при 230 ° C нечистые пики исчезают и измеряемый шум уменьшается, но ширина дифракционных пиков остается неизменной. Это означает, что промежуточное соединение исчезает, а степень кристаллизации увеличивается. С повышением температуры прокаливания дифракционные пики ZnO становятся более резкими, что указывает на увеличение кристалличности и рост кристаллических частиц.

Рентгенограммы порошков оксида цинка, прокаленных при различных температурах

Только связанная вода из Zn (CH ₃ COO) ₂ · 2H ₂ O образуется в этанольном растворе Zn (CH ₃ COO) ₂ , и гидролиз CH ₃ Главный операционный директор ^- заблокирован. Во-первых, Zn (CH ₃ COO) ₂ гидролизуется и дает промежуточный продукт.

4Zn (CH ₃ COO) ₂ · 2H ₂ О → Zn ₄ O (CH ₃ COO) ₆ + 2CH ₃ COOH + 3H ₂ О (1)

В процессе нагревания коллозолу способствует раствор NaOH в этаноле, а пространственно-стерический эффект CH ₃ Главный операционный директор ^- имеет большое значение для стабильности коллозола ZnO. Между тем нейтральная реакция CH ₃ COOH с NaOH бывает.

5Zn ₄ O (CH ₃ COO) ₆ + 22NaOH + 13H ₂ О → 4Zn ₅ (ОН) ₈ (Канал ₃ COO) ₂ · 2H ₂ O + 22CH ₃ COONa (2)

Канал ₃ COOH + NaOH → CH ₃ COONa + H ₂ О (3)

Spanhel и Anderson [35] указали, что алкоголь оксида цинка формируется из зерен ZnO в результате агрегации и роста Оствальда (старения). Затем промежуточное соединение Zn ₅ (ОН) ₈ (Канал ₃ COO) ₂ · 2H ₂ O нагревается и разлагается до фазы ZnO [36, 37]. Таким образом, гексагональная вюрцитная структура ZnO является основой высушенного желатина перед прокаливанием.

Zn ₅ (ОН) ₈ (Канал ₃ COO) ₂ · 2H ₂ О → 5ZnO + 2CH ₃ COOH + 5H ₂ О (4)

Hosono et al. [37] подтвердили этот механизм реакции. Этанольный раствор Zn (CH ₃ COO) ₂ · 2H ₂ O превращается в коллоидные продукты при нагревании при 60 ° C, и результаты XRD показывают, что сухой продукт желатина представляет собой смесь кристаллического ZnO ​​и Zn5 (OH) ₈ (Канал ₃ COO) ₂ · 2H ₂ О. После кипячения в течение 48 ч частицы превращаются в вюрцит ZnO.

Анализ TG / DTA

Результат ТГ / ДТА желатина из оксида цинка показан на рис. 2, и кривую ТГ можно разделить на три этапа. На первом этапе потеря массы составляет 68,6% от комнатной температуры до 100 ° C, а эндотермический пик существует при 62 ° C. Это соответствует потерям растворителя этанола и воды в желатине из оксида цинка. На втором этапе потеря массы составляет всего 3,8% от 100 до 400 ° C. Результаты XRD показывают исчезновение примесей, повышение кристалличности и рост кристаллических частиц после прокаливания при 230, 280 и 360 ° C соответственно. Небольшая потеря массы может быть связана с потерей поровой воды и переходом примеси. При температуре от 400 до 850 ° C потеря массы и эндотермический пик отсутствуют, что указывает на отсутствие кристаллической трансформации на этой стадии. Между тем, результат XRD показывает, что кристалл растет после прокаливания при 480 ° C. Результаты TG / DTA согласуются с результатами XRD.

Графики TG / DTA для желатина из оксида цинка

ИК-Фурье-анализ немодифицированных / модифицированных пленок оксида цинка

На рис. 3 показаны ИК-Фурье-спектры немодифицированных и гидрофобно модифицированных пленок ZnO. Широкие пики на 3600–3300 см ⁻¹ приписываются валентному колебанию -OH, а пик при 1651 см ^-1 объясняется изгибным колебанием –OH, соответственно, что указывает на поглощенную воду и капиллярную воду в образцах [38]. Пики на 2360 и 2328 см ⁻¹ связаны с двуокисью углерода в воздухе. Пики на 2943 и 2864 см ⁻¹ обусловлены асимметричными и симметричными валентными колебаниями −CH ₂ , соответственно. Более сильный пик на 1475 см ⁻¹ приписывается изгибной вибрации в плоскости или режущей вибрации -CH ₂ группы [39], а пик на 895 см ⁻¹ приписывается валентным колебаниям групп Si-O [40]. Пики примерно на 440 и 414 см ^-1 приписываются каркасным колебаниям групп Zn-O немодифицированного / модифицированного ZnO ​​[41]. Результаты показывают, что модификация вызывает разрыв –S – S– связей Si69, и триэтоксисилилпропил прививается к образцам, поэтому гидрофобные свойства пленок ZnO повышаются. Ван [42] сообщил, что дисперсия нано-ZnO может быть улучшена путем модификации in situ Si69 и Si69, привитых на поверхность частиц нано-ZnO посредством химической реакции. Это согласуется с результатами нашего анализа.

