Наночастицы как насос оттока и ингибитор биопленки для омоложения бактерицидного действия обычных антибиотиков

Обзор

Хронические инфекции, выявленные с помощью биопленок, трудно искоренить, поскольку они способны противостоять как антибиотикам, так и иммунной системе хозяина [1]. Биопленочный барьер - одна из основных причин перехода острых инфекций в хронические [2]. Как указано в отчете национального института здравоохранения и центра по борьбе с болезнями, примерно 65–80% заболеваний вызываются вызывающими биопленку бактериями, преимущественно грамотрицательными бактериями Pseudomonas aeruginosa и кишечная палочка и грамположительные бактерии Staphylococcus aureus [3]. Антибиотики оказались неэффективными при лечении инфекций, содержащих биопленку, из-за их ограниченной способности пересекать бастион биопленки и уничтожать бактериальные клетки-мишени [4]. Кроме того, бактерии создали уникальную систему оттока токсичных веществ и продуктов жизнедеятельности за пределы бактериальной клетки [5]. Оттокные насосы представляют собой мембраносвязанные белки-переносчики, обладающие широким спектром субстратной специфичности и огромной способностью не допускать лекарств [6].

Все эти заболевания, связанные с проблемами биопленки и оттока, приводят к появлению бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) или бактерий с широкой лекарственной устойчивостью (EDR); в связи с этим наночастицы в сочетании с обычными антибиотиками были предложены в качестве альтернативного подхода к искоренению или повреждению биопленки, а также для лечения инфекций, вызываемых МЛУ или МЛУ.

Эти новые противомикробные препараты, металлические наночастицы, не только усиливают противомикробную активность существующих антибиотиков, но и восстанавливают их бактерицидную активность. Синергетическое применение антибиотиков и металлических наночастиц продемонстрировало больше их потенциального противомикробного эффекта, чем их индивидуальное применение [7, 8]. Использование наночастиц с антибиотиками в качестве антибиотиков или ингибиторов оттока хорошо изучено [1, 9,10,11]. Металлические наночастицы широко используются для лечения инфекций в линиях клеток человека из-за их низкой цитотоксичности (зависит от концентрации), большой площади поверхности и широкого спектра антибактериальной активности [12,13,14]. Более того, совместное применение металлических наночастиц с антибиотиком снижает их концентрацию в виде дозировки лекарства и, следовательно, снижает токсичность обоих агентов для линий клеток человека [15]. В этом обзоре подчеркивается синергетическое применение наночастиц с антибиотиками в качестве антибиотиков, препятствующих образованию биопленок и ингибиторов оттока, в отношении чего были проведены обширные исследования для борьбы с инфекциями, вызываемыми патогенами MDR или EDR.

Наночастицы как ингибиторы оттока

Были проведены различные исследования для определения механизма действия наночастиц как бактерицидного агента. Однако еще предстоит решить несколько вопросов о механизме ингибирующего действия наночастиц на микроорганизмы. Один из возможных механизмов бактерицидной активности наночастиц связан с ингибированием оттока насосов. Banoee et al. в 2010 году показали новую ингибирующую роль наночастиц оксида цинка отводящего насоса в отводящих насосах NorA S. золотистый . Они обнаружили увеличение зоны ингибирования ципрофлоксацина на 27 и 22% в присутствии наночастиц оксида цинка в S. золотистый и Э. coli соответственно [16]. Впоследствии Падвал и др. в 2014 году предложили концепцию синергетического использования покрытых полиакриловой кислотой наночастиц оксида железа (магнетита) (PAA-MNP) с рифампицином против Mycobacterium smegmatis с акцентом на ингибирующую отток роль PAA-MNP. Они использовали слияние PAA-MNP и рифампицина в M. смегматис что привело к подавлению роста в четыре раза по сравнению с одним рифампицином. Это можно объяснить трехкратным увеличением накопления антибиотика внутри бактериальных клеток, что доказано исследованиями транспорта в реальном времени на обычном субстрате оттокного насоса, бромиде этидия [17].

Есть два возможных механизма, с помощью которых металлические наночастицы могут препятствовать работе отводящих насосов. Одним из возможных механизмов является прямое связывание металлических наночастиц с активным центром оттокных насосов, блокирование экструзии антибиотиков за пределы клеток. Металлические наночастицы могут здесь выступать в качестве конкурентного ингибитора антибиотика для сайта связывания оттокных насосов [18]. Другой возможный механизм - нарушение кинетики оттока. Влияние наночастиц серебра на нарушение кинетики оттока откачивающего насоса MDR, MexAM-OPrM, уже было исследовано в P. aeruginosa [19]. Можно предположить, что наночастицы металлов могут приводить к прекращению протонного градиента с последующим нарушением мембранного потенциала или потерей протонной движущей силы (PMF), что приводит к ухудшению движущей силы, необходимой для активности оттока [18, 20, 21]. Однако основным ограничением прямого связывания наночастиц с помощью откачивающих насосов является их небольшой размер и реакционная способность. Кроме того, наночастицы могут связываться с другими мембранными белками, а не просто взаимодействовать с насосами оттока, и из-за этого вероятность связывания наночастиц, в частности, с переносчиком оттока каждый раз во время воздействия, ограничена.

