Улучшенные плазмонные биосенсоры гибридного иммуноанализа на основе наночастиц золота и оксида графена

Фон

Материалы на основе молекул углерода, такие как углеродные нанотрубки [1, 2], углеродные шары (бакминстерфуллерен, C60) [3], двумерный графен [4,5,6] и оксид графена (GO) [7,8,9 , 10,11] широко используются в биосенсорах. Среди них двумерная листовая структура графена является идеальным материалом для создания тонких пленок с высокой проводимостью [12, 13], превосходными характеристиками оптической проницаемости [14] и высокой биосовместимостью [15, 16]. По этим причинам материал на основе графена широко используется в биомедицинских и электрохимических сенсорных технологиях [17, 18]. Кроме того, фотоэлектрический тип технологии биологического зондирования в основном основан на ГО [19,20,21]. Поскольку оксидные группы можно отрегулировать для поглощения и излучения световой запрещенной зоны [22, 23], он обычно используется во флуоресценции [24], поверхностном плазмонном резонансе (SPR) [8,9,10,11, 19,20,21 ] и технологии обнаружения локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) [25, 26]. В частности, GO имеет уникальные химические функциональные группы (эпоксидные мостики, гидроксильные группы, попарные карбоксильные группы (карбоксил и карбонил)), которые улучшают аффинность и ковалентное связывание биомолекул.

Синтез графенового материала в сочетании с наночастицами (такими как Pt, Au, Ag, Pd и ZnO) широко изучался для разработки новой технологии нанокомпозитов. В частности, использование наночастиц золота (AuNP) было использовано в качестве механизма передачи энергии в колориметрической и абсорбционной спектроскопии. Кроме того, в течение последнего десятилетия исследования AuNP в видимом свете выявили уникальные характеристики плазмонного резонанса. Поскольку регулировка размера и формы AuNPs может изменить сдвиг длины волны оптического поглощения, AuNPs можно использовать для увеличения поглощения плазмы и усиления сигнала [27, 28]. Таким образом, AuNP широко используются в широком спектре приложений, таких как оптоэлектронные компоненты, из-за их особых оптических и оптоэлектронных свойств для улучшения вывода света [29, 30] и реакций поглощения света [31,32,33]. Кроме того, AuNP являются биосовместимыми, и они были изучены на предмет их использования в химическом зондировании, биомедицинской визуализации, терапии рака [34, 35], носителях лекарств [32, 33], фототермической терапии [36,37,38], применение контрастного вещества [39], радиосенсибилизатора [40] и биосенсора [33, 41, 42, 43].

Функциональность AuNP была изменена путем добавления сшивающего агента, чтобы избежать окисления и действовать как носитель фитохимических веществ или векторов; таким образом, эта комбинация может повысить биосовместимость и биоактивность [44,45,46]. Сшивающие агенты, такие как цистамин (Cys) или 8-меркаптооктановая кислота (MOA), активируются самоорганизующимися монослоями тиолов с концевыми карбоновыми кислотами (SAM) на модифицированной поверхности Au. MOA связывается с поверхностью Au через тиоловый линкер (-SH конец), образуя монослои.

Кроме того, широко освещаются исследования плазмонного металлического материала. Например, было показано, что наночастицы оболочки с плазмонным металлическим ядром [47], нанозвезды [48] и наночастицы оксида олова, легированные фтором [49], увеличивают ширину запрещенной зоны, что делает их желательными для применения в солнечных элементах и ​​датчиках. P>

