Оптимизация предобработки для sp-ICP-MS: Раскрытие распределения наночастиц серебра в биологических тканях

Аннотация

Быстрое распространение инженерных наночастиц (ENP) повысило человеческую экспозицию, однако существующие аналитические инструменты не могут одновременно квантово определять и характеризовать ENP в биологических матрицах. Однопа́ртикулярная ИСП-МС (sp-ICP-MS) предлагает одновременную квантификацию и оценку физических свойств, но её применение к тканям ограничено неадекватными протоколами предобработки, которые могут изменять целостность частиц или снижать их восстановление. В работе систематически оценены пять растворителей: гидроксид натрия (NaOH), тетраметиламмоний гидроксид (TMAH), азотная кислота (HNO₃), соляная кислота (HCl) и протеиназа K, используя наночастицы серебра (nAg) как модель. Обработка NaOH обеспечивала >90% растворения ткани с сохранением размера частиц и минимизацией ионизации, превосходя другие реагенты. Расширение протокола NaOH на гомогенаты сердца, легких, селезенки и почек подтвердило его широкую применимость. Оптимизированная предобработка применена для оценки судьбы в/в введенных nAg и Ag⁺ в крови и печени мышей. sp-ICP-MS показал, что nAg оставались в основном частицами (~80%) в печени, но ионизировались (~95%) в кровотоке, тогда как Ag⁺ оставался ионным в обоих отсеках. Результаты демонстрируют, что предобработка NaOH обеспечивает точный sp-ICP-MS анализ ENP in vivo и подчеркивают важность частица-ион преобразования для биодистрибуции и кинетики.

Введение

Нанотехнологии ускорили производство инженерных наночастиц (ENP) <100 нм с уникальными преимуществами: повышенная проницаемость тканей и реактивные поверхности. Наночастицы серебра (nAg) широко используются в потребительских товарах и фармацевтике за счет устойчивого выделения Ag⁺ и проводимости. Однако те же наносвойства несут риски: нарушение гематоэнцефалического барьера, воспалительные реакции. Оценка опасности и экспозиции — ключ к риск-анализу ENP.

Хотя токсичность ENP изучена обширно, меньше работ посвящено квантованию реальной экспозиции. Недавние данные показывают разное внутриклеточное распределение nAg и Ag⁺ в культурах, что подчеркивает необходимость дифференциации частиц и ионов в тканях. Конвенциональная ICP-MS определяет общий металл, но не различает частицы и ионы, тогда как ТЭМ дает размер, но не количественность. Нужен метод, сочетающий точную квантификацию с анализом физических свойств дляucidation био-трансформации ENP.

sp-ICP-MS детектирует отдельные частицы, оценивая размер по интенсивности пика и концентрацию по частоте пиков, различая ионы через фоновый сигнал. Ранее sp-ICP-MS применяли к экологическим и коммерческим образцам, но в биологических тканях — ограничено из-за неадекватной предобработки, деградирующей ENP. Разные растворители по-разному лизируют ткани, восстанавливают ENP и сохраняют целостность. Это исследование оценивает и оптимизирует стратегии предобработки для sp-ICP-MS анализа nAg в тканях мышей, устанавливая надежный рабочий процесс для одновременной квантификации и характеристики ENP in vivo.

Материалы и методы

ENP

Biopure nAg 30, 70, 100 нм (nAg30, nAg70, nAg100) от nanoComposix (Сан-Диего, США). Стандарт RM8013 для калибровки транспортной эффективности от NIST (Гейтсберг, США). Все суспензии сонировали 10 мин перед использованием.

Реактивы

0.1 моль/л NaOH, 25% TMAH, 30% HCl, протеиназа K — Wako (Осака, Япония). 70% HNO₃ — Kanto Kagaku (Токио, Япония).

Животные

Самки мышей BALB/c (6 недель) от Japan SLC (Сидзуока, Япония). Содержание: 12-часовой свет/тьма, свободный доступ к еде и воде. Процедуры соответствовали этическим руководствам Осакского университета.