Christena et al. ранее в своих исследованиях показали, что наночастицы меди ингибируют отток на откачивающий насос NorA, частично из-за генерации ионов Cu (II) из наночастиц меди. Этот частичный эффект непосредственно от наночастиц меди может означать прямое взаимодействие наночастиц с откачивающими насосами, что подтверждает первую гипотезу, в то время как частичный эффект из-за высвобождения ионов Cu (II) может указывать на нарушение мембранного потенциала и нарушение работы откачивающих насосов, что подтверждает вторая гипотеза [9]. Чаттерджи и др. также выявили потерю мембранного потенциала E. coli клетки от –185 до –105 и –75 мВ после выращивания бактериальных клеток в присутствии наночастиц меди с концентрацией 3,0 и 7,5 мкг / мл соответственно в течение 1 ч [22]. Явный механизм ингибирующей отток роли наночастиц все еще остается загадкой и требует дальнейших исследований.

Наночастицы как средство против биопленки

Биопленка обеспечивает устойчивость к бактериям, но это сопротивление усиливается, если биопленка производится устойчивыми к лекарствам бактериями [23]. Многочисленные исследования показали огромную способность металлических наночастиц разрушать толстый барьер биопленки посредством различных способов воздействия [24,25,26,27]. Проникающая способность металлических наночастиц всегда остается полезным свойством для использования их против инфекций биопленок [28,29,30]. Это уникальное сочетание двух различных компонентов, наночастиц и антибиотика, проложило новый путь борьбы с биопленками, продуцирующими бактерии MDR или EDR.

Одно из красноречивых исследований было проведено Gurunathan et al. выяснить усиленный бактерицидный и антибиопленочный эффект различных антибиотиков с наночастицами серебра. Симбиотическое использование ампициллина и наночастиц серебра значительно усилило ингибирование биопленки у грамотрицательных и грамположительных бактерий на 70 и 55% соответственно, в отличие от примерно 20% ингибирования биопленки после обработки только наночастицами серебра. Точно так же совместное применение наночастиц серебра и ванкомицина приводит к ингибированию биопленки на 55 и 75% у грамотрицательных и грамположительных бактерий соответственно [10]. Эти результаты предполагают альтернативное использование наночастиц с антибиотиками для индукции ингибирования биопленки, открывая клинические возможности новой терапии.

Подобный эффект также наблюдался для наночастиц меди и наночастиц оксида цинка при использовании синергетически с антибиотиками. Согласно этому исследованию, объединение наночастиц меди и антибиотиков показало более эффективную антибиотикопленочную активность по сравнению с комбинацией наночастиц оксида цинка и антибиотика как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий. Это повышенное ингибирование с помощью наночастиц меди может быть связано с экструзией ионов Cu (II), генерируемых наночастицами. Наночастицы меди и наночастицы оксида цинка в сочетании со специфическим антибиотиком продемонстрировали усиленный антибиотический эффект в присутствии 2% глюкозы, выявляя усиленные связывающие взаимодействия между металлическими наночастицами и антибиотиком в присутствии глюкозы [9]. Покрытие металлических наночастиц углеводами может трансмогрифицировать взаимодействие наночастиц с клетками, клеточное поглощение и цитотоксичность [31].

Альянс между системами оттока и контролем кворума

Насосы оттока играют важную роль в передаче сигналов биомолекул от клетки к клетке, способствуя образованию биопленок. Одним из вероятных механизмов борьбы с лекарственной устойчивостью является использование ингибиторов оттокного насоса для блокирования механизма определения кворума, что в конечном итоге препятствует образованию биопленки. Уже было проведено несколько исследований, чтобы показать роль насосов оттока в определении кворума [23, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39]. Явная механистическая взаимосвязь между оттоком насосов и образованием биопленки до сих пор полностью не изучена. Одним из жизнеспособных оправданий может быть роль откачивающих насосов для выдавливания критически важных компонентов, необходимых для определения кворума. Этот функциональный аспект уже предлагался в более ранних исследованиях [40,41,42,43,44,45,46]. Нарушение экструзии сигнальной молекулы из-за применения ингибиторов эффлюксной помпы может повлиять на процесс восприятия кворума или передачу сигналов от клетки к клетке [47, 48] (рис. 1).

Использование металлических наночастиц в качестве ингибитора откачивающего насоса для предотвращения экструзии сигнальных молекул, воспринимающих кворум ( красный закрашенный кружок ) вне бактериальных клеток с помощью металлических наночастиц ( закрашенный желтый кружок ) для блокировки откачивающего насоса ( заполненный цилиндр ), что приводит к снижению связывания сигнальной молекулы с ее рецептором ( пустой цилиндр ) и препятствует образованию биопленок

Другим жизнеспособным оправданием может быть роль насосов для вывода токсичных побочных продуктов и отходов за пределы клеток. Быстро метаболизирующие клетки в биопленке могут полагаться на проводящую систему, чтобы вытеснить вредные и ненужные побочные продукты, возникающие в результате различных биохимических процессов, происходящих внутри бактериальных клеток [49]. Этот функциональный аспект также был предложен в исследовании, проведенном Kvist et al. в 2008 г. [50]. Использование ингибиторов откачивающего насоса для блокировки этой проводящей системы может привести к усилению накопления токсичных побочных продуктов внутри бактериальных клеток, что в конечном итоге приведет к снижению образования биопленок (рис. 2).

