Исследование физико-химических характеристик системы на основе нанолипосом для двойной доставки лекарств

Фон

Неизлечимые виды рака, такие как тройной отрицательный рак молочной железы, имеют ограничения для лечения стандартными методами лечения из-за реакции на повреждение ДНК, тесно связанной с различными сигнальными сетями [1,2,3]. Терапевтические стратегии, повышающие исходную химиочувствительность таких устойчивых опухолей, были изучены с целью преодоления ограничений [4, 5]. Недавнее исследование подавления онкогенных сигнальных путей при использовании агента повреждения ДНК является одной из комбинаторных терапевтических стратегий [6,7,8]. Исследование показало, что предварительная обработка резистентных раковых клеток ингибитором фактора роста синергизирует их апоптотический ответ на генотоксический препарат [9, 10]. Существует очень важная клиническая потребность в терапевтических стратегиях, направленных на нацеливание на несколько путей выживания, специфичных для раковых клеток, для увеличения степени уничтожения опухолевых клеток и потенциального снижения общего воздействия лекарств во время лечения [11, 12]. Между тем, для того, чтобы воплотить в клинике синергетические эффекты двух видов лекарств in vitro, необходима система доставки, которая может доставлять оба лекарства и высвобождать их с разницей во времени из-за разницы между фармакокинетическими (ФК) свойствами лекарственного средства. лекарства и сложность нацеливания на одни и те же раковые клетки в правильной временной последовательности [13,14,15,16].

Система доставки с нанолипосомами - одна из двойных систем доставки лекарств, которая может применяться в комбинированной терапии. Основными компонентами липосом в целом являются фосфолипиды, аналогичные компонентам клеточных мембран. Фосфолипиды образуют двухслойную концентрическую сферу с внутренним отсеком и двухслойными мембранами [17]. Нанолипосомы могут позволить лекарствам, имеющим разные физико-химические свойства, загружаться во внутренний отсек и двухслойную мембрану липосом, а затем доставлять их к поражению. Таким образом, in vivo синергетический эффект двух лекарств, доставляемых с использованием нанолипосомной системы, может быть достигнут за счет улучшенной совместной локализации лекарств в раковых клетках не только за счет согласования ФК-свойств каждого лекарства, но также за счет так называемой повышенной проницаемости и удерживания ( ЭПР) влияние опухолевой ткани. Помимо инкапсуляции лекарств во внутреннем компартменте, нанолипосомы могут солюбилизировать гидрофобные лекарства, повышать их стабильность, модулировать их свойства кровообращения и, следовательно, вызывать их накопление в опухолевых тканях [18].

Несмотря на недавние исследования систем доставки комбинированной химиотерапии на основе нанолипосом, процессы приготовления систем должны быть оптимизированы для надежного и воспроизводимого производства, а их физико-химические характеристики должны быть выяснены для разработки более совершенных систем [13, 19]. В нашем исследовании нанолипосомальная система доставки, совместно инкапсулированная с элротинибом (ERL; свободное основание ERL, log _P =3.3) и доксорубицин (DOX; DOX HCl, log _P =1,27) в единственной липосомной везикуле была приготовлена ​​в качестве модельной нанолипосомной системы в соответствии с предыдущим отчетом, за исключением так называемой композиции непегилированных липосом [13], и были изучены физико-химические характеристики системы. Исследования высвобождения лекарств in vitro были проведены для изучения высвобождения лекарств с разницей во времени. Среди нескольких методов, таких как экструзия, обработка ультразвуком и гомогенизация под высоким давлением [20,21,22], ультразвуковая обработка с использованием ультразвукового зонда использовалась для уменьшения диаметра липосом из-за его более эффективной обрабатываемости. Сравнительное исследование влияния технологий загрузки лекарственного средства, таких как метод градиента pH или сульфата аммония, на эффективность инкапсуляции (EE) лекарственного средства было выполнено для оптимизации инкапсуляции лекарственного средства. Кроме того, наиболее эффективный способ инкапсуляции лекарственного средства был определен путем исследования влияния условий процесса на ЭЭ лекарственного средства. Оптимизированы условия приготовления нанолипосомальной двойной системы доставки лекарств, инкапсулированной как с ERL, так и с DOX и высвобождающей лекарства в надлежащей последовательности. Оптимизированные методы приготовления и характеристики двойной системы доставки лекарств предполагают платформу надежных и воспроизводимых процессов приготовления и более совершенную систему доставки для трансляционных исследований.