Более того, использование гибридов AuNP-GO на основе химического синтеза [50,51,52] и электростатической самосборки [53] было зарегистрировано в сенсорных, энергетических и каталитических приложениях. В последние годы все больше исследований сосредоточено на использовании гибридов AuNP-GO в биосенсорах. Было показано, что эти гибриды полезны при разработке платформы электрохимической [54,55,56,57,58,59] и поверхностно-усиленного рамановского рассеяния (SERS) [56, 59] для улучшения применения в биологических анализах. Однако в настоящее время нет соответствующих отчетов об использовании невооруженного глаза или колориметрической технологии биосенсоров быстрого иммуноанализа. Например, электрохимические ДНК-биосенсоры на основе гибридов AuNP-GO использовались для обнаружения биомаркеров рака молочной железы с целью ранней диагностики. С помощью этого биосенсора был достигнут предел обнаружения (LOD) 0,16 нМ с чувствительностью 378 нА / нМ для биомаркера ERBB2 [54]. Кроме того, для селективного определения концентрации 3,3′4,4′-полихлорированных бифенилов (PCB77) между 1 пг L ^{- использовался нанокомпозитный электрохимический аптасенсор на основе нанокомпозита AuNP с точечным восстановлением оксида графена (rGO-AuNP). 1} и 10 мкг л ^{- 1} , с уровнем детализации 0,1 пг л ^{- 1} [55]. Более того, гибриды AuNP-GO использовались в качестве электрохимического биосенсора для обнаружения перекиси водорода (H ₂ О ₂ ), с пищевым динамическим ответом от 0,1 до 2,3 мМ и LOD 0,01 мМ [57]. Другим хорошим примером является использование гибридов AuNP-GO [56, 59] и AuNP-графен [59] для биосенсоров на основе SERS в различных приложениях, а также для биоимиджинга, измеренного с помощью SERS.

В данной работе мы предлагаем альтернативный метод химического синтеза и электростатической самосборки гибридов AuNP-GO с использованием послойной самосборки. Мы также анализируем биологическую чувствительность обнаружения модифицированных комбинированных листов AuNP и GO и их иммунный ответ на белки. Мы разработали два типа иммуноанализов без метки белка на основе AuNP-GO и оценили их время ответа и чувствительность во взаимодействиях антиген-антитело. Превосходные чувствительные особенности композитов графен-AuNP включают сверхвысокую чувствительность и сродство биомолекулярных взаимодействий, которые влияют на обнаружение разнообразного диапазона биомолекул с высокой специфичностью. Эти особенности означают, что эти композиты будут играть многообещающую роль в будущих приложениях и потенциально могут стать предпочтительным способом обнаружения заболеваний в приложениях клинической диагностики.

Методы / экспериментальные

Материалы

Графит был приобретен в Graphene Supermarket (Graphene Laboratories Inc., Рединг, Массачусетс, США). Листы GO были получены из чешуек графита с использованием модифицированного метода Хаммера [60] с последующим ультразвуковым растрескиванием в течение 5 часов для размеров чешуек 0,1–1 мкм и толщины 1,1 нм. Дигидрохлорид цистамина (Cys, 96%), тригидрат тетрахлораурата (III) водорода (HAuCl ₄ · 3H ₂ O), ACS, 99,99% (в пересчете на металлы) и Au 49,5% min были закуплены у Alfa Aesar Co. (США). Цитрат натрия (HOC (COONa) (CH ₂ COONa) ₂ · 2H ₂ O) был приобретен у J.T. Baker Chemical Co. (США). Бычий сывороточный альбумин (BSA, SI-B4287, Sigma-Aldrich, США), антитела против бычьего альбумина, продуцируемые у кролика (анти-BSA, SI-B1520, Sigma-Aldrich, США), N -гидроксисукцинимид (NHS) и 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) были приобретены у Sigma-Aldrich Inc. (США). Иммуноглобулины (Ig) структуры антитела против BSA продуцировались В-лимфоцитами и секретировались в плазму. Мономерные формы молекул Ig представляют собой гликопротеины с молекулярной массой около 150 кДа. Каждый мономер Ig был способен связывать две молекулы антигена. Все реагенты и растворители использовались без дополнительной очистки.

Мы использовали три различных температурных режима:550, 400 и 100 ° C со временем кипения 5, 5 и 120 минут соответственно, чтобы контролировать восстановление наночастиц. Эти разные температуры уменьшили наночастицы, чтобы получить тот же спектр поглощения при 520 нм, как ясно видно в Дополнительном файле 1:Рисунок S1.

