Оптимизация наноинкапсуляции кластеров неонатальных островков свиней с использованием полимерсом

Введение

Использование трансплантации алло-островков в лечении диабета 1 типа ограничено из-за отсутствия подходящих доноров. Вместо этого наблюдается постепенное увеличение использования островков животных при трансплантации ксеноостровков, причем свиньи становятся оптимальными донорскими видами [1]. Когда свиней используют в качестве доноров во время трансплантации, можно использовать отдельные островки в зависимости от возраста свиней. Часто кластеры неонатальных островков свиней (NPCC) предпочтительнее островков взрослых свиней (API) из-за их доступности и простоты выделения. Кроме того, NPCC могут постепенно пролиферировать после трансплантации, продлевая их функцию in vivo [1, 2]. Однако, когда NPCC трансплантируются в воротные вены человека или нечеловека приматов (NHP), межвидовые вариации могут вызывать иммунные реакции, такие как мгновенная воспалительная реакция, опосредованная кровью (IBMIR) или сверхострое отторжение, что приводит к ранней потере трансплантата [3]. Чтобы решить эту проблему, требуется инкапсуляция NPCC, которые могут ингибировать различные иммунные ответы. Есть три типа инкапсуляции:макро-, микро- и наноинкапсуляция. Макроинкапсуляция использует устройство, содержащее островки, которое затем имплантируется вокруг кровеносных сосудов для высвобождения инсулина через полупроницаемую мембрану в ответ на уровень глюкозы в крови. Микроинкапсуляция упаковывает небольшое количество островков в пористую капсулу. Хотя эти инкапсуляции могут защищать островки от иммунного отторжения, в исследованиях in vivo сообщалось о побочных эффектах, таких как коллапс мембраны или образование тромба. Островки также нарушают поток гормонов, питательных веществ или кислорода из-за увеличения расстояния диффузии. Наноинкапсуляция - это стратегия модификации клеточной поверхности, вызывающая прикрепление между клетками и экзогенными белками, в основном полиэтиленгликолем (ПЭГ), при переливании крови [4].

Наноинкапсуляция с использованием ПЭГ широко используется в качестве метода модификации для улучшения эффективности и физико-химических свойств целевых белков или пептидов [5]. В частности, наноинкапсуляция островков может оказывать ингибирующее действие в ответ на атаку иммунных клеток и распознавание антител. ПЭГ широко используется для покрытия клеток из-за его биосовместимых свойств, таких как неиммуногенность, маскирование антигена и необрастающий эффект [6]. Среди наночастиц, используемых для наноинкапсулирования NPCC, наиболее подходящими являются «полимерсомы» (PSomes) на основе PEG-блок-полилактида (PEG-b-PLA), поскольку они стабильны и просты в модификации; они также могут включать в себя как гидрофильные, так и гидрофобные реагенты [7, 8]. Модификация поверхности островков с использованием полимеров (содержащих ПЭГ) достигается за счет ковалентного или нековалентного связывания между внеклеточным матриксом (ЕСМ) островка и полимером, конъюгированным с функциональными группами [9].

В предыдущих исследованиях в качестве буфера реакции островковой наноинкапсуляции использовался базовый сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS, pH 8,0) из-за его способности облегчать N-гидроксисукцинимид (NHS) -NH ₂ связывание [10,11,12]. Однако, чтобы минимизировать клеточное повреждение NPCC во время наноинкапсуляции, мы использовали среду F-10 (культуральная среда NPCC) с физиологическим pH (pH 7,3). Кроме того, поскольку сохранение количества NPCC после наноинкапсуляции важно для трансплантации правильного количества клеток, мы добавили бычий сывороточный альбумин (BSA), который покрывает дно чашки для культивирования клеток длинноцепочечным полимером, чтобы увеличить восстановление. оценка [13]. В нашем предыдущем исследовании наноинкапсуляция NPCC с помощью PSome проводилась через отдельные функциональные группы, такие как NHS или NH ₂ , которые используются для индукции ковалентного связывания или электростатического взаимодействия с ECM NPCC, соответственно. Однако, поскольку сродство связывания со временем снижается, необходимы стратегии для повышения эффективности связывания [14]. Некоторые PSome, содержащие бифункциональные группы, могут быть использованы в качестве кандидата для повышения эффективности покрытия из-за их способности к агрегации. Таким образом, мы индуцировали перекрестное связывание между ПСомами, содержащими бифункциональные группы (NHS- / NH ₂ -PSome), которые могут связываться не только с ECM NPCC, но также и с каждой PSome посредством ковалентного взаимодействия или электростатического взаимодействия, тем самым повышая эффективность наноинкапсуляции.