Методы

Материалы

1,2-Дистеароил- sn -глицеро-3-фосфохолин (DSPC) и 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3-фосфо- (1′- rac -глицерин) (натриевая соль) (POPG) поставлялись Avanti Polar Lipids, Inc. (Алабастр, штат Алабама, США). Холестерин был от Sigma-Aldrich, Corp. (Сент-Луис, Миссури, США). Гидрохлорид доксорубицина (DOX) и свободное основание эрлотиниба (ERL) были приобретены у Boryung Co., Ltd. (Сеул, Корея) и Shanghai Send Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай), соответственно. Безводный сульфат аммония (AS) и лимонная кислота (CA) были поставлены компанией Daejung Chemicals &Metals Co., Ltd. (Siheung-si, Корея). Все остальные реагенты были реактивными и поставлялись Sigma-Aldrich, Corp. (Сент-Луис, Миссури, США).

Приготовление двойных нанолипосом, инкапсулированных лекарством

Общие процессы получения нанолипосом, инкапсулированных как с ERL, так и с DOX, показаны на рис. 1. Вкратце, липосомы с ERL были получены с использованием так называемого метода гидратации тонкой липидной пленки [23]. ERL был добавлен к липидной смеси, образующей тонкую липидную пленку, чтобы инкапсулировать лекарство в липидную двухслойную мембрану липосом. Диаметр липосом уменьшали обработкой ультразвуком с помощью ультразвукового зонда (Vibra Cell; Sonics &Materials, Inc., Ньютаун, Коннектикут, США). DOX был инкапсулирован во внутренний водный отсек нанолипосом, инкапсулированных ERL, с использованием градиента концентрации трансмембранных ионов нанолипосом. Подробные экспериментальные и аналитические методы процесса предлагаются в следующих разделах.

Процессы получения и характеристики двойных нанолипосом, инкапсулированных в лекарственное средство

Липосомы, инкапсулированные в ERL

Липидная смесь, состоящая из DSPC, холестерина и POPG в соотношении 27:20:3 ( w / w / w ) смешивали со свободным основанием ERL при массовом соотношении лекарственного средства к общему количеству липидов 3:50. Эти смеси растворяли в 9 мл смешанного растворителя хлороформ:метанол =2:1 ( v / v ). Липидный раствор помещали в колбу с круглым дном, и для образования липидной мембраны растворитель удаляли с помощью роторного испарителя (Rotavapor R-210; BÜCHI Labortechnik AG, Flawil, Швейцария) в вакууме при 40 ° C. Мембрану сушили в вакууме в течение ночи для удаления всего остаточного растворителя. В этих процессах молекулы ERL вставляются в липидную мембрану посредством гидрофобного притяжения, а затем спонтанно инкапсулируются в двухслойную липидную мембрану липосом, которые образуются в результате следующего процесса гидратации.

Для гидратации липидной мембраны, содержащей ERL, к мембране, образованной на внутренней поверхности круглодонной колбы, добавляли 8 мл 250–400 мМ AS или 300 мМ лимоннокислого буфера (pH 3,9). После инкубации мембраны при 65 ° C в течение 30 мин при вращении колбы суспензию липосом обрабатывали ультразвуком с использованием ультразвукового устройства для ванны (Branson 3510E-DTH; Branson, Danbury, CT, USA). Чтобы уменьшить диаметр липосом, суспензию липосом обрабатывали ультразвуком с использованием ультразвукового зонда в таких условиях, как импульс длительностью 5 с и 2 с выкл, амплитуда 20% и энергия 36 Дж на импульс в бане с ледяной водой. , или водяная баня при магнитном перемешивании. Чтобы удалить AS, который был выгружен в нанолипосомы, диализ нанолипосом проводили в течение ночи в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) с диализной трубкой целлюлозной мембраной (отсечка по молекулярной массе 14000 (MWCO); Sigma-Aldrich Corp., St. Луис, Миссури, США). В случае суспензии нанолипосом, приготовленной с использованием буфера из лимонной кислоты, pH раствора доводили до примерно 6,5 с помощью 300 мМ бикарбонатного буфера натрия, чтобы создать градиент между внутренней и внешней стороной нанолипосом.