Синтез AuNP

Метод, использованный для получения AuNP, был основан на использовании цитрата натрия в качестве восстанавливающего агента для восстановления ионов тетрахлораурата таурина в воде. Объем 15 мл HAuCl ₄ · 3H ₂ Раствор O, содержащий 1 мМ Au, кипятили с обратным холодильником и 1,8 мл 38,8 мМ цитрата натрия (Na ₃ С ₆ H ₅ О ₇ ) раствор добавляли к кипящему (550 ° C, 1100 об / мин) раствору. Восстановление ионов золота цитрат-ионами завершалось через 5 мин, после чего раствор кипятили в течение 30 мин (400 ° C, 900 об / мин), а затем оставляли охлаждаться до комнатной температуры [36, 61, 62]. Этот метод дает сферические AuNP со средним диаметром около 15 нм, а уменьшенная концентрация 38,8 мМ цитрата натрия в 0,8 мл может быть использована для получения AuNP со средним диаметром около 60 нм [63, 64]. Химическая реакция выглядит следующим образом:HAuCl _{4 (водн.)} + C ₆ H ₅ О ₇ Na _{3 (водн.)} → Au _(s) + CO ₂ + HCOOH.

Подготовка GO на основе антигенной мишени

Мы разработали метод иммуноанализа для приготовления листов GO, как показано на рис. 1. Мы использовали 200 мкл раствора листа GO с концентрацией 0,1 г / л и активацию карбоксильных концевых групп на поверхности листов GO для ковалентной связи. формирование для иммобилизации углеводородных цепей проводили с использованием смеси 400 мкМ (EDC) / 100 мкМ (NHS) при объемном соотношении 1:1. Белок BSA был иммобилизован на концах листов GO с использованием EDC / NHS для активации и стимулирования реакций ковалентного связывания между карбоксильными группами на GO и –HN ₂ BSA. Затем активированная поверхность –COOH была подвергнута сильной ковалентной иммобилизации через амин (NH ₂ ) -реакция связывания с 20 мкл белка BSA в концентрации 100 мкг / мл. Наконец, мы использовали центрифугу для многократного удаления неиммобилизованного белка BSA с поверхности GO. Процедура определения мишени для антигена GO-BSA показана на рис. 1.

GO-BSA взаимодействие. Карбоксильная группа листов GO может быть активирована с помощью реакции EDC / NHS и приготовления GO на основе антигена-мишени для GO-BSA

Приготовление AuNP и AuNP-GO на основе зонда антител

Функционализацию поверхности проводили с использованием Cys с 15 нм AuNP в объеме 200 мкл. AuNP были химически модифицированы с использованием дериватизированного тиолового самоорганизующегося монослоя Cys. AuNP погружали в раствор Cys (10 мМ) на 2 ч при комнатной температуре. Из-за сильной связи AuNP – S (тиоловой связи) Cys может легко соединяться с AuNP и –NH ₂ группы, экспонированные на поверхности AuNPs – Cys – NH ₂ . Затем мы добавили 20 мкл антител (antiBSA) со 100 мкг / мл белка для иммобилизации поверхности AuNP с последующим повторным центрифугированием для удаления неиммобилизованного Cys на поверхности AuNP. Затем использовали деионизированную воду для удаления любых неиммобилизованных AuNP (Cys представляет собой аминотиольную структуру, которую не нужно активировать с помощью EDC / NHS). Cys, присоединенный к AuNP, содержал амин (–NH ₂ ) группы, ковалентно связанные с карбоксильными (–COOH) группами на поверхности анти-BSA. Наконец, мы использовали повторное центрифугирование для удаления неиммобилизованного белка анти-BSA с поверхности AuNP. Серию концентраций белка анти-BSA получали серийным разведением от 100 мкг / мл до 1 пг / мл. Приготовление зонда AuNP-antiBSA при различных концентрациях антител показано на рис. 2а.