Использование металлических наночастиц в качестве ингибитора откачивающего насоса для предотвращения экструзии токсичных побочных продуктов биохимических реакций ( красный залитый кружок ) вне бактериальных клеток с помощью металлических наночастиц ( закрашенный желтый кружок ) для блокировки откачивающего насоса ( заполненный цилиндр ), что препятствует образованию биопленок

Некоторые исследования также предполагают, что оттокные насосы влияют на агрегацию клеток, трансмутируя свойства клеточных мембран и, в конечном итоге, влияя на образование биопленок [47]. Уже были проведены многочисленные исследования для определения эффекта наночастиц в сочетании с антибиотиками в качестве улучшенного антибактериального и противобиопленочного агента. В таблице 1 содержится сводка этих исследований.

Одно из недавних исследований, проведенных Barapatre et al., Выявило усиленную синергетическую антибактериальную и антибиотикопленочную активность наночастиц серебра в сочетании с амикацином, канамицином, окситетрациклином и стрептомициновым антибиотиком против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Наночастицы серебра были синтезированы путем ферментативного восстановления нитрата серебра с участием двух лигнин-разлагающих грибов, а именно Aspergillus flavus . и Emericella nidulans . Было предложено использовать наночастицы в качестве зонда с обычными антибиотиками для усиления антибактериальной и антибиотикопленочной активности против патогенных микробов [51]. Нарушение АТФ-зависимой функции, такой как ингибирование оттока насоса, было описано как один из потенциальных механизмов синергетического эффекта антибиотиков и металлических наночастиц [52].

В ряде отчетов успешно продемонстрировано применение наночастиц против двух различных механизмов устойчивости бактерий, а именно, насосов оттока МЛУ и образования биопленок, благодаря которым бактерии уклоняются от действия обычных антибиотиков. В этом обзоре представлен новый и многообещающий подход к использованию металлических наночастиц в синергии с антибиотиками в качестве ингибитора оттока и антибиотикопленочного агента для борьбы с устойчивостью к антибиотикам.

Выводы

В текущем сценарии существует потребность в инновационном подходе к борьбе с МЛУ-инфекциями. Насосы оттока играют двойную роль:одна - вытеснять антибиотики, а другая - способствовать образованию биопленки путем вытеснения биомолекул, важных для определения кворума, что в конечном итоге способствует вирулентности бактериальных патогенов. Блокировка насосов оттока MDR через наночастицы будет полезна в обоих направлениях; он блокирует отток антибиотика за пределы бактериальных клеток и, следовательно, усиливает действие обычных антибиотиков, а также блокирует отток кворум-чувствительных биомолекул и, следовательно, снижает способность бактериальных клеток образовывать биопленки. Такой подход снижает потребность в проведении новых исследований для изучения нового ингибитора оттокной помпы или нового антибиотика, но поощряет использование металлических наночастиц (используемых в качестве ингибитора отводящей помпы) в синергии с обычными антибиотиками. Это также поможет снизить стоимость, время и проблему цитотоксичности наночастиц в линиях клеток человека, которые могут выдерживать более низкую концентрацию металлических наночастиц. Это будет новый подход к нацеливанию насосов оттока, уменьшающий сигналы кворума, чтобы подавить образование биопленки.

Перспективы на будущее

Бактериальная эволюция привела к внедрению различных механизмов, направленных на обратное бактерицидное действие антибиотика и иммунной системы хозяина. Это приводит к возникновению инфекций с множественной лекарственной устойчивостью, что отражает острую необходимость в открытии новых подходов к борьбе с инфекциями МЛУ или ШЛУ. С появлением устойчивости к антибиотикам симбиотическое использование металлических наночастиц с обычными антибиотиками предлагает лучшую альтернативу для борьбы с устойчивостью к антибиотикам. Применение наночастиц в качестве ингибиторов оттока может иметь большое значение в двух различных направлениях, но в конечном итоге приводит к одному единственному результату, то есть борьбе с бактериальными инфекциями. Точный механизм действия наночастиц, блокирующих откачивающие насосы, еще предстоит изучить. Вероятно, что нарушение PMF может быть вероятным косвенным механизмом, с помощью которого наночастицы могут ингибировать отток. Одна из основных проблем этого подхода связана с реакционной способностью наночастиц, которая может заставить их связываться с другими мембранными белками, а не с белками-переносчиками оттока. Это можно преодолеть, приготовив целевые наночастицы, связав их с антифлюксными моноклональными антителами или лектинами. Это правильное запрещение откалибрует их для фокусировки на определенной местности. Другой серьезной проблемой может быть проблема токсичности при использовании этого подхода из-за большого отношения поверхности к объему наночастиц небольшого размера, которое необходимо оптимизировать перед окончательной валидацией.