В этом исследовании мы изучили возможное применение наноинкапсуляции на NPCC с помощью оптимизированного метода в области ксенотрансплантации островков свиней.

Материалы и методы

Животные

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Института MGENPLUS co. ООО (# 2019–1), и все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами, установленными комитетом. Операцию проводили под общей анестезией, и были предприняты усилия, чтобы животные испытывали минимальную боль. Свиней забивали перед панкреатэктомией.

Выделение кластеров неонатальных островков свиней (NPCC)

NPCC выделяли от 3–5-дневных поросят. Вкратце, поросят анестезировали с помощью инъекции кетамина (10 мг / кг, Yuhan, Сеул, Корея) и гидрохлорида ксилазина (1 мг / кг, Rompun; Bayer Korea, Сеул, Корея) в бедренную мышцу, а затем умерщвляли инъекцией хлорида калия ( Сигма-Олдрич, Миссури, США) в самое сердце. Поджелудочную железу обнажали через разрез брюшной полости, собирали и погружали в сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS, Biosesang, Кёнгидо, Корея) с 8,3 мМ бикарбоната натрия, 10 мМ N- (2-гидроксиэтил) пиперазин-N '- ( 2-этансульфоновая кислота) (HEPES) (Sigma-Aldrich, Миссури, США) и 0,5% антибиотик-антимикотик (Biowest, Миссури, США). Поджелудочная железа была измельчена на 1–2 мм ³ фрагментов и переваривали коллагеназой типа V (1 мг / мл, Sigma-Aldrich, Миссури, США) в HBSS в течение 10 мин. Холодный HBSS, содержащий 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Biowest, MO, USA), добавляли к переваренной ткани поджелудочной железы для остановки активности фермента. Переваренные ткани поджелудочной железы промывали HBSS, и после ресуспендирования ткани фильтровали через pluriStrainer 500 мкм (pluriSelect, Лейпциг, Германия) и промывали HBSS. Наконец, NPCC были засеяны и культивированы в 5% CO ₂ при 37 ° C в среде F-10 (Гибко, Калифорния, США) с добавлением 0,25% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (genDepot, Техас, США), 10 мМ никотинамида, 10 мМ D-глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 2 мМ дигидрата хлорида кальция, 50 мкМ изобутилметилксантина (IBMX), 20 мкг / мл ципрофлоксацина (Sigma-Aldrich, Миссури, США) и 1% антибиотик-антимикотик. NPCC культивировали в течение 5 дней [15], ежедневно добавляя в питательную среду 10 нМ эксендина-4 (Prospec, Ness-Ziona, Израиль).

Оценка NPCC и наноинкапсулированных NPCC in vitro

После культивирования количество NPCC подсчитывали как островковый эквивалент (IEQ) с использованием сетки окуляра в окуляре. Жизнеспособность оценивали с помощью окрашивания акридиновым оранжевым (АО, 0,67 мкМ, Sigma-Aldrich, Миссури, США) и йодидом пропидия (PI, 75 мкМ, Sigma-Aldrich, Миссури, США). Для проведения анализа секреции инсулина, стимулированной глюкозой (GSIS), 20-30 клеток NPCC были отобраны и предварительно инкубированы с низкой концентрацией D-глюкозы (2,8 мМ) в бикарбонатном буфере Кребса – Рингера (KRBB) в течение 1 часа. Затем NPCC инкубировали с низким содержанием D-глюкозы (2,8 мМ) в буфере KRBB в течение 1 часа, а затем с раствором с высоким содержанием D-глюкозы (28,0 мМ) в KRBB в течение 1 часа. Супернатанты собирали для измерения секреции инсулина при низких и высоких концентрациях глюкозы [11]. Количество инсулина, секретируемого из каждого образца, измеряли с использованием набора для анализа инсулина человека / собак / свиней для ELISA (R&D systems, MN, США). Индекс стимуляции (SI) рассчитывали путем деления количества инсулина при высоких концентрациях глюкозы (28,0 мМ) на количество инсулина при низких концентрациях (2,8 мМ).