Взаимодействия AuNP-antiBSA и AuNP-GO-antiBSA. Подготовка a AuNP и b AuNP-GO на основе зонда антител

Для модификации нанокомпозита AuNP-GO мы использовали AuNP, приготовленные методом листа GO. AuNP были получены с использованием метода восстановления цитрата натрия, а размер AuNP 60 нм был модифицирован с использованием Cys (5 мМ). Затем мы использовали EDC / NHS для активации групп –COOH на поверхности листов GO. Cys, присоединенный к AuNP, включает –NH ₂ группы, ковалентно связанные с группами –COOH на поверхности листов GO. AuNPs на поверхности листов GO иммобилизовались с использованием линкера Cys, чтобы способствовать реакциям ковалентного связывания между AuNPs и GO. Ковалентное соединение предлагает стабильный и простой способ склеивания функционализации поверхности на листах GO. Листы GO тщательно промывали деионизированной водой для удаления несвязанного GO с поверхности AuNP-линкера. AuNP-Cys сформировал новый композит AuNP-GO с последующей иммобилизацией с различными концентрациями разведения от 100 мкг / мл до 1 пг / мл зондирующего белка антитела (antiBSA) с образованием AuNP-GO-antiBSA, как показано на рис. 2б.

Характеристика AuNP и GO Sheets

Дисперсия и морфология листов AuNP-GO были охарактеризованы с использованием просвечивающего электронного микроскопа с автоэмиссионной пушкой 300 кВ (FEG-TEM; Tecnai G2F30S-Twin, Philips-FEI, Амстердам, Нидерланды) и просвечивающего электронного микроскопа высокого разрешения ( HR-TEM) на системе FEI Tecnai G20 (Хиллсборо, Орегон, США). Дисперсия и морфология листов AuNP-GO и GO были охарактеризованы с использованием аналитического сканирующего электронного микроскопа с полевой эмиссией JEOL JSM-7800F Prime с экстремальным разрешением (JEOL Inc., США). Спектр пропускания в ультрафиолетовой и видимой областях спектра двухлучевого спектрофотометра наблюдали с использованием спектрофотометра УФ-видимой области (U-2900, Hitachi High-Technologies Corporation, Токио, Япония) с длиной волны от 200 до 1100 нм при комнатной температуре. . Рамановские измерения проводили с использованием микроскопической рамановской системы (MRI, Protrustech Co., Ltd., Тайвань). В качестве детектора использовался спектрометр с воздушным охлаждением (AvaSpec-ULS2048L) с решеткой 1800 штрихов / мм и щелью 50 мкм. Измерения инфракрасного спектрометра с преобразованием Фурье (FTIR) были выполнены с использованием спектрометра Bruker Vertex 80v в режиме ослабленного полного отражения (ATR) и детектора DTGS (64 сканирования) с разрешением 2 см ^{- 1} на таблетке из KBr в вакууме при давлении около 6 Па. Инструментальный центр при Национальном университете Цин Хуа поддержал эту работу. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) была выполнена с использованием оборудования в Национальном центре исследований синхротронного излучения, Синьчжу, Тайвань. Эксперименты по фотоэлектронной спектроскопии проводились с использованием линии спектроскопии 09A2 U5 для XPS. Фотоны с фиксированными энергиями 380 и 900 эВ использовались для C (1s) и Co (2p) во всех экспериментах по фотоэлектронной спектроскопии на остовном уровне. Эксперименты проводились в режиме полного электронного выхода на высокоэнергетическом монохроматоре с сферической решеткой диаметром 6 м. Фотоны падали на нормальную поверхность, а фотоэлектроны собирались под углом 58 ° от нормальной поверхности. Энергии связи во всех спектрах отнесены к Au 4f ^7/2 основной уровень на 84,0 эВ. После вычитания линейного фона спектры были аппроксимированы смешанными функциями Гаусса – Лоренца на основе нелинейного алгоритма наименьших квадратов [65].