Загрузка DOX в нанолипосомы, инкапсулированные в ERL

Чтобы инкапсулировать DOX в нанолипосомы, инкапсулированные ERL, гидрохлорид DOX сначала растворяли в 0,9% водном растворе NaCl при 65 ° C. Обычно 2 мл раствора DOX с концентрацией 1,5 мг / мл добавляли к 8 мл суспензии нанолипосом, инкапсулированных AS и ERL или инкапсулированных лимонной кислотой и ERL. Процессы загрузки лекарственного средства суспензии нанолипосом с добавлением DOX состояли из инкубации, обработки ультразвуком с использованием ультразвукового устройства для ванны, уравновешивания при комнатной температуре (RT) и диализа против PBS (pH 7,4) с использованием целлюлозной мембраны диализной трубки для удаления неинкапсулированного DOX из суспензия нанолипосом. Влияние условий загрузки DOX на EE DOX было исследовано с использованием четырех экспериментальных групп. Группа 1 представляла собой смесь раствора DOX и липосом, которую обрабатывали в последовательности инкубации при 65 ° C в течение 30 минут, обработки ультразвуком при 65 ° C в течение 5 минут и ночного диализа. Группу 2 инкубировали при 65 ° C в течение 30 минут, обрабатывали ультразвуком при 65 ° C в течение 5 минут, уравновешивали в течение 30 минут при комнатной температуре и затем диализовали в течение ночи. Группу 3 инкубировали при 65 ° C в течение 30 минут, обрабатывали ультразвуком при 65 ° C в течение 15 минут, а затем диализовали в течение ночи. Группу 4 инкубировали при 65 ° C в течение 30 минут, обрабатывали ультразвуком при 65 ° C в течение 15 минут, уравновешивали в течение 30 минут при комнатной температуре и затем диализовали в течение ночи.

Диаметр, морфология и физическая стабильность двойных нанолипосом, инкапсулированных в лекарственное средство

Диаметр нанолипосом с инкапсулированным лекарственным средством измеряли при 25 ° C с использованием анализатора размера частиц (ELS-Z; Otsuka Electonics Co., Ltd., Осака, Япония). Морфологию и средний диаметр одиночных или двойных нанолипосом, инкапсулированных лекарством, наблюдали с использованием полевого эмиссионного просвечивающего электронного микроскопа (FE-TEM) (JEM 2100F; JEOL Ltd., Токио, Япония, установленного в Корейском институте фундаментальных наук) при 200 кВ. Для приготовления образца суспензию нанолипосом наносили по каплям на покрытую углеродом медную сетку, и сетку сушили на воздухе при комнатной температуре перед просмотром под микроскопом. Физическую стабильность нанолипосом с двойным инкапсулированным лекарственным средством, инкубированных в PBS (pH 7,4) при различных температурах 4, 25 и 37 ° C, исследовали путем мониторинга изменения диаметра липосом как функции времени. Диаметр липосом измеряли с помощью анализатора размера частиц (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Limited, Вустершир, Великобритания).

EE of Drugs

Эффективность инкапсуляции (EE) DOX или ERL в двойных нанолипосомах, инкапсулированных лекарственным средством, определяли с помощью следующего уравнения. (1).

где C _f представляет собой инкапсулированное количество ERL или DOX в нанолипосомах, измеренное после разрушения нанолипосом 10% Triton-X 100 для полного высвобождения из них ERL или DOX. Поглощение ERL измеряли с помощью спектрометра UV-Vis (спектрофотометр DU-800; Backman Coulter Inc., Фуллертон, Калифорния, США) при 345 нм, а интенсивность флуоресценции DOX определяли с помощью спектрофлуориметра (SFM-25; Tegimenta AG, Rotkreuz , Швейцария) при длинах волн возбуждения 495 и 590 нм соответственно. Количество ERL или DOX рассчитывали с использованием заранее подготовленной калибровочной кривой ERL или DOX. C _я представляет собой количество ERL или DOX, добавленное к липидной смеси или нанолипосомам, инкапсулированным ERL. Количества определялись путем измерения поглощения или интенсивности флуоресценции каждого лекарства на соответствующих длинах волн.

Выпуск лекарства

Кассету для диализа (10000 MWCO, Slide-A-Lyser Dialysis Cassette G2; Thermo Scientific Corp., Рокфорд, Иллинойс, США) заполняли суспензией нанолипосом, инкапсулированных как с DOX, так и с ERL. Кассету помещали в PBS (pH 7,4) и среду для тестирования высвобождения непрерывно перемешивали при 37 ° C. В заранее определенные моменты времени из кассеты брали аликвоты образца для определения концентрации каждого лекарственного средства, а затем рассчитывали высвобождение лекарственного средства по следующей формуле. (2).

где D _т представляет собой концентрацию DOX или ERL, остающуюся в нанолипосомах в данный момент времени в течение периода тестирования высвобождения, и D _я представляет собой концентрацию DOX или ERL, инкапсулированных в нанолипосомы до эксперимента по высвобождению лекарственного средства. Концентрацию DOX определяли, измеряя интенсивность флуоресценции образца с помощью флуоресцентного спектрометра при длинах волн возбуждения и излучения 495 и 590 нм соответственно. Концентрацию ERL определяли измерением оптической плотности образца при 345 нм с помощью спектрометра УФ-видимого диапазона.

Статистический анализ

Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего, если не указано иное.

