Конъюгированные с антителами золотые наностержни, модифицированные кремнеземом, для диагностики и фототермической терапии Cryptococcus neoformans:эксперимент in vitro

Фон

Cryptococcus neoformans представляет собой инкапсулированные дрожжи, которые впервые были описаны Буссом в 1894 году [1]. Заражение инкапсулированными дрожжами Cryptococcus neoformans может привести к безвредной колонизации дыхательных путей, но также может привести к менингиту или диссеминированному заболеванию [2], особенно у людей с дефектным клеточным иммунитетом. Криптококкоз представляет собой серьезную опасную для жизни грибковую инфекцию у пациентов с тяжелой ВИЧ-инфекцией, а также может осложнять трансплантацию органов, ретикулоэндотелиальную злокачественную опухоль, лечение кортикостероидами или саркоидоз [3]. Криптококковый менингит, связанный с ВИЧ-инфекцией, является причиной более 600 000 смертей в год во всем мире [4]. Криптококковый менингит и диссеминированное заболевание неизменно приводили к летальному исходу. В 1995 г. Speed ​​and Dunt сообщили о 14% -ной смертности среди пациентов с криптококковой болезнью, получавших амфотерицин B плюс флуцитозин [5]. Обследование пациентов с подозрением на криптококкоз зависело от грибковой культуры. Однако до сих пор не существует быстрого и эффективного решения для диагностики или лечения C. neoformans заражение на ранней стадии. Кроме того, большинство пациентов с криптококковой инфекцией не получают своевременного лечения, что приводит к высокому уровню смертности.

Среди всех методов визуализации рентгеновская компьютерная томография (КТ) является одним из наиболее полезных диагностических инструментов в больницах с точки зрения доступности, эффективности и стоимости [6]. КТ способна идентифицировать анатомические паттерны и предоставлять дополнительную анатомическую информацию, включая расположение, размер и распространение опухоли на эндогенном контрасте [7]. Одним из распространенных проявлений легочного криптококкоза является наличие единичных или множественных легочных узелков или новообразований, кавитации или паренхиматозных аномалий. Эти проявления четко выявляются при компьютерной томографии (КТ) [8]. С помощью рентгенографии можно определить следующие признаки криптококкового менингита обычно представлены:расширенные пространства Вирхова-Робена, усиление менингеальной оболочки, выступающая хориоидальная трещина и кисты парагиппокампа [9]. Однако ранний криптококкоз не может быть обнаружен с помощью рентгенологического исследования. То есть мы не можем провести своевременное лечение на ранней стадии. Недавно достигнутые успехи в управлении формой / морфологией поверхности золотых наноматериалов продемонстрировали огромную способность создавать их локализованный поверхностный плазмонный резонанс [10, 11]. Здесь мы исследовали своего рода наноразмерный золотой материал, называемый золотыми наностержнями (GNR), который может выборочно соединяться с грибами. В клинической КТ-визуализации йодсодержащие соединения являются наиболее часто используемыми контрастными веществами. Однако атомный номер и электронная плотность золота намного выше, чем у йода. Золото может вызывать сильное ослабление рентгеновских лучей, что делает его идеальным кандидатом в контрастные вещества для КТ [7]. Конъюгируя GNR со специфическими антителами, ученые потенциально могут нацеливаться и получать изображения от определенных тканей и патогенов [12].