Результаты и обсуждение

Анализ структуры и морфологии

Размер AuNP зависел от природы восстановителя и условий образования и хранения. Анализ SEM показал, что листы GO и AuNP были равномерно прикреплены к поверхности GO со средним размером AuNP 60 нм (рис. 3). На рис. 3а показаны СЭМ-изображения листов GO на пленке Au, причем размеры листов GO были меньше 1 мкм. Сравнивая GO и AuNP-GO, в композите AuNP-GO можно было наблюдать золотой элемент. Это указывало на то, что AuNP успешно адсорбировались на морщинистой поверхности GO. Синтезированные гибриды AuNP-GO были охарактеризованы с помощью ПЭМ, как показано на рис. 3b. На рис. 3б, в показаны условия синтеза. Концентрация 10 мл листового раствора GO составляла 0,1 г / л, а 200 мкл раствора AuNP имели концентрацию 2,2 нМ. Изображения ПЭМ на рис. 3a с масштабной полосой 100 нм и рис. 3b с масштабной полосой 0,5 мкм показывают различное усиление размера и ясно показывают, что AuNPs были иммобилизованы на поверхности листов GO. AuNP имели сферическую форму, что свидетельствует о том, что карбоксильные группы на поверхности листов GO могут играть важную роль в образовании химических ковалентных связей с AuNP, как показано на рис. 2b.

Анализ морфологии поверхности нанокомпозита. а СЭМ-изображения листа GO и b ПЭМ-изображение композита AuNP-GO. c ПЭМ-изображение пленки ERGO AuNP-GO

Характеристики GO с помощью XPS, комбинационного рассеяния света и FTIR-спектроскопии

На рис. 4а показан спектральный анализ листов GO с помощью C 1s XPS с высоким разрешением. C1s с наибольшей интенсивностью при энергии связи 284,6 эВ соответствовали карбонильным функциональным группам для C – C (sp2), а пики при 285,6, 286,6, 288,2 и 289,4 эВ соответствовали C – C (sp3) в ароматических кольцах. , C – O в гидроксильных и эпоксидных группах, C =O в карбонильных группах и O – C =O в карбоксильных группах соответственно. C 1s XPS-спектры листов GO на подложке из золотой пленки показали, что относительные атомные проценты C – C (sp2), C – C (sp3), C – O, C =O и O – C =O были 77,44, 2,16, 18,14, 1,77 и 0,49% соответственно [66]. На рисунке 4b показан спектральный анализ комбинационного рассеяния листов GO в растворе NaCl с пиками спектральных характеристик при 1614 см ^{- 1} . (Полоса G), 1355 см ^{- 1} (Полоса D), 2714 см ^{- 1} (Полоса 2D), 2947 см ^{- 1} (Полоса G + D) и ~ 3240 см ^{- 1} (2D ’полоса) [38, 67]. Формирование листов GO было дополнительно проанализировано для выяснения свойств различных оксигенированных частиц с использованием спектров ATR-FTIR, как показано на фиг. 4c. Спектры НПВО-FTIR также выявили несколько характерных пиков GO; C – O на 850 см ^{- 1} из-за колебаний (C – O – C) эпоксида, C – O при 1080 см ^{- 1} из-за валентного колебания (C – O) алкокси, C =C при 1500 ~ 1600 см ^{- 1} из-за ароматических связей C =C и C – O при 1260 см ^{- 1} за счет асимметричных колебаний (C – O – C) эпоксида. Карбоксильные группы на краях листов GO демонстрируют валентные колебания –COOH с пиками при 1652 и 1731 см ^{- 1} соответствующие валентным колебаниям C =O от карбонильных групп. Спектры также показали три пика при 2900 см ^{- 1} . связанные с асимметричными и симметричными валентными колебаниями –CH ₂ и пик деформации на 1462 см ^{- 1} за счет алкеновых групп (C – H), расположенных на плоскости GO. FTIR-спектры GO показали широкий диапазон пиков широкополосного поглощения C – OH и H ₂ . Колебания O на высоте 3370 см ^{- 1} за счет растягивающих колебаний [67].

Спектральный анализ листов GO. а XPS-сканирование с высоким разрешением в области C1s, b Раман и c FTIR