Результаты и обсуждение

Влияние процессов подготовки на характеристики нанолипосом

Были приготовлены двойные инкапсулированные лекарственным средством нанолипосомы, инкапсулирующие ERL в липидную двухслойную мембрану и DOX во внутреннем отсеке нанолипосом. Липосомы, инкапсулированные только с ERL, получали гидратированием липидной мембраны с включенным ERL водным раствором AS. Во время этих процессов молекулы ERL встраиваются в липидную мембрану посредством гидрофобного притяжения, а затем спонтанно инкапсулируются в двухслойную липидную мембрану липосом. После гидратации суспензию липосом обрабатывали ультразвуком с использованием ультразвукового зонда рогового типа для уменьшения диаметра липосом. Чтобы исследовать влияние ультразвуковой обработки и методов охлаждения на диаметр липосом, липосомы были обработаны с увеличением времени обработки ультразвуком при различных условиях охлаждения, и результаты показаны на рис. 2. На рис. 2а показано влияние времени обработки ультразвуком на диаметр и индекс полидисперсности (PDI) липосом, обработанных в условиях охлаждения на бане с ледяной водой. Диаметр липосом, инкапсулированных в ERL, не обработанных ультразвуком, составлял 759 ± 44 нм. Однако до 10 минут обработки ультразвуком диаметр липосом заметно уменьшился до 222 ± 40 нм, а через 10 минут не было значительного изменения диаметра по мере увеличения времени обработки ультразвуком. Эти результаты показывают, что липосомы, инкапсулированные в ERL, образованные в результате гидратации, в основном представляют собой многослойные везикулы (MLV). Высокая энергия, передаваемая липосомам MLV-типа посредством обработки ультразвуком, расслаивает многослойные MLV и разбирает большие липосомы. В водном растворе липиды, отделенные от MLV, самоорганизуются за счет гидрофобных притяжений и, таким образом, трансформируются в большие однослойные пузырьки (LUV) или маленькие нанолипосомы УФ (SUV) типа. По мере того как эти явления повторяются, средний диаметр нанолипосом постепенно уменьшается [24,25,26]. Как показано на рис. 2а, диаметр липосом заметно уменьшился за короткий период обработки ультразвуком. Считается, что в этот период большая часть липосом MLV-типа была преобразована в липосомы LUV- или SUV-типа [27]. Обработка ультразвуком более 10 мин вызвала небольшое уменьшение диаметра липосом, что указывает на меньшую трансформацию типа везикул со временем обработки ультразвуком. PDI диаметра липосом уменьшался с увеличением времени обработки ультразвуком, предполагая, что диаметр липосом стал однородным со временем, несмотря на небольшое увеличение PDI через 20 минут. На рис. 2b показано влияние времени обработки ультразвуком на диаметр и PDI липосом, обработанных в условиях охлаждения на водяной бане. Диаметр липосом, не обработанных ультразвуком, составлял 1433 ± 143 нм. Диаметр липосом значительно уменьшился до 337 ± 67 нм до 5 минут обработки ультразвуком, а через 5 минут наблюдалось постепенное уменьшение диаметра до 15 минут с последующим небольшим изменением диаметра. PDI диаметра липосом изменялся во время обработки ультразвуком до 15 мин и после этого достигал плато. В условиях водяной бани время, затрачиваемое на уменьшение диаметра липосом до менее 30% диаметра необработанных липосом, было короче, чем время, проведенное в условиях водно-ледяной бани. Считается, что уменьшение диаметра липосом происходило за счет передачи тепловой энергии, генерируемой ультразвуковой обработкой, липосомам MLV-типа. По сравнению с условиями водно-ледяной бани, температура суспензии липосом, обработанной ультразвуком в условиях водяной бани, была слишком высокой, что означает, что тепло суспензии липосом, образовавшееся из-за объемного нагрева с помощью ультразвуковой кавитации, высвобождалось менее эффективно. Чтобы предохранить липосомальную суспензию от побочных эффектов, таких как испарение среды и возможное разрушение липидных молекул, вызванное перегревом, в качестве условия охлаждения для обработки ультразвуком была выбрана баня с ледяной водой. С другой стороны, обработанные ультразвуком липосомы подвергали диализу для удаления неинкапсулированного AS. Нанолипосомы, инкапсулированные в ERL и AS, полученные с использованием обработки ультразвуком и диализа, имели примерно 140 нм среднего диаметра нанолипосом, что свидетельствует о небольшом уменьшении диаметра нанолипосом в результате диализа. Нанолипосомы, инкапсулированные в ERL и AS, были использованы для инкапсуляции DOX во внутренний отсек нанолипосом с использованием метода AS-градиента.