Амфотерицин B является основным терапевтическим средством для лечения криптококковой инфекции, которое используется с конца 1960-х годов [13]. Однако клиническая эффективность амфотерицина B ограничена, и он проявляет значительную нефротоксичность [14]. Эффективность настоящих препаратов снижается из-за токсичности, лекарственной устойчивости или недостаточного диапазона активности [15, 16]. Итак, необходимо разработать новые селективные терапевтические методы лечения криптококковой инфекции. В последнее время для нацеливания и уничтожения раковых клеток, вирусов и бактерий широко используются фототермические процедуры [17,18,19]. По сравнению с традиционными терапевтическими схемами механизм действия таких лечебных средств совершенно иной. Лазерный свет ближнего инфракрасного диапазона (NIR) - идеальный метод фототермической обработки, который может поглощаться тканями или материалами. Свет может эффективно проникать через ткани с минимальным повреждением нормальных тканей [20]. GNR поглощают свет в ближнем ИК-диапазоне (650–900 нм), и поглощенная световая энергия может быть преобразована в тепловую. Основанный на этом принципе, это идеальный метод сочетания лазерного излучения NIR и GNR для лечения. По сравнению с классическими фотосенсибилизаторами, GNR имеют несколько преимуществ:высокое поперечное сечение поглощения, высокую растворимость, отличную биологическую совместимость, гипотоксичность, большую светостойкость и легкую конъюгацию с молекулами-мишенями [21]. В нескольких отчетах описано, как использовать GNR для фототермической обработки [22,23,24]. Карпин провел эксперимент на клетках рака груди, которые сверхэкспрессировали ген HER2, и были инкубированы с анти-HER2-конъюгированными нанооболочками кремнезема и золота. Затем комплексы облучали БИК-излучением с длиной волны 808 нм. По сравнению с контрольной группой клетки были разрушены [17]. Ван сообщил, что GNR, конъюгированные с антителами, могут выбирать мишень и уничтожать патогенные сальмонеллы бактерии при воздействии БИК-излучения. Существенно снизилось количество сальмонеллы . жизнеспособность клеток [19].

Здесь мы использовали конъюгированные с антителами золотые наностержни, модифицированные диоксидом кремния, для специфического связывания C. neoformans клетки. Кроме того, клетки, связывающиеся с комплексами, можно легко различить на КТ-изображениях. Эти золотые наночастицы были связаны с C. neoformans клетки посредством иммунной конъюгации и фототермического лизиса вызвали значительное снижение жизнеспособности клеток. Наше исследование подтвердило совершенно новый вариант диагностики и фототермической терапии C. neoformans in vitro и дает возможность безопасно и эффективно лечить криптококкоз.

Методы

Материалы

Анти- C. neoformans антитело было приобретено у Meridian Life Science (Мемфис, Теннесси, США). Хлорозавровая кислота (HAuCl ₄ · 3H ₂ O) был получен от Sigma (Сент-Луис, Миссури, США). Нитрат серебра (AgNO ₃ ), тетраэтилортосиликат (TEOS), 3-аминопропилтриметоксисилан (APTS), бромид цетилтриметиламмония (CTAB), боргидрид натрия (NaBH ₄ ), 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC), поли (4-стиролсульфонат натрия) (PSS) и аскорбиновую кислоту были получены от J&K Chemical Limited (Китай). Все вышеперечисленные химические вещества использовали без дополнительной очистки. Во всех препаратах использовалась деионизированная вода (марка Millipore Milli-Q) с удельным сопротивлением 18,2 МОм · см.

Синтез золотых наностержней, конъюгированных с антителами и модифицированными диоксидом кремния

В типичном эксперименте GNR были синтезированы в соответствии с протоколом, опосредованным семенами, с использованием матрицы [25,26,27]. Синтетический путь создания конъюгированных с антителами наностержней золота, модифицированного диоксидом кремния (GNR-SiO ₂ -Ab) проиллюстрировано на фиг. 1. Двадцать пять миллилитров раствора GNR центрифугировали при 12000 об / мин в течение 15 мин. Супернатант, содержащий в основном молекулы CTAB, удаляли, и осадок ресуспендировали в 20 мл безводного этанола, доведенном до pH 10 с помощью 20 мкл 28% аммиака. После обработки системы ультразвуком добавляли 5 мл (10 мМ) TEOS, а затем всю систему интенсивно перемешивали в течение 24 часов. ЗНР, покрытые диоксидом кремния, собирали центрифугированием при 4000 об / мин в течение 30 мин и промывали трижды водой и дважды этанолом. Полученный очищенный GNR-SiO ₂ образцы повторно диспергировали в 10 мл этанола для дальнейшего эксперимента [28]. Затем добавляли 10 мл APTS для образования смешанного раствора и оставляли реагировать при кипячении с обратным холодильником при 60 ° C в течение 1 часа. Полученный продукт промывали деионизированной водой пять раз и сушили при 60 ° C в течение 3 часов в вакуумной печи для получения GNR-SiO ₂ -NH ₂ . Полученный продукт был дополнительно покрыт полимером (PSS) послойной техникой, обеспечивающей доступные аминогруппы для растворителя [29]. Этим наностержням с концевыми аминогруппами давали возможность взаимодействовать с карбоновой кислотой очищенных антител в течение 12–16 часов в присутствии EDC, водорастворимого карбодиимида, который способствует образованию амидной связи между карбоновой кислотой и первичным амином [30]. После инкубации комплексы наностержня-антитело очищали центрифугированием и ресуспендировали в PBS [31].

