Лазерное осаждение MAPLE антител-функционализированных нанчастиц с верхней конвертацией улучшает культивирование клеток

Аннотация

Высокопроизводительный субстрат для культивирования клеток опирается на оптимальную поверхность, поддерживающую функцию и коммуникацию клеток. Недавние работы показывают, что наноструктурные покрытия могут улучшать адгезию клеток, однако обычные растворные методы часто вводят загрязнения. Матрично-вспомогательное пульсирующее лазерное испарение (MAPLE) предлагает чистый, неразрушающий путь осаждения биополимеров на различные подложки. В этом исследовании мы синтезировали нанчастицы с верхней конвертацией (UCNP) NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ и их функционализированные иммуноглобулин-G (IgG) аналоги однокамерным методом. UCNP имеют средний диаметр 50±8 нм, TEM-изображения подтверждают наличие IgG на их поверхности. Используя 532-нм Nd:YAG лазер (10 Гц), мы осаждали UCNP с и без IgG на стеклянные культуральные чашки Petri методом MAPLE. Затем посеяли человеческие пуповинные эндотелиальные клетки (HUVEC) на этих подложках и сравнили с желатином-покрытым стеклом. Тесты живучести не выявили цитотоксичности, морфологический анализ показал улучшенную адгезию и пролиферацию на обоих UCNP-покрытых поверхностях. Эти результаты демонстрируют, что MAPLE-осажденные антител-функционализированные UCNP могут служить биосовместимыми высокопроизводительными покрытиями для приложений в культивировании клеток.

Введение

Эпителиальные клетки выстилают внутренние и внешние поверхности тела, играя двойную роль физического барьера и активного участника физиологических процессов: барьерная функция, сигнализация, иммунная защита. В тканевой инженерии взаимодействие клеток с поверхностью субстрата критически определяет адгезию, морфологию и функцию клеток. Традиционные белковые покрытия — коллаген, желатин, фибronectin — давно используются для улучшения адгезии на стекле или пластике. Недавние достижения показывают, что наноструктурные покрытия могут модулировать поведение клеток, предоставляя топографические сигналы и увеличивая эффективную площадь поверхности, тем самым улучшая адгезию и пролиферацию.

Нанчастицы с верхней конвертацией (UCNP), легированные ионами лантаноидов, такие как NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺, демонстрируют эффективное NIR-возбуждение и видимое или NIR-излучение, предлагая преимущества для глубокой визуализации тканей и биосенсинга благодаря низкой фототоксичности и высокой фотстабильности. Поверхностная функционализация UCNP биомолекулами — авидин, ДНК, антитела — позволила таргетированную визуализацию, сенсирование и маркировку клеток. Однако ограниченные работы исследовали антител-функционализированные UCNP как поверхностные покрытия для культивирования клеток.

Конвенциональные методы осаждения (соль-гель, спин-коутинг, дип-коутинг) страдают от неконтролируемой толщины, остаточных растворителей и потенциальной денатурации биомолекул. MAPLE обходит эти проблемы, заключая целевой материал в замороженную матрицу растворителя; лазерная энергия поглощается матрицей, что приводит к мягкому переносу материала на подложку без прямой абляции биомолекулы. MAPLE применялся в доставке лекарств, органической электронике и биомедицинских покрытиях, но его влияние на субстраты для культивирования клеток остается недостаточно изученным.

В этой работе мы сообщаем о синтезе NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ UCNP и их IgG-функционализированных аналогов, за которым следует MAPLE-осаждение на стеклянные культуральные чашки. Затем оцениваем биосовместимость и влияние на поведение HUVEC, закладывая основу для будущих приложений в тканевой инженерии.

Методы/Эксперимент

Материалы

Все реактивы аналитического grades: Gd(NO₃)₃·6H₂O (99,9 %), Yb(NO₃)₃·5H₂O (99,9 %), Er(NO₃)₃·5H₂O (99,9 %), NaF (≥99 %), разветвленная полиэтиленimine (PEI, Mw≈800), анти-человеческий IgG (Fab-специфичный, FITC-маркированный), DAPI, Фаллоидин-TRITC, растворители (этиленгликоль, изопропанол). Материалы приобретены у Sigma-Aldrich, Fisher Scientific, Caledon.

Синтез UCNP с и без IgG однокамерным процессом

UCNP (NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺) синтезировали модифицированным гидротермальным методом. Кратко: 720 мг Gd(NO₃)₃·6H₂O, 170 мг Er(NO₃)₃·5H₂O, 160 мг Yb(NO₃)₃·5H₂O и 20 мл этиленгликоля смешивали в трехшейном колбе. Добавляли 0,7 г PEI, затем капельно вводили 336 мг NaF, растворенного в 10 мл этиленгликоля. Смесь нагревали до 200 °C под азотом и рефлюксировали 6 часов. Продукт центрифугировали, вымывали этанолом и водой, сушили при 60 °C.

Для IgG-функционализации 15 мг порошка UCNP диспергировали в 15 мл дистиллированной воды, добавляли 5 мл боратно-буферного салиного раствора (pH 8) и 20 мкг IgG. Смесь перемешивали при комнатной температуре 2 часа, затем вымывали и центрифугировали. Конъюгат UCNP-IgG хранили в водном буфере.

Осаждение UCNP с/без IgG методом MAPLE

MAPLE-осаждение выполняли на системе MAPLE 2000 (PVD Products, Inc.) с 532-нм Nd:YAG лазером. Раствор нанчастиц (1 вес.% в изопропаноле) замораживали в жидком азоте в держателе мишени. Параметры лазера: 10 Гц, 200 мкс длительность импульса, 150 мДж/см² флюенс, площадь пятна 0,63 см². Стеклянные подложки, предварительно покрытые 2 вес.% желатином, размещали на расстоянии 4,5 см от мишени и поддерживали при 25 °C под давлением 1×10⁻⁶ Торр. Держатели мишени и подложки вращались со скоростью 10 и 25 об/мин соответственно в течение 2-часового осаждения. Полученные пленки характеризовали EDX, FTIR и фотолюминесценцией (PL).

Характеризация материалов

UCNP и UCNP-IgG до осаждения изучали передаточной электронной микроскопией (TEM, Philips CM-10, 80 кВ). FTIR-спектры записывали на Bruker Vector 22 (600–4500 см⁻¹, разрешение 4 см⁻¹, 64 сканирования). PL-спектры измеряли спектрофлюорометром QuantaMaster 40 (Horiba). После осаждения пленки инспектировали EDX (Hitachi S-3400 N с INCA PentaFET-x3) и конфокальной микроскопией (Zeiss LSM 5 Duo). Цитокомпатибельность оценивали MTT-тестом на HUVEC, культивированных 24 часа.

Изучение поведения клеток

HUVEC (ATCC) посеяли ~1×10⁵ клеток на чашку на стеклянных подложках (контроль желатин, UCNP, UCNP-IgG). После 24-часовой инкубации при 37 °C клетки фиксировали 4% формалином, окрашивали Фаллоидином-TRITC (актин) и DAPI (ядра), визуализировали конфокальной микроскопией. Площадь клетки, длина связей, длина клетки и количество клеток kvantифицировали с помощью ImageJ.

Цитотоксичность

MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) добавляли в среду после 24 часов, инкубировали 3 часа, абсорбцию измеряли при 490 нм на ридере Bio-Tek EL340I. Эксперименты проводили в трипликате.

Результаты и обсуждение

Характеризация UCNP и UCNP-IgG до MAPLE-осаждения

TEM подтверждает кубическую морфологию UCNP со средним диаметром 50±8 нм. HRTEM показывает межплоскостное расстояние 0,312 нм, соответствующее плоскости (111) кубического NaGdF₄ (JCPDS 27-0697). После конъюгации с IgG размер частиц увеличивается до 54±8 нм, антителный слой (~10±5 нм) виден как периферийное ореоле (рис. 3b).

Порошковый XRD показывает характерные пики при 32°, 37°, 54°, 65° (111, 200, 220, 311), подтверждающие кубическую фазу (рис. 4).

FTIR-спектры показывают аминовые пики (1515, 1511 см⁻¹) от PEI и IgG, растяжения –CH₂–/C-C (2987, 2900, 1400 см⁻¹), карбоксильные и амидные полосы (1249, 1650 см⁻¹), подтверждающие прикрепление IgG (рис. 5).

Характеризация UCNP после MAPLE-осаждения

EDX-маппинг стеклянных подложек, покрытых UCNP и UCNP-IgG, подтверждает наличие Gd, Er, Yb, F (рис. 6a,b). PL-измерения показывают сохранение зеленой (540 нм) и красной (650 нм) эмиссии под 980-нм возбуждением с незначительными вариациями интенсивности, приписываемыми поверхностным дефектам или погрешностями измерений.

FTIR покрытых поверхностей дополнительно подтверждает сохранение функциональных групп: –OH полоса при 3648 см⁻¹ (IgG) появляется только в UCNP-IgG (рис. 7a), аминовая полоса при 1575 см⁻¹ видна в UCNP (рис. 7b). Отсутствие этих полос на чистом стекле (рис. 7c) подчеркивает успешное осаждение нанчастичных слоев.

Поведение клеток на разных покрытиях

Конфокальные изображения после 24 часов культуры показывают сопоставимое количество клеток на всех поверхностях, но на UCNP-IgG поверхностях клетки имеют большую площадь распространения, более длинные цитоплазматические отростки и увеличенную межклеточную связность (рис. 8). Количественный анализ показывает увеличение площади клетки на 11,2 % и 22,2 % для UCNP и UCNP-IgG соответственно относительно желатинового контроля; длины связей увеличиваются на 12,5 % и 17,5 %; длины клеток растут на 8,2 % и 17,3 %; количество клеток возрастает примерно на 8 % на нанчастично покрытых поверхностях (рис. 9). Эти метрики подтверждают, что и UCNP, и UCNP-IgG улучшают адгезию и распространение эндотелиальных клеток без индуцирования цитотоксичности.

Влияние покрытия на живучесть клеток

MTT-тесты демонстрируют >99 % относительной живучести на чистом стекле, UCNP и UCNP-IgG, превышая >85 % бенчмарк для биосовместимых материалов. Небольшое увеличение живучести (105 % для UCNP, 104 % для UCNP-IgG) предполагает мягкий стимулирующий эффект нанчастичных покрытий, вероятно, из-за повышенной шероховатости поверхности и адсорбции белков.

Заключение

Мы продемонстрировали, что NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ UCNP и их IgG-функционализированные аналоги могут быть синтезированы однокамерным гидротермальным процессом и осаждены на стеклянные культуральные чашки методом MAPLE без ущерба их структурной и фотолюминесцентной целостности. TEM, FTIR, XRD и EDX подтверждают успешный синтез, конъюгацию и осаждение. Биосовместимость показывает отсутствие цитотоксичности, а конфокальная микроскопия — улучшенную адгезию, распространение и межклеточную сеть HUVEC на нанчастично покрытых поверхностях. Эти результаты позиционируют MAPLE-осажденные антител-функционализированные UCNP как перспективные низкозагрязняющие покрытия для передовых платформ тканевой инженерии и регенеративной медицины.

Аббревиатуры

DAPI:

4′,6-Диамидино-2′-фенилиндиол дигидрохлорид

EG:

Этиленгликоль

HUVEC:

Человеческие пуповинные эндотелиальные клетки

IgG:

Иммуноглобулин G

MAPLE:

Матрично-вспомогательное пульсирующее лазерное испарение

PEI:

Полиэтиленimine

Phalloidin-TRITC:

Фаллоидин–Тетрамилрhodамин B изотиоцианат

UCNP:

Нанчастицы с верхней конвертацией