Влияние времени обработки зонда ультразвуком на диаметр и индекс полидисперсности нанолипосом, инкапсулированных ERL:баня со льдом и водой ( a ) или водяную баню ( b ) охлаждение липосомальной суспензии в контейнере во время обработки ультразвуком ( n =3, данные представлены как среднее ± SEM)

На рис. 3 показан диаметр нанолипосом, инкапсулированных в DOX и ERL, в зависимости от времени обработки ультразвуком с использованием ультразвукового устройства для ванны во время процесса загрузки DOX. Небольшие вариации диаметра были аналогичны тем, которые наблюдались после 10 мин ультразвуковой обработки ERL-инкапсулированных нанолипосом, как показано на рис. 2а. Несмотря на увеличение времени обработки ультразвуком, диаметр нанолипосом существенно не изменился до 45 минут обработки ультразвуком. Эти результаты можно объяснить тем фактом, что нанолипосомы, инкапсулированные в DOX и ERL, являются LUV или SUV [27]. Между тем, когда время обработки ультразвуком было больше 45 минут, произошло увеличение SEM среднего диаметра нанолипосом, что указывает на увеличение различий между образцами липосом. PDI диаметра уменьшался по мере увеличения времени обработки ультразвуком. Эти результаты предполагают, что однородность диаметра липосом увеличивалась со временем обработки ультразвуком, несмотря на небольшое увеличение PDI после 60 минут обработки ультразвуком. Короче говоря, изменение диаметра нанолипосом под действием ультразвука было самым высоким на стадии трансформации, когда липосомы превращались из MLV в LUV или SUV. Следовательно, обработка ультразвуком для уменьшения диаметра липосом была наиболее эффективной, когда обработка проводилась между гидратацией липидной мембраны и инкапсуляцией DOX во внутренний отсек нанолипосом, инкапсулированных ERL, в течение относительно короткого времени.

Влияние времени обработки в ванне ультразвуком на диаметр и индекс полидисперсности нанолипосом, инкапсулированных в DOX и ERL ( n =3, данные представлены как среднее ± SEM)

Влияние метода загрузки лекарств на ЭЭ

Нанолипосомы с двойным инкапсулированным лекарственным средством получали с использованием загрузки DOX в нанолипосомы, инкапсулированные в ERL, с приблизительно 30% EE ERL и диаметром нанолипосомы 140 нм. Количество инкапсулированного DOX или ERL в липосомах измеряли после разрушения липосом поверхностно-активным веществом для полного высвобождения лекарственных средств из липосом. Интенсивность флуоресценции DOX и поглощение ERL измеряли с помощью спектрофлуорометрии и спектрометрии в УФ-видимой области соответственно. Чтобы исследовать влияние методов загрузки DOX на EE DOX в нанолипосомах, инкапсулированных ERL и DOX, для инкапсуляции DOX в липосомы использовали метод активной загрузки, такой как градиент pH или метод AS-градиента. Разница в EE между двумя методами загрузки лекарственного средства была исследована, и результаты показаны на рис. 4. EE для DOX при использовании метода AS-градиента составляли 90% или более, а EE при использовании градиента pH составляли примерно 17%, что указывает на то, что метод AS-градиента был намного более эффективным при инкапсуляции DOX, чем метод pH-градиента [28].

Эффективность инкапсуляции DOX в двойных нанолипосомах, инкапсулированных лекарственным средством, в соответствии с методами загрузки DOX и концентрациями сульфата аммония (AS):CA лимонная кислота ( n =3, данные представлены как среднее ± SEM)

При сравнении изменений EEs DOX в соответствии с концентрациями AS, EE был самым высоким, а SEM EE был самым низким при 350 мМ AS. Метод AS-градиента или pH-градиента использует механизм транслокации лекарств, который заставляет лекарства за пределами нанолипосом мигрировать во внутренний компартмент нанолипосом из-за движущей силы, создаваемой трансмембранным градиентом концентрации ионов нанолипосом [29, 30]. Однако ЭЭ DOX методом AS-градиента была значительно выше, чем у метода pH-градиента. Эти результаты можно отнести к тому факту, что метод AS-градиента более эффективен в разработке кристаллических комплексов, чем метод pH-градиента, из-за более высокой способности кристаллизоваться между ионизированным DOX и противоионами внутри нанолипосом [31, 32].