ИК-Фурье спектры пленок немодифицированного / модифицированного оксида цинка

Анализ микроморфологий пленок PAA

На морфологию пленок ПАК влияет время второго анодированного окисления. Как показано на рис. 4, после удаления слоев оксида алюминия после первого анодирования пленка ПАК представляет собой сплошной гексагональный сотовый каркас с нанопорами 5–10 нм (рис. 4а). После двухэтапного анодирования в течение 40 мин нанопоры трансформируются в многослойные оболочки-каркасы (рис. 4б). После двухэтапного анодирования в течение 60 мин многослойные рамки оболочки блекнут, а диаметр нанопор увеличивается до 20–40 нм, при этом на поверхности остаются выступы (рис. 4в). При увеличении времени двухэтапного анодирования до 80 мин нанопоры увеличиваются до 60–70 нм, а выступы исчезают (рис. 4d).

СЭМ-изображения пористого анодного оксида алюминия (PAA) с разным временем второй продолжительности анодирования a 0 мин, b 40 мин, c 60 мин и д 80 мин.

Согласно теории кислотного полевого растворения (AFAD) [43], в процессе анодирования оксидные пленки барьерного слоя становятся неоднородными, и образуются гребни. В этих точках формированию и развитию микропористости способствует обострение AFAD. При увеличении времени второго анодирования на поверхности постепенно образуются упорядоченные и сквозные отверстия, а затем исчезают многослойные оболочки и выступы (рис. 4б – г). Результат аналогичен Reddy’s, который получил ПАК посредством двухэтапного процесса анодирования в 0,3 моль / л щавелевой кислоты [44].

Анализ микроморфологий пленок ZnO

На антобиопленочные свойства поверхностей материалов влияют их морфология и вещества [12]. Как показано на рис. 5, морфология пленок ZnO существенно отличается, которые получены на пленках PAA с разным временем второй продолжительности анодирования. На поверхности пленки ПАК с нанопорами 5–10 нм плотно прикрепляются агломерированные крупные частицы размером 20–30 нм и образуют толстые пленки ZnO (рис. 5а). На поверхности пленки ПАК, приготовленной методом двухэтапного анодирования продолжительностью 40 мин, на пленке ZnO остаются кадры многослойной оболочки (рис. 5б). Как показано на рис. 5c, частицы ZnO прикреплены к каркасу пленки PAA и образовали отверстия большего размера. На образце с нанопорами 60–70 нм частицы ZnO размером 10–20 нм прикрепляются к краю отверстий ПАК, и часть частиц попадает в нанопоры (рис. 5г). Это может быть коллозол, проникающий в более крупные отверстия в условиях вакуума и затем образующий частицы ZnO. Приведенные выше результаты показывают, что чем меньше диаметр нанопор ПАК, тем выше скорость прилипания ZnO. Wu et al. [45] считают, что частицы коллозола легко образуются на стенках отверстий из-за негатива частиц золя и положительного элемента стенок поры ПАК. Вывод также согласуется с исследованием Bousslama et al. [46]. Коллозол просто прикрепляется к стенке отверстий, когда пленка PAA погружается в золь цинка на 24 часа, а затем отверстия заполняются на 48 часов, что указывает на то, что частицы коллозола прикрепляются преимущественно к стенке отверстий.

СЭМ-изображения пленок ZnO, полученных на ПАА с разным временем двухэтапного анодирования a 0 мин, b 40 мин, c 60 мин и д 80 мин.

Приведенные выше результаты показывают, что частицы коллозола легко входят в большие отверстия и прикрепляются к внутренней поверхности в условиях вакуума; однако частицы коллозола прикрепляются только к каркасу внешних поверхностей PAA с небольшими отверстиями.

ПЭМ-изображения пленки ZnO, вырезанной из композитной пленки ZnO / PAA, показаны на рис. 6. На поверхности PAA, полученной только одностадийным анодированием, отслоившиеся частицы ZnO имеют размер около 10 нм, но частицы размером 20–30 нм. нм показаны на СЭМ-изображении (рис. 5а), что указывает на агломерирование частиц ZnO. На поверхности PAA, полученной двухступенчатым анодированием, расслоенные частицы ZnO имеют размер приблизительно 20 нм, и часть частиц агломерирована в отдельных местах. Видно, что частицы ZnO сначала прикрепляются к краю отверстий PAA (рис. 6c, e, f).