Анализ GO и AuNP со свойствами взаимодействия с белками

УФ-видимые спектры водных GO и AuNP с дисперсиями взаимодействия с белками представлены на рис. 5. AuNP имели высокие коэффициенты экстинкции и уникальный размер в зависимости от полос поглощения поверхностных плазмонов (SP). Модифицированные AuNP двух разных размеров составляли 15 и 60 нм для 520 и 540 нм спектров поглощения SP [68, 69]. На рис. 5а показан раствор AuNP (520 нм), модифицированный Cys в концентрации 5 мМ с полосой экстинкции AuNP-Cys [69]. В УФ-видимых спектрах водных дисперсий ГО наблюдались два пика поглощения:максимум при 230 нм, соответствующий плазмонному пику π – π * ароматических связей C – C в ароматических sp2-кластерах разного размера, и плечо при 300 нм, соответствующее n – π * плазмонный пик из-за наличия эпоксидных и карбонильных (C =O) связей (рис. 5б) [9, 20]. УФ-видимые спектры растворов GO – EDC / NHS и GO – EDC / NHS – BSA (рис. 5b) показали, что GO – EDC / NHS и GO – EDC / NHS – BSA имеют пик около 270 нм, что соответствует вероятно, из-за сильного взаимодействия ГО с аминогруппами [70, 71]. На рис. 5в показаны спектры поглощения связей для различных концентраций анти-BSA с AuNP (60 нм). На рисунке 1b показан раствор для синтеза зонда AuNP-antiBSA (образец B1). Длины волн имели очевидные пики поглощения при 540 и 755 нм, при этом длина волны при 540 нм в основном вызывалась AuNP (60 нм), а пик при 755 нм соответствовал пику поглощения комбинации AuNP + Cys + анти-BSA. Этот результат показал, что увеличение концентрации анти-BSA вызывает постепенное увеличение поглощения при 540 нм и непрерывное увеличение поглощения в ближнем ИК-диапазоне при 755 нм. Различные анти-BSA-связывающие взаимодействия на поверхности AuNP вызвали изменения показателя преломления поверхности, который, в свою очередь, был преобразован в интенсивность поглощения LSPR. На полосу LSPR влиял размер частиц. AuNP показали сильные полосы ППР в видимой области. С увеличением показателя преломления частиц среднего размера сдвиг в положениях пиков ППР можно было изменять с видимого диапазона на ближний инфракрасный. В результатах экспериментов по взаимодействию белков мы смешали AuNP-antiBSA, как показано на фиг. 5d. Чувствительность определялась путем построения зависимости длины волны LSPR полосы 500–760 нм от измеренного показателя преломления. Затем мы использовали разведение различных концентраций белка antiBSA от 1,45 нМ до 145 фМ и смешали их в объеме 200 мкл. Изменения поглощения при 540 и 760 нм были вызваны разными концентрациями анти-BSA и AuNP. Затем через 5 минут были выполнены спектральные измерения, которые показали различные концентрации поглощения интенсивности света, и пик поглощения AuNPs в 60 нм наблюдался при 540 и 755 нм. Эти результаты согласуются с калибровочными кривыми поглощения AuNP-antiBSA. Калибровочные кривые были подогнаны по y =2,43 + 0,25 × (коэффициент корреляции, R ² =0,91) для пика поглощения 540 нм и y =2,56 + 0,31 × (коэффициент корреляции, R ² =0,96) для пика поглощения 760 нм, где x - концентрация antiBSA и y оптическое поглощение.

Анализ спектров поглощения в УФ-видимой области для AuNP с реакцией взаимодействия с анти-BSA. а Спектры поглощения НП AuNP, b BSA, связанная с GO, c Зонд AuNP-анти-BSA и d Калибровочные кривые для AuNP с ответом на взаимодействие с анти-BSA при разбавлении различных концентраций белка анти-BSA от 1,45 нМ до 145 фМ