Влияние условий загрузки лекарств на ЭЭ

Чтобы исследовать влияние условий обработки смеси раствора DOX и нанолипосом, инкапсулированных ERL, на EE DOX во время процесса загрузки DOX, четыре экспериментальные группы, показанные на рис. 5а, были созданы и экспериментировали в соответствии с различными условиями обработки. Группа 1 представляла собой смесь, обработанную в последовательности инкубации, обработки ультразвуком и ночного диализа. В группе 2, чтобы исследовать влияние уравновешивания обработанной ультразвуком смеси на EE, смесь инкубировали, обрабатывали ультразвуком, уравновешивали в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем диализовали в течение ночи. В качестве группы для исследования влияния длительной обработки ультразвуком на EE, группа 3 представляла смесь, инкубированную, обработанную ультразвуком при 65 ° C в течение 15 минут, а затем диализованную в течение ночи. Более того, в качестве группы для исследования эффектов длительной обработки ультразвуком и уравновешивания на EE, группа 4 представляла собой смесь, инкубированную, обработанную ультразвуком при 65 ° C в течение 15 минут, уравновешенную в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем диализованную в течение ночи. Во всех группах нагрузку DOX проводили методом AS-градиента. Как показано на рис. 5б, ЭЭ DOX групп 1, 2, 3 и 4 составили 93 ± 7,8, 98 ± 2,5, 83 ± 4,9 и 59 ± 4,2% соответственно. По сравнению с EE группы 3, EE группы 1 был выше, что указывает на то, что более короткая продолжительность обработки ультразвуком в ванне является более эффективной обработкой для увеличения EE в нанолипосомах. По сравнению с EE группы 1, группа 2 имела более высокий EE DOX. EE группы 4 был самым низким среди всех экспериментальных групп. В отличие от повышения ЭЭ за счет уравновешивания после кратковременной обработки ультразвуком, примененной к группе 2, уравновешивание после продолжительной обработки ультразвуком, применяемого к группе 4, не было эффективным для повышения ЭЭ. Эти результаты могут быть связаны с чрезмерным количеством энергии, передаваемой суспензии, которая может разрушить нанолипосомы во время обработки ультразвуком в ванне, описанной выше. Также считается, что при длительной обработке ультразвуком в ванне в группах 3 и 4 EE был снижен из-за уменьшения содержания AS в нанолипосомах. Поскольку температура суспензии нанолипосом увеличилась намного выше температуры фазового перехода ( T _c ) при длительной обработке ультразвуком в ванне текучесть липидного бислоя увеличивалась и, следовательно, индуцировала высвобождение AS из липосом. Образцы нанолипосом группы 3 диализовали сразу после обработки ультразвуком в ванне, что свидетельствует о быстром охлаждении образцов. Напротив, образцы нанолипосом группы 4 обрабатывали длительной обработкой ультразвуком в ванне с последующим уравновешиванием, что могло бы поддерживать высвобождение AS, увеличивать образование комплекса DOX-сульфат вне липосом и, следовательно, снижать EE. Хотя уравновешивание после длительной обработки ультразвуком не было эффективным, эти результаты предполагают, что процесс загрузки DOX, такой как последовательная обработка смеси раствора DOX и нанолипосом, инкапсулированных ERL - инкубация выше T _c фосфолипида, обработка ультразвуком в ванне, уравновешивание ниже T _c , например, при RT и ночной диализ - это более эффективный метод увеличения ЭЭ, чем другие процессы без уравновешивающей обработки [33,34,35].

Эффективность инкапсуляции DOX в двойных нанолипосомах, инкапсулированных лекарственным средством, в соответствии с различными условиями нагрузки лекарством:условия нагрузки лекарством для каждой экспериментальной группы ( a ) и эффективности инкапсуляции лекарств экспериментальных групп ( b ) ( сущ =3, данные представлены как среднее ± SEM)

Морфология и физическая стабильность двойных нанолипосом, инкапсулированных в лекарственное средство