Синтетическая процедура GNR-SiO ₂ -Аб

Характеристика GNR-SiO ₂ -Ab

Размер и морфология GNR и GNR-SiO ₂ -Ab были охарактеризованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ; Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, США), работающей при ускоряющем напряжении 120 кВ [20]. УФ-видимые спектры измеряли при 20 ° C с помощью УФ-видимого спектрофотометра (Shimadzu UV-2450, Shimadzu, Япония), снабженного 10-миллиметровой кварцевой кюветой, где длина пути света составляла 1 см. Сканировали длину волны от 200 до 1000 нм, так как она включает пики поглощения GNR, анти- C. neoformans антитело и GNR-SiO ₂ -Аб. GNR-SiO ₂ -Ab инкубировали при 4 ° C в течение 2 и 4 недель. Длина волны от 200 до 1000 нм сканировалась в двух временных точках.

Единицы Хаунсфилда GNR-SiO ₂ -Ab Измерение

Водный раствор GNR-SiO ₂ -Ab с различной концентрацией в диапазоне 0,04–4 мг / мл определяли непосредственно с помощью компьютерного томографа Philips Brilliance 64 (Philips Healthcare, Best, Нидерланды). Значения затухания были получены с помощью программного обеспечения компьютерной томографии.

Вложение C. neoformans к GNR-SiO ₂ -Ab

C.neoformans Штамм типа A H99 был получен из Шанхайской ключевой лаборатории молекулярной медицинской микологии (Шанхайская больница Чангжэн, Второй военно-медицинский университет, Шанхай, Китай). Грибкам позволяли инкубироваться с GNR и комплексами антитело-наностержень в течение 1 часа перед подготовкой к анализу TEM. Изображения были получены на приборе ТЕМ (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, США), работающем при ускоряющем напряжении 120 кВ.

КТ-сканирование in vitro комплексов грибок-антитело-наностержень

Материалы и грибы были разделены на три группы, которые включают группу грибов (N), GPR-SiO ₂ -Ab группа (G) и GPR-SiO ₂ -Ab-прилагается C. neoformans группа (G + N). Концентрация GNR-SiO ₂ -Ab водный раствор, указанный выше, составлял 4 мг / мл. Для получения изображений КТ in vitro растворы трех групп готовили в стерильных пробирках Ер объемом 1,5 мл. Все компьютерные томограммы были выполнены с использованием указанной выше системы КТ.

Эффекты фототермической терапии in vitro

К. neoformans клетки, инкубированные с и без GNR-SiO ₂ -Ab подвергали облучению лазером NIR (LWIRL 808, Laserwave Ltd., Китай) в течение 5 мин с длиной волны 808 нм и интенсивностью 30 мВт (4 Вт / см ² ). Изображения были получены на приборе ТЕМ (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, США), работающем при ускоряющем напряжении 120 кВ. После облучения клетки инкубировали 2 ч при 37 ° C в темноте. К. neoformans клетки, инкубированные с и без GNR-SiO ₂ -Ab были созданы как контрольные группы. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США) в соответствии с инструкциями производителя [28]. Этот конкретный анализ жизнеспособности клеток был гомогенным методом, который мог определить количество жизнеспособных клеток. Катализируемая люциферазой реакция между люциферином и АТФ была использована для синтеза метаболически активных клеток. Все эксперименты были повторены шесть раз, и были определены их средние значения.