Анализ AuNP-antiBSA и AuNP-GO-antiBSA на основе взаимодействий иммуноанализа

Чтобы понять механизм иммунологического обнаружения нанокомпозитов GO и AuNP-GO, был проведен спектральный анализ реакций связывания, как показано на рис. 6. На рис. 6a показаны спектры поглощения нанокомпозитов AuNP-GO и GO-BSA в УФ-видимой области. Для раствора листа GO (0,1 г / л) был пик около 230 нм [70] и плечо около 300 нм, а конъюгаты GO-BSA показали пик поглощения около 270 нм и пик около 230 нм [9, 20, 70] . В комбинации нанокомпозитов AuNP-GO были отмечены три пика поглощения при 230, 300 и 540 нм соответственно. Π – π-стэкинг или ковалентные связывающие взаимодействия между AuNP и поверхностью листа GO были основной движущей силой, закрепляющей AuNP на высоко биосовместимых материалах GO. Листы GO были объединены в AuNP, что привело к сильной полосе поглощения 200–300 нм. Следовательно, поглощение листов GO было намного больше, чем поглощение AuNP в видимом диапазоне света. Рисунок 6b показывает, что УФ-видимые спектры пика поглощения AuNP находятся при 540 нм [50, 68, 69]. Пики поглощения приходились на 540 и 660 нм для конъюгатов AuNP + Cys; 230, 300, 540 и 660 нм для конъюгатов AuNP + Cys + GO; и 230, 270, 540 и 660 нм для конъюгатов AuNP + Cys + GO + антиБСА. Листы GO имели два пика поглощения при 230 нм (пик плазмона π – π *) и 300 нм (пик плазмона n – π *). Был отмечен сдвиг в длине волны поглощения, и этот сдвиг абсорбции рассматривался как свидетельство подтверждения поглощения анти-BSA (0 фМ ~ 1,45 нМ) на поверхности AuNP + Cys + GO. На рис. 6c показан синтез раствора зонда AuNP + Cys + GO + antiBSA (образец B2), как на рис. 2b. Увеличение концентрации анти-BSA было относительно высоким при 540 нм. На рис. 6с показаны различные концентрации поглощения интенсивности света, а пик поглощения AuNP при 60 нм наблюдался при 540 нм. Увеличение концентрации анти-BSA было относительно высоким при 540 нм. Этот результат показал, что AuNP-GO может усиливать характеристики поглощения плазмонов при 540 нм, когда концентрация анти-BSA повышается. Кроме того, в эксперименте по иммуноанализу мы смешали мишень GO-BSA (1,52 мкМ) (образец A) и зонд AuNP + Cys + GO + antiBSA, как показано на фиг. 6d. В дополнение к характеристикам гидрофобного и π – π взаимодействия листов GO, ковалентные связи между белками и карбоксильными группами на листах GO также поддерживают поверхностную адгезию. Этот результат, вероятно, был связан с гибридной структурой AuNP + GO-antiBSA, которая формировала стабильный иммунный ответ с другими белками на GO-BSA. Длины волн имели очевидный пик поглощения при 260 нм. В дополнение к характеристикам гидрофобного и π – π (π – π * плазмонный пик) характеристик взаимодействия листов GO, ковалентные связи между белками и карбоксильными группами на листах GO также способствовали поверхностной адгезии. До и после связывания БСА и анти-БСА значения пиков плазмонов π – π * ГО (230 и 270 нм) были значительно смещены, что доказывает, что БСА и анти-БСА связаны положительно.

Анализ спектров поглощения УФ-видимой области для иммунного ответа. а GO с привязкой к AuNP и BSA с привязкой к GO, b AuNP и GO-связанные анти-BSA, c Зонд AuNP-GO-antiBSA и d Зонд AuNP-GO-antiBSA и мишень GO-BSA для иммунного ответа

Рисунок 7 показывает, что эти результаты хорошо согласуются с калибровочными кривыми. Детальный анализ приведенных выше экспериментальных результатов (рис. 6c, d) показал, что сенсорные реакции на соответствующие средние неточности поглощения были 1,3487, 1,1776, 1,0698, 0,8755 и 0,8588 (рис. 7a) и 0,9226, 0,8535, 0,7649, 0,7243. и 0,695 (фиг. 7b), что соответствует концентрациям белка 1,45, 145, 14,5, 1,45 и 145 фМ соответственно. На рисунке 7a показано, что линейная регрессия калибровочных кривых была f (x) =0,918 + 0,124 × (коэффициент корреляции, R ² =0,94) для зонда AuNP-GO с взаимодействиями с антиБСА, где x - концентрация белка и y - оптическое поглощение. Кроме того, рис. 7b показывает, что уравнение линейной регрессии подобранной кривой было f (x) =0,791 + 0,057 × (коэффициент корреляции, R ² =0,954) для GO и AuNP-GO на основе иммуноанализа.

