Последовательное высвобождение тканевых ингибиторов металлопротеиназы-1 с помощью системы доставки на основе оксида графена может способствовать регенерации кожи

Фон

Поражения кожи могут быть вызваны многими факторами, такими как несчастные случаи, диабетические осложнения, ожоги или поверхностное хирургическое вмешательство [1]. Трансплантация аутогенной кожи или биополимеров, используемых для изготовления искусственной кожи, представляет собой наиболее распространенный подход, используемый для закрытия ран [2]. Эти заменители могут включать ограничение доступных донорских мягких тканей, особенно у пациентов с тяжелыми ожогами [3], инфекцию [4], боль и некроз кожного лоскута [5], замедление заживления и биосовместимость материала.

Тканевый ингибитор металлопротеиназы-1 (ТИМП-1) предотвращает разложение внеклеточного матрикса (ЕСМ), образуя ингибирующий комплекс с матриксными металлопротеиназами (ММП) [6, 7]. Белки ТИМП также контролируют управляемый ММП оборот и процессинг факторов роста, а также цитокинов, связанных с заживлением и регенерацией ран [8]. TIMP и MMP регулируются во время нормального заживления ран, и их дисбаланс связан с дефектами восстановления кожи, келоидами и фиброзом [9]. TIMP-1, происходящий из эпителия, может прямо или косвенно регулировать эпителизацию на разных стадиях. Важной фазой эксцизионного заживления ран и регенерации кожи является реэпителизация, то есть повторный рост эпителия на травматической поверхности [10]. Реэпителизация происходит, когда клетки на краю раны ослабляют свои межклеточные и межклеточные контакты и начинают мигрировать через рану. Эти процессы были связаны с биологией TIMP-1 [11].

Оптимальная региональная система введения ТИМП-1 для восстановления кожи зависит от используемого средства доставки. Были разработаны некоторые средства доставки, предназначенные для высвобождения цитокинов [12]. Носители включают PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислоты) [13], хитозан [14], наносферы PLGA [15] и гидрогели. Использование носителя для доставки поможет снизить дозировку ТИМП-1 для регенерации кожи и обеспечит региональную доставку агента. Графен состоит из атомов углерода с плоским монослоем и двумерной структурой в виде сот [16]. Оксид графена (GO) использовался в литературе как средство доставки малых молекул лекарств, поскольку он имеет эффективную загрузку (абсорбцию), биосовместим и имеет низкую токсичность [17,18,19]. Основные характеристики GO включают гидрофобность π домены в ядре структуры с ионизированными областями по краям. Отличительный π - π Взаимодействие при штабелировании делает GO эффективным с точки зрения растворимости в воде, с большой удельной поверхностью, обеспечивающей высокую нагрузочную способность [20, 21].

В настоящем исследовании мы исследовали, можно ли сочетать рекомбинантный белок ТИМП-1 человека с ГО в качестве средства доставки для улучшения регенерации кожи. Чтобы исследовать влияние на регенерацию кожи, ТИМП-1 загружали на хлопья ГО, и его высвобождение и токсичность измеряли in vitro с помощью фибробластов крысы. Наконец, результаты проверяются на крысах, где используется модель кожной раны.

Материалы и методы

Культура клеток

Фибробласты крыс были приобретены в Институте биохимии и клеточной биологии, CAS (Шанхай, Китай), и культивированы в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, GibcoBRL, Гейтерсбург, Мэриленд, США), содержащей 10% ( v / v ) фетальная бычья сыворотка (FBS, Gibco). Среду меняли каждые 2 дня. Все клетки хранили при 37 ° C.