Статистический анализ

Все анализы были выполнены с использованием SPSS версии 13.0 (SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение. P значение менее 0,05 было принято для обозначения статистической значимости. Все цифры, приведенные в этой статье, были получены в результате более чем трех независимых экспериментов с аналогичными результатами.

Результаты

Синтез и характеристика GNR-SiO ₂ -Ab

Ранее сообщалось о способе получения покрытых диоксидом кремния GNR с TEOS в качестве источника диоксида кремния и APTS в качестве связующего агента [30]. Форма и размер GPR не изменились, когда они были конъюгированы с анти- C. neoformans . На рисунке 2 показано ПЭМ изображение GNR-SiO ₂ . -Аб. Эти наночастицы имеют ширину 18,48 ± 2,39 нм и длину 57,56 ± 4,57 нм.

а , b ПЭМ изображение GNR-SiO ₂ -Аб. Наностержни имели стержневидный вид. Форма и размер GPR не изменились, когда они были конъюгированы с анти- C. neoformans

Спектроскопические свойства и стабильность GNR-SiO ₂ -Ab

Относительно фотофизических свойств GNR-SiO ₂ -Ab, на рис. 3 показаны спектры поглощения GNR-SiO ₂ . , GNR-SiO ₂ -Ab и анти- C. neoformans антитело. Спектр GNR-SiO ₂ показывает, что GNR-SiO ₂ имеет две полосы поглощения:слабую длину волны поперечного резонанса поверхностного плазмона (TSPRW) около 520 нм и длину волны сильного продольного резонанса поверхностного плазмона (LSPRW) около 808 нм. После конъюгирования с антителами TSPRW и LSPRW GNR-SiO ₂ -Ab составляют 540 и 835 нм соответственно. При сравнении спектра антитела и GNR-SiO2-Ab, оба они имеют один и тот же специальный пик около 280 нм. Этот результат доказывает, что анти- C. neoformans антитело было успешно конъюгировано с GNR-SiO ₂ . После инкубации при 4 ° C в течение 2 недель TSPRW и LSPRW GNR-SiO ₂ -Ab составляют 540 и 835 нм соответственно. И такие же данные наблюдались через 4 недели. TSPRW и LSPRW GNR-SiO ₂ -Ab не изменилось после инкубации в течение 4 недель. Это подтвердило стабильность GNR-SiO ₂ -Аб.

Спектры поглощения:GNR + SiO ₂ + Ab (A), GNR + SiO ₂ (B) и анти- C. neoformans антитело (С). GNR-SiO ₂ имеет две полосы поглощения:слабую длину волны поперечного резонанса поверхностного плазмона (TSPRW) около 520 нм и длину волны сильного продольного резонанса поверхностного плазмона (LSPRW) около 808 нм. После конъюгирования с антителами TSPRW и LSPRW GNR-SiO ₂ -Ab составляют 540 и 835 нм соответственно

Единицы Хаунсфилда GNR-SiO ₂ -Ab Измерение

Единицы Хаунсфилда (Hu) GNR-SiO ₂ -Ab по оценке клинической КТ. На рисунке 4 представлены изображения КТ в диапазоне 0,04–4 мг / мл GNR-SiO ₂ . -Аб. Поскольку концентрация GNR-SiO ₂ -Ab увеличивается, интенсивность CT-сигнала непрерывно увеличивается. Как показано на рис. 3, Hu как функция GNR-SiO ₂ -Концентрация Ab показывает хорошо коррелированную линейную зависимость ( R ² =0,9903), описываемого следующим типичным уравнением: y =12,52 x + 11.971. Эти результаты предполагают, что GNR-SiO ₂ -Ab имеет потенциальное применение в качестве контрастного вещества для положительных рентгеновских / КТ-изображений.