Сравнение калибровочных кривых сенсорных ответов, полученных при различных концентрациях белка. а Калибровочные кривые для зонда AuNP-GO с взаимодействиями с анти-BSA. б Калибровочные кривые для GO и GO-AuNP на основе иммуноанализа

Во время количественного эксперимента мы добавляли фиксированную концентрацию 10 нг / мл белка хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), чтобы действовать как мешающий фактор. Результаты показали, что фиксированный белок-мешающий ХГЧ на калибровочных кривых иммуноанализа соответствует f (x) =0,843 + 0,113 × (коэффициент корреляции, R ² =0,89) для зонда AuNP-GO с взаимодействиями с анти-BSA (рис. 7a) и f (x) =0,722 + 0,051 × (коэффициент корреляции, R ² =0,73) для GO и AuNP-GO на основе иммуноанализа (рис. 7b).

Кроме того, наши экспериментальные результаты показали, что стратегия обнаружения допускает регенерацию поверхности без потери специфичности (четыре регенерации) и что ее также можно использовать для обнаружения белка антиБСА с динамическими ответами в диапазоне от 1,45 нМ, 145 пМ, 14,5 пМ, 1,45 пМ , 145 фМ и 0 фМ. Результаты показали, что при пониженной концентрации анти-BSA (с 1,45 нМ до 145 фМ) и даже без присутствия анти-BSA (0 фМ) интенсивность спектрального поглощения не изменяла минимальный уровень количественного определения. The hCG protein interfered with the antibody recognition in the immunoassay to a limited extent, possibly due to non-specific adsorption. This implies a very low cross-reactivity of the hCG protein and non-specific interactions at a low adsorption. In the practical quantitative analysis with immunoassays, a LOD of 145 fM for antiBSA was achieved in both buffer and interference protein samples.

Выводы

We successfully demonstrated a GO-bound AuNP biocompatible nanocomposite in a biosensing mechanism in a rapid and label-free immunoassay for biomolecule interactions. The results showed that the AuNP-GO nanocomposite was biocompatible and exhibited LSPR extinction to biomolecules, which could promote the absorption spectra characteristic peaks, accelerate the reaction of molecules, and enhance the stability of chemical covalent bonds during immobilization. For the detection of antiBSA protein, the limit of detection of the GO and AuNP-GO based on the immunoassay was as low as 145 fM. Among the AuNP-GO biosensors, GO immobilized in the AuNP-GO nanocomposite showed the highest bioaffinity, with good sensitivity, low detection limit, and fast response toward the protein immunoassay. The results of our experiments showed that a fixed concentration 10 ng/ml of hCG protein as an interferer did not affect the test response. Given the growing trend of applying biosensors in POCT, LSPR for AuNP-GO nanocomposite technology is a highly promising and versatile tool for use in immunoassays. Combining the properties of AuNPs and GO sheets to develop new nanocomposites for the synthesis of smart materials shows promise for the development of user-friendly diagnosis applications. In the future, AuNP-GO nanocomposites may be used in innovative immunoassays, rapid detection reagents, and miniaturization, which may in turn make LSPR technology an irreplaceable tool for routine clinical analysis and POCT diagnostics.

Сокращения

Ag:

Silver

AntiBSA:

Bovine serum albumin antibody

Au:

Gold

AuNP:

Gold nanoparticle

BSA:

Bovine serum albumin

Cys:

Cystamine

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

FEG-TEM:

Field-emission gun transmission electron microscope

FTIR:

Fourier-transform infrared spectrometer

GO:

Graphene oxide sheet

HR-TEM:

Просвечивающий электронный микроскоп высокого разрешения

LOD:

Limit of detection

LSPR:

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс

MOA:

8-Mercaptooctanoic acid

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

Pd:

Palladium

POCT:

Point-of-care testing

Pt:

Platinum

RGO:

Reduction graphene oxide

SAM:

Самособирающиеся монослои

SERS:

Рамановское рассеяние света с усилением поверхности

UV-vis:

Ultraviolet-visible

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

ZnO:

Zinc oxide