Характеристика GO

Хлопья GO были приобретены у Chengdu Organic Chemicals Co., Ltd. Китайской академии наук (Чэнду, Китай) и охарактеризованы с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM, JSM-6701F, JEOL, Токио, Япония) после покрытия платиной. Образцы сканировали под растровым электронным микроскопом (Hitachi S3000N) при ускоряющем напряжении 15 кВ. Распределение по размерам хлопьев GO определяли с помощью спектрофотометра на основе дзета-электрического потенциала (Zetasizer 3000 HSA, Малверн, Великобритания). Морфологию хлопьев GO определяли с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM, MultiMode, VEECO, США) в сочетании с инвертированным микроскопом (инвертированный микроскоп IX71, Olympus, Токио, Япония). Термогравиметрический анализ и дифференциальную сканирующую калориметрию выполняли с использованием термогравиметрического анализатора TGA / DSC (Pyris 1 TGA, Perkin-Elmer, США), помещая образцы в глиноземные поддоны и применяя наклонную температуру от 25 до 1100 ° C при 10 ° C / мин.

Адсорбция TIMP-1 на GO

Хлопья GO метили перхлоратом 1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетрамэтилиндокарбоцианина (DiI, красный, Sigma) перед адсорбцией человеческого рекомбинантного TIMP-1 (Huaan Co., Ханчжоу, Китай). Для адсорбции TIMP-1 к фосфатно-солевому раствору (PBS ) и инкубировали 4 ч при 4 ° C. Отношение ГО к рекомбинантному ТИМП-1 составляло 1:1 по массе. Для определения нагрузки ТИМП-1 на ГО, ТИМП-1 (1 мкг) добавляли к 20 мкл PBS, содержащего ГО, и инкубировали в течение 4 ч при 4 ° C. Адсорбированный на ГО ТИМП-1 визуализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (инвертированный микроскоп IX81-FV1000, Olympus). Чтобы подтвердить адсорбцию ТИМП-1 на ГО, была проведена инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR) с использованием спектроскопии Nicolet 5700 (ThermoFisher Co., SGE, Австралия) на гранулах (диаметром 10 мм), приготовленных смешиванием 2 мг ГО с 100 мг KBr и прессование для получения гранулы для анализа. Спектры анализировали после коррекции базовой линии с помощью программного обеспечения EZ OMNIC (Nicolet).

Кинетика высвобождения белка TIMP-1

Профили высвобождения ТИМП-1 из различных концентраций ГО (10, 20 и 30 мкг / мл) определяли с использованием коммерческих иммуноферментных анализов, специфичных для человеческого ТИМП-1 (ELISA, R&D Systems Inc., Миннеаполис, Миннесота, США). США). После инкубации в течение 4 ч при 4 ° C ELISA супернатанта показал, что практически весь TIMP-1 адсорбируется на GO. ГО, загруженный ТИМП-1, суспендировали в 60-мм культуральных чашках, содержащих 1,5 мл PBS. Затем чашки инкубировали при 37 ° C. В различные моменты времени после непрерывного перемешивания собирали супернатант и в чашки для культивирования добавляли свежий буфер. Концентрацию человеческого ТИМП-1 в супернатанте определяли с помощью ELISA.

Анализ биосовместимости GO

К культурам фибробластов крыс добавляли 20 микрограммов на миллилитр хлопьев ГО, загруженных ТИМП-1 в концентрации 20 мкг / мл, и клетки культивировали в течение 6, 24, 48 и 72 часов. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа подсчета клеток-8 (CCK8), как описано в инструкции производителя. Поглощение образца выражали как значение поглощения при 450 нм ( n =5 для каждой группы).

Характеристика проточной цитометрии

Фибробласты собирали трипсинизацией и метили Hoechst 33258 и Annexin-V-FITC / PI. Затем активность клеточного цикла и апоптоз клеток определяли с помощью набора для анализа проточной цитометрии (Lianke, Ханчжоу, Китай). Мечение проводили в течение 30 мин при 4 ° C в присутствии блокирующего реагента (Lianke, Ханчжоу, Китай) с последующими двумя стадиями промывки с использованием PBS. После стирки и фиксации не менее 10 ⁴ клетки были получены и проанализированы. Проточный цитометрический анализ выполнялся с использованием Becton Dickinson FACSCanto II.

