Оптимизация и оценка метода предварительной обработки для sp-ICP-MS для выявления распределения наночастиц серебра в организме

Введение

Недавний прогресс в нанотехнологиях ускорил разработку инженерных наночастиц (ENP), размер которых меньше 100 нм. Благодаря своим полезным свойствам, таким как повышенная проницаемость тканей и поверхностная реакция по сравнению с другими материалами микро- или большего размера, ENP широко используются в различных продуктах, включая косметику, продукты питания и лекарства [1, 2]. Например, наночастицы серебра (nAg), одни из наиболее распространенных ENP, используются в антибиотиках из-за их постоянного высвобождения Ag ⁺ . Более того, они используются в качестве проводящих материалов в технологии печатной электроники [3]. Напротив, уникальные физико-химические свойства, связанные с малым размером частиц nAg, могут быть опасными. Известно, что эти частицы могут нарушать гематоэнцефалический барьер и вызывать воспаление [4]. Более широкое использование ЕПС в продуктах повседневного употребления привело к тому, что люди столкнулись с различными типами ЕПС. Их дальнейшее использование необходимо оценить, чтобы определить их безопасность [2, 3].

Для обеспечения безопасности необходимо понимать «риск» ENP, который представляет собой интегральную концепцию «опасности» (потенциальной токсичности) и «условия воздействия». В то время как опасности ЕПС были проанализированы во всем мире, лишь немногие исследования изучали ситуации воздействия ЕПС [5]. Кроме того, недавно сообщалось, что внутриклеточное распределение nAg, включенного в культивируемые клетки, отличается от распределения Ag ⁺ [6] и что Ag ⁺ частицы в тканях мыши [7]. Следовательно, необходимо оценивать их физические свойства, такие как размер частиц, и различать частицы и ионы в организме [3, 6,7,8].

Используя доступные в настоящее время аналитические технологии, сложно количественно проанализировать физические свойства ENP в организме. Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) подходит для количественного анализа, но не для анализа физических свойств, поскольку все мишени, такие как ионы и частицы, не могут быть различимы во время количественного определения. Напротив, просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) подходит для анализа физических свойств, но не для количественной оценки ENP, поскольку наблюдается только часть ткани. Следовательно, необходим новый метод для одновременного анализа физических свойств и количественного анализа ENP для изучения их биотрансформации.

МС-ИСП с одиночными частицами (sp-ICP-MS), который основан на ИСП-МС, вводит одну или не вводит частицы в анализатор за время пребывания и является привлекательным методом определения размеров частиц путем анализа пиковой интенсивности и концентраций частиц путем анализа. пиковые ставки. Частицы и ионы можно различить, анализируя пиковые и фоновые сигналы [9]. В нескольких предыдущих исследованиях сообщалось об использовании sp-ICP-MS для количественной оценки и анализа физических свойств ENP [10, 11].

Однако в большинстве этих исследований использовалась sp-ICP-MS для анализа воды в окружающей среде или коммерческих продуктов, содержащих ENP [10, 11], а в нескольких исследованиях использовалась sp-ICP-MS для биологических тканей. Кроме того, в этих исследованиях ткани предварительно обрабатывали расщеплением протеиназой K или гидроксидом тетраметиламмония (TMAH) для солюбилизации белков и липидных матриц. Поскольку разные реагенты обладают разными солюбилизирующими свойствами, вариации в методах предварительной обработки могут влиять на скорость восстановления ENP, распределенных в тканях. Кроме того, важно, чтобы метод предварительной обработки не влиял на размер или ионные свойства ENP и эффективно восстанавливал ENP, распределенные в тканях.

В этом исследовании мы оценили и оптимизировали различные методы предварительной обработки для sp-ICP-MS в биологических образцах, чтобы определить количество и физические свойства ENP в организме, используя nAg в качестве модели ENP.

Материалы и методы

ЕПС

30, 70 и 100 нм «Biopure» nAg (nAg30, nAg70 и nAg100) были получены от nanoComposix (Сан-Диего, Калифорния, США). RM8013 использовался в качестве стандарта для расчета эффективности транспортировки и был получен от Национального института стандартов и технологий (Гейтерсбург, Мэриленд, США). Каждый тип ENP перед использованием подвергался ультразвуковой обработке в течение 10 минут.

Реагенты

Растворы 0,1 моль / л гидроксида натрия (NaOH), 25% TMAH, 30% соляной кислоты (HCl) и протеиназы K были получены от Wako (Осака, Япония). Раствор 70% азотной кислоты (HNO ₃ ) был получен из Канто Кагаку (Токио, Япония).

Животные

Мышей BALB / c (самки, 6 недель) были приобретены в Japan SLC (Сидзуока, Япония). Мышей помещали в комнату с 12-часовым циклом свет / темнота (свет включается в 8:00 и выключается в 20:00). Еда и вода предоставлялись без ограничений. Протоколы экспериментов соответствовали этическим принципам Университета Осаки, Япония.

Измерение распределения размеров частиц с помощью динамического рассеяния света

nAg разбавляли водой milliQ до конечной концентрации серебра (Ag) 10 мкг / мл. Затем капиллярную ячейку размера и дзета (Malvern Instruments, Malvern, UK) наполнили 1 мл раствора для измерения распределения частиц и среднего диаметра с помощью Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments).

Измерение общей массы Ag

Для измерения общей концентрации Ag в образцах использовали Agilent 7700x (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Условиями анализа были ВЧ мощность 1550 Вт, газ-носитель 1,05 л / мин Ar, время выдержки 100 мс. Измерения повторяли трижды в режиме МС. Был использован метод внутреннего стандарта, а родий использовался в качестве внутреннего стандарта для Ag. Целевые элементы анализа ICP-MS были ¹⁰³ Rh и ¹⁰⁷ Ag. Стандартные растворы серебра и родия были получены от Wako (Осака, Япония).

Анализ sp-ICP-MS и его расчет

Для анализа sp-ICP-MS мы использовали Agilent 7700x (Agilent Technologies; Санта-Клара, Калифорния, США), аналогичный анализу общего Ag. Условия анализа были следующими:ВЧ мощность 1550 Вт, газ-носитель 1,05 л / мин Ar, время выдержки 10 мс и время анализа 30 с. Для расчета размера частиц использовались инструменты расчета отдельных частиц, опубликованные RIKILT [12].

Критическая концентрация частиц для sp-ICP-MS

Концентрация исходного раствора нАг составляла 1,0 мг / мл, который использовали для приготовления растворов 2000, 800, 700 и 600 пг / мл. Затем каждый из этих растворов последовательно разбавляли в 10 раз, чтобы получить 40 различных растворов нАг. Мы определили концентрацию частиц в этих 40 образцах методом sp-ICP-MS.

Оптимизация методов предварительной обработки печени мыши

Печень, собранную у мышей, смешивали с фосфатно-солевым буфером (PBS) ( w / v соотношение 1:10), а затем гомогенизировали. Гомогенат смешивали с раствором нг / мл нАг. Затем смесь обрабатывали одним из следующих реагентов при v / v соотношение 1:1 - 0,1 моль / л раствора NaOH, 25% ТМАГ, 30% HCl или раствора протеиназы К (10 ед / мл протеиназы К, 0,01 М трис-HCl, 0,01 М ЭДТА и 0,5% ДСН). Образцы инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C, остатки собирали и взвешивали. Супернатанты разбавляли в 500 раз и анализировали с помощью sp-ICP-MS.

Оценка универсальности предварительной обработки NaOH в различных органах

Сердце, легкие, селезенки и почки, взятые у мышей, смешивали с PBS ( w / v соотношение 1:10), гомогенизировали и смешивали с нАг 100 нм / мл. Затем раствор NaOH 1 моль / л при v / v соотношение 1:1 добавляли и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. После инкубации остатки собирали и взвешивали. Супернатанты разбавляли в 500 раз и анализировали с помощью sp-ICP-MS.

Оценка количества и физических свойств nAg100 и Ag ⁺ у мышей после однократного внутривенного введения

Для внутривенного введения nAg100 и AgNO ₃ были разбавлены до 0,25 мг / мл (как Ag ⁺ ) с 5% раствором глюкозы. Мышам BALB / c внутривенно вводили nAg100 (1,5 или 0,75 мг / кг), AgNO ₃ (1,5 или 0,75 мг / кг в виде Ag ⁺ ), либо 5% раствор глюкозы (контроль). Через 24 ч собирали кровь и печень умерщвленных мышей. Печень смешивали с PBS ( w / v соотношение 1:10) и гомогенизировали. Гомогенаты крови и печени смешивали с раствором ТМАГ ( v / v соотношение 1:1) и с раствором NaOH ( v / v соотношение 1:1) соответственно. Эти образцы были проанализированы с помощью ICP-MS для измерения концентраций Ag и sp-ICP-MS для оценки физических свойств, таких как размер частиц и различие между частицами и ионами.

Результаты и обсуждения

Оптимизация обнаружения частиц с помощью sp-ICP-MS

При sp-ICP-MS анализе важно вводить одну частицу или не вводить ни одной частицы в детектор за время пребывания. Если несколько частиц вводятся в детектор в течение времени пребывания, общая масса нескольких частиц рассматривается как масса одной частицы [13]. Следовательно, образцы должны быть достаточно разбавлены для анализа sp-ICP-MS. Напротив, sp-ICP-MS анализ образца с очень низкой концентрацией ENP приводит к неточным данным о распределении частиц и размерах.

Чтобы определить взаимосвязь между концентрацией nAg100 и количеством обнаруженных частиц, мы серийно разводили исходные растворы nAg100 для оценки с помощью sp-ICP-MS. Результат показал, что количество обнаруженных частиц увеличивалось теоретически и линейно в области относительно более низких концентраций Ag. Напротив, при относительно более высоких концентрациях Ag количество обнаруженных частиц было ниже теоретического значения (рис. 1а). Эти данные показали, что при более высоких концентрациях Ag в детектор имеет тенденцию попадание множества частиц в течение каждого времени выдержки, что приводит к завышению размера частиц. Таким образом, необходимо определить наибольшее количество обнаруженных частиц, которые не отличаются от теоретического значения, чтобы точно оценить размеры частиц. Затем мы вычли количество обнаруженных частиц из теоретического значения и отложили разницу по вертикальной оси. Результаты показали, что расхождения в оценке размера произошли, когда количество обнаруженных частиц было> 500. Это говорит о том, что необходимо обнаружить ≤ 500 частиц во время анализа (рис. 1b). Хотя эти данные были получены в одном испытании, повторение эксперимента дало те же результаты (данные не показаны).

Определение оптимального количества частиц за время пребывания для точного анализа sp-ICP-MS. Ряд растворов нАг (от 600 до 2500 пг / мл) анализировали с помощью sp-ICP-MS. а Чтобы определить взаимосвязь между концентрацией nAg100 и количеством обнаруженных частиц, была построена кривая для обнаруженных частиц (сплошная линия) и теоретические значения (пунктирная линия). б Количество обнаруженных частиц, вычтенное из теоретического значения, наносили на вертикальную ось, чтобы определить оптимальное количество частиц. Каждый балл является результатом одного испытания ( n =1)

Чтобы проверить условия анализа, мы разводили nAg разного диаметра (nAg30, nAg70, nAg100) для обнаружения <500 частиц за время анализа и оценивали их диаметры. Анализ sp-ICP-MS показал, что первичные диаметры nAg30, nAg70 и nAg100 составляли 30,0 ± 1,2, 65,1 ± 0,6 и 97,4 ± 0,6 соответственно. Более того, гидродинамические диаметры, определенные методом динамического рассеяния света (DLS), составили 36,4 ± 1,6, 70,6 ± 1,7 и 101 ± 1,0 соответственно, эти значения аналогичны оценкам с помощью sp-ICP-MS. Эти данные свидетельствуют о том, что условия sp-ICP-MS подходили для измерения диаметра наночастиц различных размеров.

Оптимизация методов предварительной обработки для обнаружения nAg в тканях печени мыши

Для количественной оценки и определения физических свойств ENP в организме необходимо полностью лизировать ткани. Кроме того, важно эффективно восстанавливать частицы и ионы, распределенные в организме, не вызывая каких-либо физических или химических изменений в частицах. Мы протестировали пять солюбилизирующих реагентов:NaOH, TMAH, HNO ₃ . , HCl или протеиназу K, и проанализировали количество и физические свойства с помощью sp-ICP-MS для оптимизации стратегий предварительной обработки с использованием печени в качестве модели [14,15,16,17,18].

Гомогенат печени смешивали с nAg100 для получения конечной концентрации Ag 100 нг / мл с последующей обработкой каждым солюбилизирующим реагентом при 37 ° C. Во-первых, мы оценили количество остатков ткани как показатель растворимости ткани. Более 90% ткани было растворено обработкой NaOH, TMAH и протеиназой K, в то время как только 75% ткани было растворено HNO ₃ и обработка HCl (рис. 2а). Учитывая, что почти 80% ткани состоит из воды [19], HNO ₃ Обработка HCl и PBS была неэффективной для растворения нерастворимого тканевого матрикса. Напротив, обработка NaOH, TMAH и протеиназой K эффективно растворяла нерастворимый матрикс тканей, что указывает на их пригодность для точного количественного определения nAg в ткани. Затем мы проанализировали скорость восстановления каждой частицы и иона, чтобы оценить изменение физических свойств при каждой обработке. Анализ Sp-ICP-MS показал, что nAg100 был почти полностью ионизирован обработкой кислыми реагентами (HNO ₃ и HCl) и частично ионизируется при обработке протеиназой K. Это предполагает, что кислотные реагенты и протеиназа K растворяют частицы и превращают их в ионы. Напротив, 100 нг / мл Ag, что соответствует первоначально добавленному количеству, было обнаружено в виде частиц, когда ткань обрабатывалась щелочными реагентами (NaOH и TMAH). После щелочной обработки почти не было обнаружено ионов (рис. 2b), что указывает на то, что NaOH и TMAH сохраняют физические свойства nAg. Наконец, мы оценили распределение диаметров частиц в тканях, обработанных различными реагентами, чтобы детально проанализировать физические свойства. Средний диаметр частиц изменился со 100 нм до 120 после обработки ТМАГ (рис. 2с). Кроме того, частицы были шире после обработки ТМАГ (рис. 2d), что указывает на агрегацию частиц. Напротив, когда ткани обрабатывали NaOH, средний диаметр частиц был близок к 100 нм, что соответствует исходному размеру частиц. Это говорит о том, что предварительная обработка NaOH является оптимальным условием для обнаружения nAg100 в тканях печени мыши.

Предварительная обработка NaOH является оптимальным методом обнаружения nAg100 в печени мышей. Пять солюбилизирующих реагентов были проверены как растворители для предварительной обработки для лизирования тканей (NaOH, TMAH, HNO ₃ , HCl и протеиназа K). Гомогенат печени смешивали с раствором nAg100 для получения конечной концентрации Ag 100 нг / мл и обрабатывали каждым солюбилизирующим реагентом при 37 ° C. Через 3 часа a уровень остатков в каждой группе как показатель растворимости ткани, b скорость восстановления (черные и белые полосы представляют собой скорость обнаружения серебра как частицы и как ионы, соответственно), c средний диаметр частиц показан на гистограмме, и d Гранулометрический состав, показанный на диаграмме отогрева пчел, анализировали методом sp-ICP-MS. Результаты выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3)

Предварительная обработка ТМАГ широко использовалась для анализа sp-ICP-MS в различных исследованиях. TMAH может вызывать агрегацию nAg100 в зависимости от различных физических свойств, таких как вязкость и pH. Кроме того, диэлектрическая проницаемость может быть связана с агрегацией. Обработка ТМАГ в течение 3 часов может увеличить диэлектрическую проницаемость, вызванную разложением ТМАГ на триметиламин (ТМА) и метанол [20]. Увеличение диэлектрической проницаемости приводит дзета-потенциал nAg100, который обратно пропорционален диэлектрической проницаемости, почти до нуля, что приводит к потере электростатического отталкивания между nAg и индукцией агрегации. Обработка nAg100 ТМАГ в течение короткого времени (1 мин) привела к получению среднего размера частиц примерно 100 нм (данные не показаны).

Оценка универсальности предварительной обработки NaOH в различных органах

Чтобы оценить универсальность предварительной обработки NaOH для обнаружения nAg, мы обработали различные органы мыши (сердце, легкие, почки и селезенку) NaOH и провели sp-ICP-MS для обнаружения частиц. Во-первых, мы оценили количество остатков ткани как показатель растворимости ткани. Солюбилизация тканей более 95% была достигнута обработкой NaOH (рис. 3а). Более того, Ag, соответствующий количеству добавки, был обнаружен в виде частиц (рис. 3b). Хотя некоторые показатели выздоровления превышали 100%, согласно критериям Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США показатель выздоровления 80–120% является достаточно надежным [21]. Таким образом, наш анализ надежен. Кроме того, средний диаметр частиц nAg, обнаруженный в любом органе, был близок к 100 нм, что соответствует размеру частиц добавленного nAg (рис. 3c, d). Эти исследования показывают, что предварительная обработка NaOH идеально подходит для обнаружения nAg не только в печени мыши, но и в сердце, легких, почках и селезенке мыши.

Предварительная обработка NaOH - оптимальный метод обнаружения nAg100 в различных органах. Как показано на фиг. 2, гомогенаты сердца, почек, легких и селезенки смешивали с nAg100 и инкубировали с раствором NaOH. Через 3 часа a уровни остатков (черные и белые столбцы представляют собой уровни остатков при обработке NaOH или PBS, соответственно), b скорости восстановления (черные и белые полосы представляют собой скорость обнаружения Ag в виде частиц и ионов, соответственно), c средний диаметр частиц, показанный на диаграмме пчелиного тепла, и d Гранулометрический состав, показанный на диаграмме пчелиного тепла, анализировали методом sp-ICP-MS в каждом образце ткани. Результаты выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3)

Взятые вместе, наши результаты демонстрируют, что предварительная обработка NaOH является оптимальной стратегией предварительной обработки для количественной оценки и анализа физических свойств nAg в тканях животных с помощью sp-ICP-MS.

Оценка sp-ICP-MS для количественного и физического анализа свойств nAg и Ag ⁺ в биологических тканях

nAg ионизируется в организме или что Ag ⁺ частицы в ткани мыши, хотя детали этого процесса неясны. Поэтому мы оценили практическое применение sp-ICP-MS путем анализа количества и физических свойств Ag в крови и печени мышей после однократного внутривенного введения nAg100 или Ag ⁺ . Анализ ICP-MS показал, что Ag был обнаружен в крови как Ag ⁺ - и мышей, получавших nAg100 (рис. 4а). Более того, Ag был обнаружен в печени обеих групп (рис. 4б). Затем мы проанализировали физические свойства Ag в каждом образце. Поскольку в крови обоих Ag ⁺ было обнаружено небольшое количество nAg - и у мышей, получавших nAg100, наиболее детектируемый Ag находился в ионной форме (рис. 4c). В образцах печени примерно 80% Ag было обнаружено в виде частиц у мышей, обработанных nAg100, в то время как небольшое количество nAg было обнаружено в Ag ⁺ -обработанных мышей (рис. 4d). Наконец, мы оценили размер частиц в печени мышей, обработанных nAg100, с помощью sp-ICP-MS, который показал, что размер частиц составлял приблизительно 80 нм (рис. 4e). Эти данные позволяют предположить, что Ag ⁺ вводимый в кровь практически не превращается в частицы, а физические свойства Ag ⁺ в крови и печени не изменились. Напротив, введенный в кровь nAg100 был частично ионизирован; 20% Ag в печени и большая часть Ag в крови находились в ионной форме. В результате частичной ионизации средний диаметр nAg в тканях печени был меньше, чем у первоначально введенных частиц (80 против 100 нм). Следовательно, применимая стратегия sp-ICP-MS нашего биологического образца показала, что введенный в кровь nAg100 распределялся в виде частиц (примерно 80%) в печени и в виде ионов (примерно 95%) в крови, в то время как метод ICP-MS мог оценивать только количество Ag, а не физические или химические изменения в частицах.

Одновременная количественная оценка и анализ физических свойств вводимых внутривенно nAg100 и Ag ⁺ . nAg100 и Ag ⁺ вводили мышам внутривенно (0,75 или 1,5 мг / кг). Через 24 часа у них были взяты печень и кровь. Все образцы были предварительно обработаны раствором NaOH. Концентрация Ag в a кровь и б печень были измерены с помощью ICP-MS. nAg в c кровь и д печень измеряли с помощью sp-ICP-MS. Средний диаметр частиц, обнаруженных в печени, показан на e . . Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка ( n =3)

Выводы

Мы определили оптимальные условия предварительной обработки для sp-ICP-MS анализа nAg в биологических тканях, что позволяет одновременно количественно определять и анализировать физические свойства ENP в тканях животных. Мы также разработали метод sp-ICP-MS, подходящий для оценки биологических образцов, и продемонстрировали его применимость, оценив изменение физических свойств nAg100 в печени и крови. Мы также показали, что частичное изменение формы частиц на ионную форму nAg100, вводимого мышам, влияло на их кинетику и распределение. Этот метод может быть применен в анализе рисков ENP путем оценки условий воздействия ENP, выяснения биологических реакций на ENP и определения механизмов, лежащих в основе этих ответов.

Доступность данных и материалов

Совместное использование данных не применимо к этой статье, так как в ходе текущего исследования наборы данных не создавались и не анализировались.

Сокращения

Ag:

Серебро

Ag ⁺ :

Ион серебра

DLS:

Динамическое рассеяние света

ENPs:

Разработанные наночастицы

HCl:

Соляная кислота

HNO ₃ :

Азотная кислота

ICP-MS:

Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой

nAg:

Наночастицы серебра

nAg100:

100 нм нАг

nAg30:

30 нм нАг

nAg70:

70 нм нАг

NaOH:

Гидроксид натрия

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

sp-ICP-MS:

ИСП-МС с одиночными частицами

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

TMAH:

Гидроксид тетраметиламмония