Агрегаты Хаунсфилда GNR-SiO ₂ -Аб. а КТ изображения GNR-SiO ₂ in vitro -Ab приостановлено в PBS. Концентрация (мг / мл) в каждом образце указана вверху соответствующего изображения. б График затухания CT GNR-SiO ₂ -Ab в различных концентрациях от 0,04 до 4 мг / мл

Вложение C. neoformans Ячейки к GNR-SiO ₂ -Ab

ПЭМ-изображения показывают морфологические особенности C. neoformans клетки и комплексы грибок-антитело-наностержень. Эти клетки имеют диаметр от 2 до 20 мкм. На рисунке 5a показано изображение C, полученное методом просвечивающего электронного микроскопа. neoformans клетки, которые окружены полисахаридной капсулой. Эти клетки имели диаметр 4–6 мкм без связывания каких-либо структур. Как показано на фиг. 5b, C. neoformans ячейки покрыты множеством агрегированных GNR-SiO ₂ -Ab после инкубации с комплексами антитело-наностержень. Мы инкубировали клетки грибов с GNR-SiO ₂ чтобы выяснить, действительно ли GNR-SiO ₂ был прикреплен к C. neoformans. Наши результаты показали, что GNR-SiO ₂ были разбросаны, как показано на рис. 5в. Наше исследование показывает, что C. neoformans клетки могут конъюгировать с GNR-SiO ₂ -Ab выборочно.

Изображения ПЭМ иллюстрируют взаимодействие между GNR-SiO ₂ -Ab и C. neoformans клетки. а ТЕМ изображение C. neoformans клетки. б ПЭМ-изображение комплексов грибок-антитело-наностержень. c ТЕМ изображение C. neoformans клетки, инкубированные с GNR-SiO ₂

КТ-сканирование in vitro комплексов грибок-антитело-наностержень

Мы провели количественный анализ интенсивности КТ-сигнала с помощью стандартной программы дисплея производителя (портал Philips, Philips Healthcare, Best, Нидерланды). На рисунке 6 показаны значения ослабления рентгеновских лучей для трех групп. Значения группы G + N были значительно выше, чем у групп G и N. Кроме того, значения ослабления рентгеновского излучения в группе G были значительно выше, чем в группе N. Этот результат согласуется с выводами предыдущей литературы [31].

а , b КТ in vitro разных групп. Значения группы G + N были значительно выше, чем у групп G и N. Кроме того, значения ослабления рентгеновского излучения в группе G были значительно выше, чем в группе N

Эффекты фототермической терапии in vitro

Мы оценили жизнеспособность клеток, выполнив анализ жизнеспособности клеток на люминесцентном приборе CellTiter-Glo®. Клетки без облучения имели большую жизнеспособность, чем клетки, облученные БИК ( P <0,05). Более того, жизнеспособность грибов была выше, чем у клеток, соединенных с GNR-SiO ₂ -Ab после облучения БИК ( P <0,05). Кроме того, клетки имели более высокую жизнеспособность, чем комплексы грибок-антитело-наностержень ( P <0,05). Рисунок 7 ясно иллюстрирует изменение жизнеспособности C. neoformans клетки с разными методами лечения. После облучения C. neoformans клетки получили фототермические повреждения, и нормальная структура клеток была разрушена. Как показано на рис. 8, клетки имели атрофический, нерегулярный и сплющенный вид. Повреждена характерная полисахаридная капсула.

Жизнеспособность клеток, обработанных по-разному. Клетки без облучения имели большую жизнеспособность, чем клетки, облученные БИК ( P <0,05). Более того, жизнеспособность грибов была выше, чем у клеток, конъюнктированных с GNR-SiO ₂ -Ab после облучения БИК ( P <0,05). Кроме того, клетки имели более высокую жизнеспособность, чем комплексы грибок-антитело-наностержень ( P <0,05)

а , b ПЭМ-изображения демонстрируют фототермические повреждения C. neoformans клетки, которые были соединены с GNR-SiO ₂ -Аб. Клетки имели атрофический, неправильный вид и вид разрушенных. Повреждена характерная полисахаридная капсула