Эксперимент In Vivo

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями NIH в США. Животные для экспериментальных процедур были одобрены этическим комитетом Чжэцзянского университета. Четырехнедельным самцам крыс Sprague – Dawley была проведена хирургия кожных дефектов (SDS), как описано ранее (рис. 4a) [22]. Размер кожного дефекта 10 мм × 10 мм. После операции животных вернули в индивидуальные клетки. Через четырнадцать дней после SDS животных случайным образом делили на четыре группы и начинали терапию. Местные инъекции контрольного агента (только 4 мл PBS), агента GO (4 мл GO с PBS, 1:20), агента TIMP-1 (4 мл TIMP-1 с PBS 1:20) или агента TIMP-1-GO (4 мл ГО с ТИМП-1, 1:1 v / w ) вводили подкожно. Инъекции делались каждую неделю вокруг дефекта кожи (всего 4 точки по 1 мл каждая), всего две процедуры в течение 2 недель. Крыс умерщвляли через 4 недели после операции (рис. 4а). Регенерированная кожа была разрезана, залита парафином и исследована путем окрашивания гематоксилином-эозином и окрашивания по Массону.

Гистологический и иммуногистохимический анализ

Регенерированные шкуры фиксировали в 4% -ном формалине в течение 72 ч. Затем образцы декальцинировали в 9% -ной муравьиной кислоте в течение 2 недель при комнатной температуре. Образцы кожи обезвоживали градуированным этанолом. Последовательные срезы окрашивали гематоксилин-эозином (HE) и массоном. Экспрессию CD34 в дефекте кожи анализировали иммуногистохимическим окрашиванием. Срезы депарафинизировали в ксилоле и гидратировали с помощью градуированных спиртов. После блокирования 1% козьей сывороткой (разведение 1:100, Sigma) срезы инкубировали с первичными антителами против CD34 (Abcam, Кембридж, Великобритания) в течение ночи при 4 ° C. После трехкратной промывки PBS срезы инкубировали со вторичным антителом в течение 1 ч при 37 ° C. Окрашивание проявляли раствором 3,3'-диаминобензидина (DAB) (Dako, Гамбург, Германия). За регенерированной кожей наблюдали три обученных наблюдателя. Иммуногистохимические срезы были разделены с использованием процентного содержания DBA.

Статистический анализ

Все эксперименты были повторены трижды, и данные были представлены как средние значения ± стандартное отклонение. Односторонний дисперсионный анализ и апостериорный критерий Стьюдента – Ньюмана – Кеулса определили уровень значимости. p значения менее 0,05 и 0,01 соответственно считались значимыми и очень значимыми. Статистический анализ выполнялся с помощью SPSS 17.0 (SPSS Inc., Чикаго, США).

Результаты

Характеристика GO

2D-представление изображений GO показано на АСМ (рис. 1а). СЭМ показало, что хлопья GO представляют собой листы неправильной формы (рис. 1b). Распределение хлопьев GO по размерам измеряли с помощью спектрофотометра, основанного на электрическом потенциале. Наибольшая интенсивность распределения по размерам составляла 1140 нм, а наибольшая интенсивность объема GO составляла 10 674,1 нм (рис. 2а).

Поглощение ГО. а 2D-представление изображений GO показано на АСМ. б СЭМ показывает, что хлопья GO представляют собой листы неправильной формы. Хлопья ГО представляли собой листы неправильной формы. c Гранулометрический состав хлопьев ГО. Наибольшая интенсивность составляла 1140 нм, а объем наибольшей интенсивности составлял 10 674,1 нм

Характеристика ГО и ТИМП-1-ГО. а ТИМП-1 был поглощен ГО. Анализ показал, что 75 ± 1,2% ГО абсорбировалось в ТИМП-1. б Были записаны совокупные профили высвобождения ТИМП-1. ТИМП-1, встроенный в ГО, представляет собой подходящую систему для пролонгированного высвобождения ТИМП-1 примерно на 40 дней. c Химический состав между ГО и ТИМП-1-ГО исследовали с помощью ИК-Фурье спектроскопии. Форма волны и пик волны GO значительно отличались от таковых у TIMP-1-GO. г Кривая термогравиметрического анализа не показывает существенных различий между ГО и ТИМП-1-ГО от 50 до 800 ° C. Кривая термогравиметрического анализа не показала заметных различий между контрольным ГО и ТИМП-1-ГО