На рисунке 6 показана морфология нанолипосом, наблюдаемая с помощью ПЭМ. Образцы для ПЭМ-наблюдения были приготовлены с использованием капельного литья нанолипосом, совместно инкапсулированных ERL и DOX, на покрытую углеродом медную сетку и сушки на воздухе при комнатной температуре. Чтобы сравнить характеристики липосом с двойным инкапсулированным лекарственным средством и липосом с одиночным инкапсулированным лекарственным средством, морфологию нанолипосом, инкапсулированных в ERL или инкапсулированных DOX, наблюдали с помощью ТЕМ. Как показано на фиг. 6а, диаметр двойных нанолипосом, инкапсулированных лекарственным средством, был менее 200 нм, а форма была почти сферической. Диаметр липосом, наблюдаемый с помощью анализа ПЭМ, совпадал со значением, измеренным с использованием анализатора размера частиц, использующего динамическое рассеяние света. На рис. 6b показано изображение одиночной нанолипосомы, содержащей комплексы DOX-сульфат внутри липосомы. Предполагалось, что комплексы представляют собой кристаллы, образованные за счет притяжения между протонированными катионами DOX и двухвалентными сульфат-анионами [36]. На рисунке 6c показано ПЭМ-изображение с высоким разрешением (HR-), на котором видны кристаллы лекарства во внешней области нанолипосомы, представленной на рисунке 6b. Изображение показало, что высококристаллическая решетка во внутреннем компартменте нанолипосомы и менее кристаллический домен имеют аморфный домен, расположенный рядом с углеродом на сетке [37]. Аморфный домен во внешней области нанолипосомы может быть следствием нестабильности липидного бислоя при воздействии пучка электронов с высокой энергией. Картина дифракции электронов на выбранной области (SAED), представленная на рис. 6d, демонстрирует регулярность ярких дифракционных пятен, что указывает на то, что кристаллы, показанные на рис. 6c, имеют высокоупорядоченную кристаллическую решетку [38]. Для сравнения результатов ПЭМ-анализа нанолипосом с двойным инкапсулированным лекарственным средством и нанолипосом с одиночным инкапсулированным лекарственным средством нанолипосомы, инкапсулированные в ERL, наблюдались с помощью ТЕМ, и изображение показано на рис. 6e. The outermost region of the nanoliposome present in Fig. 6e was observed by HR-TEM, and the result is shown in Fig. 6f. From the result, it was found that the outermost region was composed of a number of small crystals and amorphous domains adjacent to the carbon on the grid. Figure 6g shows a SAED pattern of the crystals shown in Fig. 6f. The SAED pattern exhibited a ring made up of small spots arising from the individual crystals. Therefore, it is considered that the ERL intercalated between the lipid bilayer are present as small crystals with less ordered orientation [39]. On the other hand, as the other comparison, TEM analysis of the DOX-encapsulated nanoliposomes was carried out and the result is shown in Fig. 6h. The morphology and the diameter of the nanoliposome observed by TEM were similar to those of the dual drug-encapsulated nanoliposome. The HR-TEM image shown in Fig. 6i confirmed the crystalline lattice of the DOX-sulfate formed inside of the DOX-encapsulated liposome. The SAED pattern shown in Fig. 6j suggest that the crystals inside the liposome have a highly ordered crystalline lattice. These results verify that the diffractions of the ERL- and DOX-encapsulated nanoliposome by the electron beam were originated predominantly not by the ERL crystals in the lipid bilayer but by the DOX-sulfate crystals inside the nanoliposome. In summary, the morphology of the dual drug-encapsulated nanoliposomes and the crystals of each drug formed in the liposomes were identified by TEM, HR-TEM, and SAED analyses [40].

Transmission electron microscopy (TEM) and selected area electron diffraction (SAED) analyses of dual drug- or single drug-encapsulated nanoliposomes:ERL- and DOX-encapsulated nanoliposomes (scale bar, 200 nm) (a ), a single nanoliposome containing ERL and DOX-sulfate complexes (scale bar, 50 nm) (b ), a high resolution- (HR-) TEM image representing DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome and ERL crystals in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (c ), a SAED pattern of DOX-sulfate crystals and ERL crystals present in a nanoliposome (d ), a single nanoliposome encapsulated with ERL (scale bar, 50 nm) (e ), a HR-TEM image representing small crystals of ERL and amorphous domains in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (f ), a SAED pattern of ERL crystals present in an outermost region of the nanoliposome (g ), a single nanoliposome encapsulated with DOX (scale bar, 100 nm) (h ), a HR-TEM image representing crystalline lattices of DOX-sulfate inside the nanoliposome (sale bar, 5 nm) (i ), and a SAED pattern of DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome (j )

As a result of a physical stability study on the dual drug-encapsulated nanoliposomes, Fig. 7 shows the percent change in diameter of the nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at 4, 25, and 37 °C, respectively, as a function of the time. When incubated at 4 °C, in comparison with the initial diameter at day 0, the diameter of the nanoliposomes increased by 14.8% on day 5 and varied thereafter in a smaller extent of change in the diameter. The overall change of the diameter, however, was in a range of ± 15.0% during the stability test period. At 25 °C, the diameter of the nanoliposomes increased by 10.9% on day 5 and then decreased − 8.0% on day 19, indicating that the overall change was in a range of ± 10.0% during the test period. In addition, at 37 °C, the overall change in the diameter of the nanoliposomes was in a range of ± 6.0% during the test period, showing the smallest degree of change compared with the other test conditions. Based on the fact that in all three conditions tested, there was no significant change in the diameter of the nanoliposome, it is considered that the nanoliposomes prepared in our study have the physical stability in PBS (pH 7.4) for at least 3 weeks without aggregation or flocculation, which can affect therapeutic efficacy, targeting, and toxicity of the drug(s) encapsulated in the nanoliposomes. It has been acknowledged that the two important factors determining physical stability of nanoliposomes are T _c of phospholipid(s) and a content of cholesterol constituting the nanoliposomes [41]. The high stability of the nanoliposomes at 37 °C may be due to the low probability of phase transition of the phospholipid bilayer made up of DSPC, which has a high T _c and is utilized in general as a main lipid component in various liposome formulations. Also, a high composition ratio such as 40 wt% of cholesterol in the nanoliposomes seems to contribute to enhance the physical stability of the nanoliposomes [42]. On the other hand, nonetheless a low T _c (− 2 °C) of POPG having a double bond in its one acyl chain, a very low composition ratio such as 3 wt% of POPG had little effect on the stability of the nanoliposomes.