Обсуждение

Кремнезем имеет множество преимуществ перед полимером [32]. Используемые подготовительные процессы довольно просты, и толщину кремнеземной оболочки можно довести до желаемого размера и пористости. Кроме того, диоксид кремния чрезвычайно стабилен и обладает биосовместимостью, не имеет набухания или изменения пористости при изменении pH и неуязвим для микробной атаки. Кроме того, диоксид кремния легко модифицируется с помощью различных функциональных групп с использованием химии силана и коммерчески доступных кремнийорганических реагентов для биотрансляции. GNR с покрытием из диоксида кремния сохраняют превосходные оптические свойства GNR и могут улучшить их термическую стабильность при облучении высокой энергией. В нашем исследовании после покрытия диоксидом кремния и конъюгирования с анти- C. neoformans антитела, оба GNR показали красное смещение пика поверхностного плазмонного резонанса из-за увеличения показателя преломления окружающей среды [32, 33]. Результаты также показали, что размер образца становится все больше и больше после модификации и конъюгации. Эти данные показали, что мы успешно конъюгировали наночастицы золота с анти- C. neoformans антитело. Однако мы не можем исключить возможность того, что GNR-SiO ₂ рана обладает особой способностью конъюгировать клетки после связывания с антителами, и в будущем мы проведем дальнейшие исследования. В этом исследовании мы успешно прикрепили GNR-SiO ₂ -Ab к клеточной капсуле посредством простой реакции антиген-антитело. Кроме того, мы успешно обеспечили нацеливание наших комплексов на антигены на клеточную капсулу.

В последнее десятилетие GNR привлекли к себе всеобщее внимание. Hainfeld et al. [34] впервые сообщили, что ЗНР можно использовать в качестве рентгеноконтрастного агента. GNR дает несколько преимуществ по сравнению с йодированными молекулами, условным контрастным агентом. Из-за высокого атомного номера и электронной плотности GNR демонстрируют относительно высокий коэффициент ослабления рентгеновских лучей. Атомный номер и электронная плотность золота (79 и 19,32 г / см ³ соответственно) выше, чем у йода (53 и 4,9 г / см ³ ) [7]. Йод как рентгеноконтрастное средство имеет множество серьезных побочных эффектов, таких как нефротоксичность и тяжелые аллергические реакции. Однако ЗНЛ сохраняются в организме намного дольше, чем йодные контрастные вещества, а это означает, что у них есть достаточно времени для наблюдения за изображениями. Кроме того, GNR могут нацеливаться на раковые клетки, вирусы и бактерии посредством функционализации поверхности с помощью различных молекул, таких как пептиды или антитела. Reuveni et al. [31] показали, что к поверхности ЗНЛ могут быть прикреплены несколько различных типов молекул. В этом исследовании интенсивность CT-сигнала непрерывно увеличивалась вместе с увеличением концентрации GNR-SiO ₂ -Ab, что приводит к более ярким изображениям. GNR-SiO ₂ -Ab продемонстрировал значительный положительный потенциал в качестве контрастных агентов для рентгеновских / КТ-изображений, а также в качестве GNR. Поглощение рентгеновских лучей золотыми наностержнями осталось неизменным даже при модификации поверхности. Эти данные показывают, что свойства ослабления рентгеновских лучей GNR-SiO ₂ -Ab не претерпела значительных изменений в результате модификации поверхности. Это согласуется с выводами, опубликованными в предыдущей литературе [35,36,37]. Функционализация поверхности - это мощный инструмент, который обеспечивает пассивное или активное нацеливание GNR на конкретный интересующий сайт. В нашем исследовании мы успешно прикрепили GNR-SiO ₂ -Ab к капсулам C. neoformans . Кроме того, мы определили, можно ли использовать эти конъюгированные с антителами частицы в качестве нанозондов при проведении целевой компьютерной томографии C. neoformans клетки in vitro. Мы заметили, что изображения КТ C. neoformans клетки, диспергированные в PBS, выглядели очень похожими на изображения, полученные из C. neoformans клетки диспергированы в воде. Однако отличить изображения грибов от мягких тканей сложно. Антитело может вызывать гораздо большую агрегацию GNR за счет связывания с поверхностью C. neoformans ячеек, что приводит к гораздо более высоким значениям затухания, чем когда-либо. Таким образом, мы можем успешно добиться заметного ослабления грибков в рентгеновских лучах. По нашим результатам, обнаружение C. neoformans с помощью компьютерной томографии может быть достигнута и открывает новые возможности в диагностике.