Адсорбция TIMP-1 на GO

Ниже приводится инкубация FITC-конъюгированного TIMP-1 (зеленый) и меченного DiI GO (красный) в PBS в течение 4 часов; ТИМП-1 был адсорбирован на ГО. Анализ показал, что 75 ± 1,2% ГО абсорбировалось ТИМП-1 через 4 часа, что свидетельствует о том, что ГО эффективно связывается с белком ТИМП-1 (рис. 1в). Мы исследовали химический состав ТИМП-1-ГО с помощью ИК-Фурье спектроскопии (рис. 2б). Форма волны и пик волны GO значительно отличались от таковых у TIMP-1-GO. Мы дополнительно исследовали термогравиметрический анализ между контрольным ГО и ТИМП-1-ГО (рис. 2d). Кривая термогравиметрического анализа не показала заметных различий между контрольным ГО и ТИМП-1-ГО.

Версия TIMP-1

Различные концентрации ТИМП-1 (группа 1 3 мкг / мл, группа 2 2 мкг / мл и группа 3 10 мкг / мл) загружали на ГО. Кумулятивные профили высвобождения ТИМП-1 показаны на рис. 2с. Высвобождение ТИМП-1-ГО 2 мкг / мл достигало кумулятивного высвобождения 50% быстрее по сравнению с дозой 10 и 30 мкг / мл ТИМП-1. ТИМП-1 выпускали непрерывно около 40 дней. Это предполагает, что применение ТИМП-1, встроенного в ГО, может представлять собой подходящую систему для пролонгированного высвобождения ТИМП-1 (рис. 2c).

Пролиферация и жизнеспособность клеток в TIMP-1-GO

Пролиферация и жизнеспособность фибробластов крыс, культивируемых в контроле, GO и TIMP-1, существенно не отличались от таковых клеток, выращенных в разных образцах TIMP-1-GO ( p > 0,05). Клеточный цикл и апоптоз фибробластов, культивируемых в контроле, GO и TIMP-1, существенно не отличались от цикла клеток, выращенных в образцах TIMP-1-GO ( p > 0,05) (рис. 3a – c).

Влияние ТИМП-1-ГО на пролиферацию и жизнеспособность клеток фибробластов крыс. а Жизнеспособность фибробластов, культивируемых в разных группах, не показывает значимых различий в разные моменты времени ( p > 0,05). б Клеточный цикл фибробластов существенно не отличался от цикла клеток, выращенных в разных группах ( p > 0,05). c Апоптоз клеток фибробластов существенно не отличался от апоптоза клеток, выращенных в разных группах ( p > 0,05)

Эффективность TIMP-1-GO в модели эксцизионной кожной раны

ТИМП-1-ГО вводили крысам подкожно, чтобы определить, может ли он способствовать заживлению экспериментальной раны. Через четыре недели после операции по сравнению с контрольной группой дефекты кожи, обработанные TIMP-1-GO, показали значительные различия в терминальной точке ( p <0,05), тогда как дефекты кожи, обработанные TIMP-1, показали значительные различия с контрольной группой и группой GO в конечной точке ( p <0,05). Кроме того, группа TIMP-1-GO продемонстрировала усиленный терапевтический эффект в отношении регенерации волосяных фолликулов ( p <0,05). Дефекты кожи, обработанные TIMP-1, показали значительные различия с контрольной группой и группой GO в конечной точке ( p <0,05) (рис. 4б).

Эксперимент in vivo. а Схема и паспорт безопасности и модель. б Гистологический и иммуногистохимический анализ in vivo (1 см). Непрерывное коллагеновое волокно видно в группе ТИМП-1-ГО. c Количественная оценка выявила значительные различия между контролем и GO по сравнению с TIMP-1 и TIMP-1-GO ( p <0,05). Волосяные фолликулы разных групп значительно различались ( p <0,05). Дефекты кожи, обработанные TIMP-1, показали значительные различия с контрольной группой и группой GO по полуколичественному ( p <0,05)

Гистологический и иммуногистохимический анализ

Гистологические особенности регенерации кожи после обработки PBS показаны на рис. 4б. В контрольных группах после дефекта кожи видно разорванное коллагеновое волокно, видимое в образцах через 4 недели после лечения. Напротив, непрерывное коллагеновое волокно видно в группах TIMP-1-GO в один и тот же момент времени и показывает статистическую разницу по сравнению с контрольной группой. Иммуногистохимические особенности васкуляризации после обработки ТИМП-1-ГО показаны на рис. 3в. Подкожные клетки CD34 + видны в образцах через 4 недели в группах, получавших TIMP-1-GO. Количественная оценка выявила значительные различия между контрольными группами и группой лечения TIMP-1-GO ( p <0,05) (рис. 4в).

Обсуждение

В настоящем исследовании мы проанализировали потенциально новый подход к усилению заживления эксцизионных ран путем комбинирования рекомбинантного белка TIMP-1 с контролируемым высвобождением из ГО. ГО показал хорошую биосовместимость in vitro. И показано, что ТИМП-1 непрерывно высвобождается из транспортного средства ГО в течение до 40 дней. На экспериментальной модели кожного дефекта показано, что комбинация ТИМП-1 с ГО способствует васкуляризации и регенерации коллагена.

Различные биомедицинские материалы были оценены в качестве терапевтических средств доставки агентов для регенерации тканей. Такие носители, как коллаген, шелк, титан, кальций-фосфатный цемент и полимолочная кислота-полигликолевая кислота, как правило, вызывают быстрое высвобождение биологического агента, что может быть нежелательным в некоторых терапевтических условиях [23]. Следовательно, способность биомедицинского вектора обеспечивать медленное непрерывное высвобождение биологических молекул можно рассматривать как важную особенность. Требование к этому качеству - гибкость, используемая для загрузки лекарства с помощью электрического заряда [24]. Оксид графена (GO) обеспечивает «стартовый» эффект, который показал свою полезность для медленного высвобождения различных биологических агентов как in vitro, так и in vivo [25, 26, 27]. Здесь мы показали, что ГО можно использовать для обеспечения замедленного высвобождения рекомбинантного человеческого белка ТИМП-1. Взаимодействие между гидрофобными π домены ГО и электростатического взаимодействия могут активировать отрицательно заряженные домены ГО и обеспечить эффективное поглощение белка ТИМП-1 ГО через внутренние гидрофобные области. Длительное высвобождение ТИМП-1 из ГО идеально подходит для необходимой реваскуляризации при заживлении кожных ран.

Предполагается, что частицы углерода с концентрацией более 50 мг / мл могут откладываться в тканях [28]. Wang et al. предположили, что это может вызвать воспалительные реакции из-за его чрезвычайно малого диаметра, но большой функциональной площади ГО [29]. В отличие от предыдущих исследований, осаждение GO в нашем исследовании не обнаружено. Учитывая отсутствие очевидного побочного эффекта, наблюдаемого здесь, потенциальный негатив наночастиц GO не может быть подтвержден. Предложены дальнейшие исследования графена, включая биологический отклик и тест на безопасность [30].

Важным вопросом является исследование влияния взаимодействия оксида графена на клетки. Графен - это недавно разработанный биомедицинский материал, свойства которого предполагают его использование во многих биологических приложениях. Однако потенциальная биология двумерной углеродной структуры / токсикология графена и общие биологические взаимодействия до конца не изучены, что потребует обширных дополнительных исследований.

Заключение

Оксид графена (GO) демонстрирует устойчивую биосовместимость при использовании в качестве носителя для медленной доставки рекомбинантного TIMP-1. Показано, что ТИМП-1 непрерывно высвобождается из ГО в течение до 40 дней, и показано, что комбинация ТИМП-1 с ГО способствует реваскуляризации и регенерации коллагена на модели регенерации кожи.