Stability of dual drug-encapsulated nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at different temperatures of 4, 25, and 37 °C, respectively:percent change in nanoliposome diameter relative to initial diameter as a function of incubation time

Time-Differential Drug Release

There are a number of systems that can carry two kinds of drugs with different physicochemical properties on one vehicle. The representative examples are a micelle system containing the two drugs in the same compartment of the system, a polymer matrix system composed of different compartments containing each drug, and a liposome or a polymersome system containing each drug in the core and shell of the system, respectively [43,44,45,46]. In particular, when sequential actions of the two drugs are essential to cause a synergistic effect of the drugs, the time-differential release of each drug from the dual drug-encapsulated carrier is highly important. The in vitro time-differential release of DOX and ERL from the dual drug-encapsulated nanoliposomes was investigated, and the results are shown in Fig. 8. The releases of DOX and ERL from the nanoliposomes were monitored against a test medium, PBS (pH 7.4), under continuous stirring. The released amount of DOX or ERL after designated release test period was calculated measuring the fluorescence intensity of DOX and the absorbance of ERL with the fluorescence spectrometer and the UV-Vis spectrometer, respectively.

In vitro release profiles of ERL and DOX from dual drug-encapsulated nanoliposomes:time-differential release (a ) and release rates of ERL and DOX (b ) (n  = 3, the data are presented as mean ± SEM)

As shown in Fig. 8, the ERL release was 36 ± 0.01%, while the DOX release was less than 10% until 8 h of the release test period. In particular, during this period, the release rate of ERL was much faster than that of DOX. By 48 h, 65 ± 0.07% of ERL were released from the nanoliposomes in contrast to 30 ± 0.01% release of the DOX. The release rates of ERL and DOX are shown in Fig. 8b. Until 8 h, the release rate of ERL was more than 4% per hour in contrast to less than 1% per hour of the DOX release rate. After 8 h, the release rate of ERL was slowed down. Compared with the release of ERL, DOX showed a slow release and had an almost zero-order release rate. These results suggest that during the initial period of release test, much more amounts of ERL were released from the liposomes than those of DOX and there was a time-differential release between ERL and DOX. The sequential release of the drugs was thought to be originated from the difference between the physicochemical states of each drug in the liposomes [28, 32, 47]. These results on the dual drug-encapsulated nanoliposome system can contribute to translation of in vitro synergistic effects of two kinds of drugs into the clinic through overcoming both the difference between PK properties of each drug and the difficulty in targeting the same cancer cells in proper temporal sequence.

Выводы

As a dual drug delivery system, a nanoliposomal delivery system encapsulating both ERL and DOX was prepared and characterized. The liposome diameter was controllable by ultrasonication, and the sonication for diameter reduction was effective when carried out after the film-hydration and before DOX encapsulation. The nanoliposome diameter decreased remarkably during an initial period of ultrasonication. DOX was loaded into ERL-encapsulated nanoliposomes through pH- or AS-gradient method. AS-gradient method showed higher EE of DOX than pH-gradient, and the AS concentration for higher EE of DOX was determined. Equilibration of a mixture of DOX solution and ERL-encapsulated nanoliposomes in DOX-loading process was advantageous for EE increase of DOX. By HR-TEM and SAED analyses of the dual drug-encapsulated nanoliposomes, not only the highly oriented crystals formed between protonated DOX cations and divalent sulfate anions inside the liposome but also the less oriented small crystals of ERL in the outermost layer of the nanoliposome were identified. ERL and DOX co-encapsulated in the nanoliposomes showed a time-differential release, indicating much faster release of ERL than that of DOX from the liposomes. The elucidated preparation methods of the nanoliposomal dual drug delivery system can contribute to development of advanced dual drug delivery systems and translational researches of the combination therapies exhibiting synergistic effects via sequential actions of the drugs.

Сокращения

DOX:

Doxorubicin

DSPC:

1,2-Distearoyl-sn -glycero-3-phosphocholine

EE:

Encapsulation efficiency

EPR:

Enhanced permeability and retention

ERL:

Erlotinib

PK:

Pharmacokinetic

POPG:

1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero-3-phospho-(1′-rac -glycerol) (sodium salt)

SAED:

Электронная дифракция в выбранной области

SEM:

Standard error of mean

T _c :

Phase-transition temperature

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия