Повышение селективности амперометрических преобразователей наномасштабными пленками полифенилендиамина

Аннотация

В работе оптимизирован электрономер полифенилендиамина (ПФД) полупроницаемой мембраны на платиновых дисковых электродах для подавления интерференций в амперометрическом сенсировании. Сравнили два способа осаждения: циклическая вольтамметрия (ЦВ) и постоянный потенциал. ЦВ проще в исполнении и дает превосходную мембрану. Изучено влияние числа циклов ЦВ и концентрации фенилендиамина (ФД) на работу мембраны. Три цикла ЦВ в 30 мМ ФД полностью устраняют ответ на распространенные интерференты: аскорбиновую кислоту, дофамин, цистеин, мочевую кислоту. Для анализов, требующих высокую чувствительность — разбавленные образцы — снижение концентрации ФД до 5 мМ дает более тонкий слой ПФД и улучшает детектирование перекиси водорода. ПФД-модифицированные электроды сохраняли селективность в течение 2 ч непрерывной работы и функциональность после 8 дней хранения при –18 °C, что делает их подходящими для биосенсорных применений.

Введение

Биосенсоры предлагают дешевую альтернативу хроматографии, спектроскопии и колориметрии, но часто уступают в аналитической характеристике. Исследования в биосенсорике быстро развиваются. По Международной ассоциации исследователей в фундаментальной и прикладной химии, биосенсор — интегрированное устройство, связывающее биологический рецептор с преобразователем для количественного или полуколичественного анализа. Электрохимические биосенсоры — амперометрические, потенциометрические, кондуктометрические, импедиметрические — составляют крупнейшую подгруппу.

Селективное детектирование критично при анализе сложных биологических матриц — сыворотки крови, мочи, спинномозговой жидкости, где эндогенные молекулы (аскорбиновая кислота, цистеин, гомоцистеин, мочевая кислота, дофамин, глутатион) дают ложные сигналы. Селективность биосенсора исходит и от биологического рецептора, и от преобразователя; ферменты и антитела по своей природе селективны, тогда как электроды обычно неселективны. Поэтому стратегии экранирования электрода от интерференций необходимы.

Существует две основные стратегии: понижение рабочего потенциала или добавление полупроницаемой мембраны, пропускающей целевой аналит и блокирующей крупные интерференты. Осаждение наноструктурированных полимерных пленок просто и мало влияет на характеристики сенсора. Среди полимерных мембран производные фенилендиамина (ФД) привлекают внимание нанопористой архитектурой, пропускающей перекись водорода и блокирующей более крупные молекулы. Пленки полифенилендиамина (ПФД) имеют поры, вмещающие малые молекулы вроде H₂O₂, но исключают большие — аскорбиновую кислоту или дофамин, повышая точность сенсора. Предыдущие работы исследовали разные изомеры ФД и методы полимеризации; мета-ФД (м-ФД) обычно дает наиболее проницаемые и селективные мембраны, особенно при осаждении ЦВ. Недавние работы также демонстрируют ФД-мембраны в безферментных сенсорах, например, для детектирования бовинского сывороточного альбумина через гашение флуоресценции.

Цель — сравнить два распространенных метода осаждения — циклическую вольтамметрию и постояннопотенциальное электрономерение — и определить оптимальный протокол создания ПФД мембран на платиновых дисковых электродах.

Методы

Материалы

Аскорбиновая кислота, цистеин, мочевая кислота, дофамин, перекись водорода, м-фенилендиамин, HEPES — Sigma-Aldrich (США). Образцы человеческой сыворотки — Киевский мун. науч.-практ. центр нефрологии и гемодиализа (Украина).

Конструкция амперометрических преобразователей

Платиновые дисковые электроды изготавливали герметизацией платиновой проволоки диаметром 0,4 мм, длиной 3 мм в стеклянную капилляру внешн. диаметром 3,5 мм. Кончик проволоки — рабочая поверхность. Внутренний конец паяли к серебряной проволке Вудовским сплавом и подключали к потенциостату. Перед использованием электроды чистили 30 с HCl, промывали этанолом, полировали абразивной бумагой P1500.

Методы измерений

UV-vis диффузно-рефлектирующие спектры — Thermo Evolution 600 (200–900 нм) со стандартом Spectralon. Электрохимия — стандартная трехелектродная ячейка (рабочий, платиновый вспомогательный, Ag/AgCl опорный) с потенциостатом PalmSens и 8-канальным мультиплексором. Хроноамперометрия при 0,6 В отн. Ag/AgCl в 10 мМ HEPES (pH 7,4) в 3 мл стеклянной кувете под постоянным перемешиванием. Концентрации субстратов готовили добавлением аликвот стоковых растворов (50 мМ H₂O₂, 20 мМ аскорбиновая, 3 мМ цистеин, 4,5 мМ мочевая, 2,1 мМ дофамин). Фенилендиамин растворяли в 40 мМ фосфатном буфере (pH 7,4). Циклическая вольтамметрия: диапазон 0–0,9 В, скорость 20 мВ/с, шаг 5 мВ. Все эксперименты в триplicates; данные — среднее ± SD (OriginPro 8.5).

Результаты и обсуждение

Сначала оценили базовую чувствительность и селективность голых платиновых электродов к перекиси водорода и типичным интерферентам. Использовали три уровня концентраций: (1) физиологические (сыворотка), (2) 20-кратное разбавление, (3) 100-кратное разбавление. Наблюдали, что дофамин и аскорбиновая кислота дают сильнейшие сигналы, цистеин — слабейший. Даже после 100-кратного разбавления ответы интерферентов оставались ~20% от сигнала H₂O₂, что показывает недостаточность голого электрода для сложных биологических образцов.

Затем сравнили два способа осаждения. Метод ЦВ: электрод подвергали последовательным циклам (CVA) в 30 мМ ФД; каждый CVA занимал ~2 мин. Метод постоянного потенциала: электрод удерживали при +0,7 В 40 мин в том же растворе. Таблица 3 показывает, что мембраны ЦВ значительно подавляют интерференты (особенно цистеин) и увеличивают чувствительность к H₂O₂ в 2,6 раза, вероятно, из-за активации платиновой поверхности. Постоянный потенциал не повышал чувствительность и требовал больше времени. Поэтому ЦВ предпочтительна по скорости, селективности и приросту чувствительности, несмотря на ограничение — один электрод за прогон.

Спектроскопический анализ подтвердил формирование ПФД: диффузно-рефлектирующий спектр пленки показывает интенсивные полосы 222 и 315 нм (π→π* переходы мономера) и широкий хвост 400–800 нм, указывающий на расширенную конъюгацию в полимере.

Оптимизировали число CVA и концентрацию ФД. Один CVA дал недостаточную мембрану; увеличение до трех CVA устранило ответы дофамина и мочевой кислоты, сохраняя чувствительность к H₂O₂. Снижение ФД до 5 мМ сохраняло селективность для разбавленных образцов, но ухудшало работу с неразбавленными матрицами. Концентрация 30 мМ ФД с тремя CVA дала полное подавление интерференций и приемлемый ответ H₂O₂; более высокие концентрации (>50 мМ) утолщали мембрану и снижали чувствительность.

Тесты стабильности: мембрана сохраняла селективность 2 ч непрерывной работы, с незначительным улучшением ответа H₂O₂ и дальнейшим подавлением интерферентов — вероятно, закупорка пор крупными видами. Хранение при –18 °C 8 дней увеличило чувствительность к H₂O₂ в 2,5 раза без потери подавления интерферентов, что указывает на медленное набухание мембраны, повышающее проницаемость.

Применение к реальным биологическим образцам (сыворотка, нейронный лизат) показало: немодифицированные электроды давали зашумленные сигналы, ПФД-модифицированные — пренебрежимо малые ответы, подтверждая пригодность для сложных матриц.

Заключение

Электрономер полифенилендиамина через циклическую вольтамметрию предлагает быстрый, эффективный способ создания полупроницаемых мембран, подавляющих интерференции на платиновых дисковых амперометрических преобразователях. Три цикла ЦВ в 30 мМ ФД полностью устраняют влияние распространенных интерферентов, тогда как 5 мМ ФД достаточно для разбавленных образцов для сохранения более высокой чувствительности к H₂O₂. Полученные мембраны остаются селективными минимум 2 ч работы и стабильны после 8 дней заморозки. Результаты поддерживают использование ПФД-модифицированных электродов в проектировании надежных биосенсоров для сложных биологических жидкостей.