Изображения TEM ( a , c , e , f ) и шаблоны SAED ( b , d ) пленок ZnO, полученных на ПАА с разной продолжительностью двухступенчатого анодирования a , b 0 мин c , d 40 мин; е 60 мин; и е 80 мин.

Плоскости решетки (100), (101), (102), (110) и (103) гексагональной структуры вюрцита ZnO показаны на диаграммах SAED (рис. 6b, d), что указывает на то, что ZnO ​​является гексагональным вюрцитом. Результаты совпадают с результатами XRD-анализа.

Характеристика гидрофобности-гидрофильности поверхности пленки ZnO

Чтобы уменьшить бактериальную адгезию материалов, приготовленные пленки ZnO с различной микроморфологией обрабатываются для улучшения гидрофобности, а угол контакта с водой на поверхности тонкой пленки до и после модификации показан в таблице 1.

До модификации пленки ZnO являются гидрофильными из-за наличия гидроксильных групп на поверхности частиц ZnO. Гидрофильность является наилучшей благодаря пористой структуре, приготовленной на поверхности ПАК с продолжительностью двухступенчатого анодирования 40 мин. Для других образцов с продолжительностью двухэтапного анодирования 60 и 80 мин гидрофилы постепенно уменьшаются из-за низкого адгезионного количества ZnO. Для образца с продолжительностью одноэтапного анодирования низкая гидрофильность объясняется его непористой структурой.

После модификации пленки ZnO переводятся в гидрофобные. По данным FT-IR анализа, триэтоксисилилпропил прививается на образцы после разрыва связей –S – S– Si69. Между тем, это могло быть результатом его пористой структуры и большего количества частиц ZnO; пленка имеет наивысшую гидрофобность при продолжительности двухступенчатого анодирования 40 мин.

Характеристика Shewanella putrefaciens Биопленки

Chi et al. [47] сообщили, что анодированный алюминий не обладает антибактериальной активностью по отношению к грамотрицательным бактериям ( Escherichia coli и П. aeruginosa ) и грамположительные бактерии ( Streptococcus faecalis и золотистый стафилококк ). Однако ZnO ​​обладает отличной антибактериальной и антибактериальной активностью [25, 26, 27], и существует положительная корреляция между антибактериальной и антибактериальной активностью [48, 49]. Кроме того, на антибактериальные свойства ZnO влияет его микроструктура [50, 51]. Чтобы получить поверхность с превосходной антибиотической активностью, пленки ZnO с различной микроструктурой были приготовлены на пленках PAA с разным временем второй продолжительности анодирования, и были измерены свойства антибиотикопленки.

Адгезия биопленок и кривые роста бактерий биопленок

Формирование и развитие бактериальной биопленки можно разделить на пять этапов:обратимая адгезия бактерий к поверхности изначально; переход от обратимой адгезии к необратимой адгезии; начальное образование биопленки; развитие созревшей биопленки; биопленка разрушается, и бактерии возвращаются в планктонное состояние [52].

Как показано на рис. 7 (1), через 2 часа прикрепление Shewanella putrefaciens биопленка на пленках ZnO быстро увеличивается, демонстрируя переход от обратимой адгезии бактерий к необратимой. С 2 до 12 ч прилипание биопленки постепенно увеличивается, что является стадией роста биопленки. С 12 до 24 часов прилипание биопленки увеличивается или немного снижается, что свидетельствует о зрелой стадии биопленки. Через 24 часа прилипание биопленки снижается, и биопленки переходят в стадию дегенерации. Рисунок 7 (2) показывает, что тенденция к изменению бактерий биопленки согласуется с прилипанием биопленки, указывая на то, что развитие биопленки зависит от бактерий биопленки.

Адгезия Shewanella putrefaciens биопленка ( 1 ) и кривая роста колоний биопленочных бактерий ( 2 ) на пленках ZnO, приготовленных на ПАК с разным временем двухэтапного анодирования (а) 0 мин, (б) 40 мин, (в) 60 мин, (г) 80 мин

Кроме того, для пленки ZnO, приготовленной на поверхности PAA с продолжительностью двухэтапного анодирования в течение 80 мин, адгезия биопленки и общее количество бактерий биопленки являются самыми высокими среди четырех образцов. Однако для пленки ZnO, приготовленной на поверхности ПАК с продолжительностью двухэтапного анодирования в течение 40 мин, свойство антибиотикопленки является оптимальным. Это может быть связано с прилипанием биопленки, которое подавляется самой высокой гидрофобностью, а затем меньшим количеством экзополисахаридов (EPS) и других питательных веществ, препятствующих росту бактериальной биопленки. Для пленки ZnO, приготовленной на поверхности PAA с продолжительностью двухэтапного анодирования в течение 80 мин, ее гидрофильность хороша для начального прилипания биопленки, и меньшее количество частиц ZnO не препятствует росту бактерий биопленки. Между тем, большее количество адгезивных материалов для биопленки питает бактерии биопленки, и бактерии биопленки быстро размножаются. Согласно нашим исследованиям, прилипание биопленки сдерживается более высокой гидрофобностью пленки ZnO на начальной стадии образования биопленки [49]. На прилипание биопленок влияют гидрофобные и гидрофильные свойства материалов [14, 53, 54]. Bonsaglia et al. [14] сообщили, что Л. monocytogenes adhere to the hydrophilic surface more easily than to the hydrophobic surface. Many studies found that the bacterial adhesion is reduced or inhibited by hydrophobic surface [47, 54]. Shaer et al. [54] indicated that the biofilm colonization on the functionalizing orthopedic hardware could be prevented by hydrophobic polycations. Chen et al. [55] also suggested that the biofilm could be inhibited by low surface free energy. The results matched those from us.

The Morphological Characteristics of Shewanella putrefaciens Biofilm

The microtopographies of Shewanella putrefaciens biofilm at various stages are shown in Fig. 8.

SEM images of the biofilms on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min

After cultivated for 2 h, there are less adhesive materials on the ZnO film prepared on PAA without two-step anodization (a) and with two-step anodization duration for 40 min (b), but more adhesive materials and a few bacteria on the other two (c, d). It is indicated that the anti-adhesive properties of the former two are better than the latter two, it is consistent with Fig. 7. After cultivated for 12 h, more and more EPS and bacteria are attached to ZnO films, signifying the rapid growth of the biofilm. At 24 h, the EPS films are thickened gradually and biofilm bacteria grew well, indicating mature biofilms. At 36 h, the deciduous EPS films and dead bacteria illustrate the biofilm degenerating stage.

According to the antibacterial mechanisms of dissolved metallic ions, the dissolved zinc ions are combined with active proteinase of bacteria, make proteinase lose its bioactivity, and damage its bacterial cells to death [34, 56]. Thus, the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to the latter two (c, d) due to their plentiful ZnO particles on the films. Xie [57] and Jones [58] also thought that the antibacterial abilities strengthened with the dosage increasing of ZnO particles. Meanwhile, the adhesive materials and bacteria on the sample (d) are all more than the others, according to the analysis of adhesion of Shewanella putrefaciens biofilm and colony growth curve of the biofilm bacteria (Fig. 7). Feng et al. [59] found that the hypha of Escherichia coli easily reached into the PAA pores with diameters of 50 and 100 nm, and the biofilm accumulated and adhered to the surface of PAA. However, there is no hypha of Shewanella putrefaciens could be observed in our study. It can be inferred that the optimal antibiofilm properties are ascribed to the lower hydrophobicity of ZnO film in the initial stage of the biofilm formation.

The CLSM Characteristics of the ZnO/PAA Composite Biofilms

As shown in CLSM images, the live Shewanella putrefaciens bacteria are green, and the dead ones are red (Fig. 9). The black images indicate that the counts of live bacteria on the surfaces are few after biofilm cultivation for 2 h. Biofilm bacteria multiply rapidly, and the counts of live bacteria are significantly increased with the cultivation time. More dead bacteria are observed in the former two (a, b) at 24 h and in all samples at 36 h. The counts of dead bacteria of the latter two (c, d) are less than that of the former two (a, b). The results indicate that the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to that of the latter two (c, d), which is according to the previous analysis.

CLSM images biofilms formed on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min

Conclusions

In this work, the PAA films with different microstructures were prepared by two-step anodic oxidation first, and then the ZnO/PAA composite films are prepared by sol-gel. The ZnO films are hydrophilic due to the surface hydroxyl group on the ZnO particles. After being modified by Si69, the ZnO films translate to hydrophobicity because of its hydrophobic group. The antibiofilm properties of the ZnO films are affected by the hydrophobicity and amount of ZnO particles. The hydrophobicity inhibits the initial adherence of the biofilm and less EPS and the other nutrient against the growth of biofilm bacteria. So, the antibiofilm properties of the ZnO/PAA film are optimal which are prepared on the PAA surface with two-step anodization duration for 40 min because of its super-hydrophobicity and plenty of ZnO particles.

Сокращения

AO:

Acridine orange

CA:

Water contact angle

EPS:

Exopolysaccharides

FT-IR:

Fourier transform infrared spectrometer

PAA:

Porous anodic alumina

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

PI:

Propidium iodide

SAED:

Электронная дифракция в выбранной области

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

TG/DTA:

Thermogravimetric/differential thermal analyze

XRD:

X-ray diffusion