ЗНР широко применялись для фототермической терапии опухолей [22, 38, 39]. Наше исследование показывает, что GNR-SiO ₂ -Ab может быть выборочным инструментом для уничтожения C. neoformans клетки. Наши результаты подтвердили, что клеточная мембрана C. neoformans клетки подверглись непоправимому и тяжелому разрушению после облучения БИК. Кроме того, жизнеспособность клеток значительно снизилась по сравнению с необработанными клетками. Эти результаты показали, что одно только БИК-излучение вызывает смерть C. neoformans клетки. Однако жизнеспособность клеток, инкубированных с GNR-SiO ₂ -Аб тоже был в депрессии. В клетках, инкубированных с GNR-SiO ₂ -Ab и подвергнутые NIR-облучению, жизнеспособность клеток значительно снизилась по сравнению с другими группами. Мы убеждаемся, что GNR-SiO ₂ -Ab избирательно конъюгировано с грибами и улучшает эффекты NIR-излучения. GNR-SiO ₂ -Ab обладает способностью селективного воздействия фототермической терапии на C. neoformans клетки. О механизме эффекта ранее не сообщалось. Мы предполагаем, что разрушение клеточной мембраны, вероятно, было вызвано гибелью клеток, вызванной облучением. Norman et al. [18] сообщили, что жизнеспособность Pseudomonas aeruginosa значительно уменьшилось, когда этот вид подвергался облучению и связывался с золотыми наностержнями, которые были ковалентно конъюгированы со специфическими антителами. Эти клетки также показали участки сильно поврежденной клеточной мембраны с непоправимым повреждением, которое было вызвано воздействием БИК-излучения. Когда наночастицы подвергались БИК-излучению, клеточная мембрана была повреждена из-за нескольких факторов, включая взрыв наночастиц, ударные волны, образование пузырьков и термическое разрушение [40].

В этом исследовании смерть или снижение активности C. neoformans клетки возникли, когда клеточная мембрана была разрушена и разрушена тепловой энергией. Однако для подтверждения этой гипотезы необходимо провести дальнейшие исследования. К. neoformans клетки повреждаются следующими факторами:локальным повышением температуры, взрывом наночастиц, ударными волнами, образованием пузырьков и термическим распадом, вызванным БИК-излучением. В частности, С. neoformans клетки были существенно повреждены при воздействии только БИК-излучения. Есть две возможные причины, объясняющие, как нацелен GNR-SiO ₂ -Ab стимулирует NIR-излучение, вызывая фототермическое разрушение C. neoformans клетки. Одна из возможностей заключается в том, что в капсуле C. neoformans клетки, целевой GNR-SiO ₂ -Ab вызывает локальное повышение температуры. Вторая возможность заключается в том, что из-за реакции антиген-антитело между GNR-SiO ₂ -Ab и капсула C. neoformans клетки, происходят структурные изменения клеточной стенки и капсулы. Благодаря таким изменениям клетки будут более чувствительны к фототермической обработке [41]. Предыдущие исследования подтвердили низкую токсичность золотых наностержней [22, 42, 43], и потребуются дальнейшие исследования для изучения эффекта фототермической терапии in vivo. Самым прискорбным из нашего исследования является то, что мы не обсуждали нагрузочную способность GNR-SiO ₂ -Аб. Дальнейшие исследования будут сосредоточены на взаимосвязи между нагрузочной способностью GNR-SiO ₂ -Аб и фототермический эффект.

Выводы

Мы успешно изготовили GNR-SiO ₂ -Ab, который был нацелен на C. neoformans клетки. Эти золотые наностержни, конъюгированные со специфическими антителами, усиливали ослабление рентгеновских лучей C. neoformans клетки на КТ-изображениях. Наши результаты показали, что иммунные GNR, которые опосредованы антителами, увеличивают эффекты NIR-индуцированной фототермической терапии в C. neoformans клетки. Кроме того, GNR-SiO ₂ -Ab допускает простые манипуляции и минимально инвазивные процедуры при диагностике и лечении C. neoformans инфекции, уделяя особое внимание потенциальному клиническому применению этого подхода.