Измерение распределения размера частиц динамическим рассеянием света

nAg разбавляли в MilliQ до 10 мкг/мл Ag. 1 мл в капиллярную кювету (Malvern) анализировали на Zetasizer Nano-ZS (Malvern) для среднего диаметра и дзета-потенциала.

Измерение общей массы Ag

Общая концентрация Ag измеряли на Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies). Условия: RF 1550 Вт, поток Ar 1.05 л/мин, время пребывания 100 мс. Родий — внутренний стандарт. Измерения в триplicates.

Анализ sp-ICP-MS и расчеты

Тот же прибор: RF 1550 Вт, Ar 1.05 л/мин, dwell 10 мс, общее время 30 с. Расчет размера частиц — инструментом single-particle tool от RIKILT.

Критическая концентрация частиц для sp-ICP-MS

Стоковые растворы nAg (1.0 мг/мл) серийно разбавляли до 2000, 800, 700, 600 пг/мл, затем десятикратно — 40 концентраций для оценки sp-ICP-MS.

Оптимизация методов предобработки для печени мыши

Гомогенаты печени: ткань + ФСБ (w/v=1:10), гомогенизация. Каждый гомогенат засевали 100 нг/мл nAg, затем обрабатывали одним из реагентов (1:1 v/v): 0.1 М NaOH, 25% TMAH, 30% HCl, протеиназа K (10 U/мл в 0.01 M Tris-HCl, 0.01 M EDTA, 0.5% SDS). Инкубация 3 ч при 37 °C, остатки собирали, взвешивали, supernatanten разбавляли 500-кратно для sp-ICP-MS.

Оценка универсальности предобработки NaOH в различных органах

Сердце, легкие, селезенка, почки гомогенизировали в ФСБ (1:10), засевали 100 нг/мл nAg. Добавляли 1 М NaOH (1:1 v/v), инкубация 3 ч при 37 °C. Остатки взвешивали, supernatanten разбавляли 500-кратно для sp-ICP-MS.

Оценка количества и физических свойств nAg₁₀₀ и Ag⁺ в мышах после однократной в/в инъекции

nAg₁₀₀ и AgNO₃ разбавляли до 0.25 мг/мл (Ag⁺) в 5% глюкозе. Мыши получали в/в инъекции nAg₁₀₀ (1.5 или 0.75 мг/кг), AgNO₃ (1.5 или 0.75 мг/кг как Ag⁺) или 5% глюкозу (контроль). Через 24 ч забирали кровь и печень. Гомогенаты печени в ФСБ (1:10), затем обрабатывали TMAH или NaOH (1:1 v/v) для ICP-MS и sp-ICP-MS.

Результаты и обсуждение

Оптимизация детектирования частиц sp-ICP-MS

Точный sp-ICP-MS требует, чтобы не более одной частицы входило в плазму за время пребывания; иначе несколько частиц ошибочно суммируются как одно событие, завышая размер. Серийно разбавляли nAg₁₀₀ и строили детектированные vs теоретические счетчики частиц. При низких концентрациях — линейная зависимость, при высоких — меньше детектированных событий, чем ожидалось, указывая на мульти-частичное вмешательство (Рис. 1a). Вычитание детектированных из теоретических показало, что отклонения становятся значимыми, когда детектированные события превышают 500, устанавливая практический порог надежного анализа (Рис. 1b).

Валидация с nAg разного диаметра подтвердила, что настройки sp-ICP-MS дают точные размеры: измеренные диаметры 30.0 ± 1.2 нм, 65.1 ± 0.6 нм, 97.4 ± 0.6 нм для nAg30, nAg70, nAg100 соответственно. DLS (36.4 ± 1.6 нм, 70.6 ± 1.7 нм, 101 ± 1.0 нм) тесно совпали с sp-ICP-MS, подтверждая протокол.

Оптимизация методов предобработки для детектирования nAg в печени мыши

Эффективная предобработка должна лизировать ткань, восстанавливать ENP без изменения физико-химического состояния, избегать ионизации или аггрегации. Сравнили пять растворителей — NaOH, TMAH, HNO₃, HCl, протеиназа K — на гомогенатах печени с засевом 100 нг/мл nAg.

Анализ остатков: NaOH, TMAH, протеиназа K растворяли >90% матрицы печени, тогда как HNO₃ и HCl — только ~75% (Рис. 2a). Учитывая, что ~80% ткани — вода, низкое растворение кислотными реагентами указывает на неполное удаление матрицы.

Данные sp-ICP-MS на восстановление: кислотные обработки полностью ионизировали nAg, протеиназа K — частично. Напротив, NaOH и TMAH сохраняли nAg как целые частицы с пренебрежимым ионным сигналом (Рис. 2b). Анализ распределения размера: TMAH вызывал сдвиг с 100 нм на 120 нм и расширение распределения (Рис. 2c-d), указывая на аггрегацию. NaOH сохранял исходные 100 нм (Рис. 2c-d), подтверждая пригодность.

Склонность TMAH увеличивать диэлектрическую постоянную при разложении на триметиламин и метанол может снижать дзета-потенциал nAg, способствуя аггрегации. Кратковременное (1 мин) воздействие TMAH сохраняло размер (~100 нм), подтверждая, что длительная обработка вызывает аггрегацию.

Оценка универсальности предобработки NaOH в различных органах

Для подтверждения широкой применимости протокола применили к гомогенатам сердца, легких, селезенки, почек с засевом nAg. Анализ остатков показал >95% растворения (Рис. 3a). sp-ICP-MS детектировал добавленное Ag как частицы во всех тканях, с восстановлением 80–120% (приемлемо по FDA) (Рис. 3b). Диаметры частиц оставались близки к 100 нм во всех органах (Рис. 3c-d), подтверждая последовательность метода.

Данные подтверждают, что предобработка NaOH обеспечивает надежную, воспроизводимую платформу для квантификации и характеристики nAg в различных животных тканях через sp-ICP-MS.

Оценка sp-ICP-MS для количественного и физико-свойственного анализа nAg и Ag⁺ в биологических тканях

Для демонстрации практической значимости сравнили судьбу в/в введенных nAg₁₀₀ и Ag⁺ в крови и печени мышей. ICP-MS подтвердил наличие Ag в обоих отсеках для обоих вариантов (Рис. 4a,b). Однако sp-ICP-MS выявил отличную специацию: в крови Ag преимущественно как ионы (>95%) независимо от формы введения, в печени ~80% Ag от nAg₁₀₀ оставались частицами, при введении Ag⁺ частиц почти не было (Рис. 4c,d). Анализ размера частиц в печени nAg₁₀₀ показал средний диаметр ~80 нм, меньше введенных 100 нм, отражая частичную ионизацию и возможную трансформацию в печеночной ткани (Рис. 4e).

Заключение

Установлен оптимизированный протокол предобработки NaOH, позволяющий точный sp-ICP-MS анализ наночастиц серебра в тканях мышей с одновременной квантификацией и характеристикой размера. Применение к в/в введенным nAg₁₀₀ и Ag⁺ показало, что nAg частично ионизируются in vivo: ~80% остаются частицами в печени, ~95% ионизируются в кровотоке. Результаты подчеркивают важность учета частица-ион конверсии при оценке биодистрибуции и кинетики ENP. Метод широко применим к разнообразным тканям и может использоваться в риск-оценке дляucidation динамики экспозиции ENP и биологических ответов.

Аббревиатуры

Ag

Серебро

Ag⁺

Серебряный ион

DLS

Динамическое рассеяние света

ENPs

Инженерные наночастицы

HCl

Соляная кислота

HNO₃

Азотная кислота

ICP-MS

Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой

nAg

Наночастицы серебра

nAg₁₀₀

100 нм nAg

nAg₃₀

30 нм nAg

nAg₇₀

70 нм nAg

NaOH

Гидроксид натрия

PBS

Фосфатно-буферный раствор

sp-ICP-MS

Однопа́ртикулярная ICP-MS

TEM

Трансляционная электронная микроскопия

TMAH

Тетраметиламмоний гидроксид