Получение полимерсомы (PSome)

Для получения PSomes используются сополимеры N-гидроксисукцинимид-поли (этиленгликоль) -блок-поли (лактид) (10 мг / мл, NHS-PEG-b-PLA) или амин-поли (этиленгликоль) -блок-поли (лактид). ) сополимеры (10 мг / мл, NH ₂ -ПЭГ-b-PLA; Полимеры Nanosoft, Северная Каролина, США) растворяли в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО, Sigma-Aldrich, Миссури, США). Помимо получения бифункциональной PSome, каждый сополимер (NHS или NH ₂ -ПЭГ-b-PLA), растворенный в ДМСО, смешивали в пропорциях. К раствору полимера добавляли дистиллированную воду (DH2O) до конечной концентрации 1 мг / мл. Раствор полимера обрабатывали ультразвуком в ультразвуковом аппарате (Sea han ultrasonic, Сеул, Корея) в течение 5 мин. 1,1'-Диоктадецил-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндодикарбоцианин, соль 4-хлорбензолсульфоната (DiD; Biotium, Калифорния, США) добавляли к раствору полимера во время обработки ультразвуком для обеспечения визуализации. Наконец, смесь диализовали в DH2O в течение 3 дней.

Наноинкапсуляция

PSome разводили в буфере для реакции наноинкапсулирования (либо HBSS (pH 7,3 или pH 8,0), либо в простой среде F-10 без добавок (pH 7,3 или pH 8,0), с 0,25% BSA или без него). Наноинкапсулирование выполняли путем добавления PSome к NPCC в культуральной среде. Для этого 10000 IEQ NPCC были засеяны в 6-луночную чашку для культивирования клеток (SPL, Gyeonggi-do, Korea), и разбавленные PSome добавлены к NPCC и инкубированы в 5% CO ₂ при 37 ° C в течение 1 ч. Группу отрицательного контроля (NC) (NPCC без покрытия без PSome) инкубировали в тех же условиях, что и экспериментальную группу. После инкубации нанокапсулированные NPCC собирали и культивировали в культуральной среде F-10.

Эффективность нанокапсулированных NPCC

Конъюгированные с DiD нанокапсулированные клетки PSome были визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии (Leica, Wetzlar, Германия) или конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM; Carl Zeiss, Оберкохен, Германия). Интенсивность DiD-конъюгированных PSome-связанных NPCC количественно определяли путем вычисления средней интенсивности флуоресценции (MFI) с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH, Bethesda, USA). Ядра в клетке контрастировали с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI).

Анализ проницаемости полимерсом

Наноинкапсулированные NHS-PSome NPCC в F-10 или F-10 (0,25% BSA) инкубировали с декстраном, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), различной молекулярной массы (10, 20, 70 и 250 кДа) в течение 2 часов. . Проникновение FITC-конъюгированного декстрана в нанокапсулированные NHS-PSome NPCC подтверждалось для каждой молекулярной массы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

Анализ жизнеспособности полимерсомных клеток

Наноинкапсулированный NHS-PSome THP-1 (линия моноцитарных клеток человека) в RPMI 1640 (Biowest, Миссури, США) инкубировали в течение 1 часа. Жизнеспособность нанокапсулированного NHS-PSome THP-1 измеряли в соответствии с протоколом, представленным в наборе для анализа пролиферации клеток MTT (iNtRon Biotechnology, Соннамси, Корея).

Статистический анализ

Непарный t-тест проводился в GraphPad Prism 6.0. Статистическая значимость выражалась как *, ** *** и ****, обозначающие P значение ≤ 0,05, ≤ 0,01, ≤ 0,001 и ≤ 0,0001.

Результаты

Культура и функциональная оценка NPCC

NPCC культивировали в течение 5 дней и проводили контроль качества, включая жизнеспособность и GSIS. Общее количество NPCC составило 21 014,0 IEQ / г / поджелудочную железу. Жизнеспособность при окрашивании AO / PI составила 89,9%. GSIS, который был проведен для подтверждения чувствительности NPCC к концентрации глюкозы, дал средний индекс стимуляции (SI) 2,3 (таблица 1, дополнительный файл 1:рис. S1).

Концентрация PSome, необходимая для эффективной наноинкапсуляции NPCC

Чтобы определить концентрацию PSome, необходимую для эффективной наноинкапсуляции, мы добавляли различные концентрации NHS-PSome к NPCC. NHS-PSome содержали при концентрации 1 мг / мл в DH ₂ . O и разбавляли в соотношении 1:5, 1:10, 1:20 и 1:40 до получения конечных концентраций от 0,2 до 0,025 мг / мл. Эффективность наноинкапсуляции измеряли с помощью MFI нанокапсулированных нанокапсулированных клеток PSome, загруженных DiD. Конечная концентрация 0,1 мг / мл (разведение 1:10) показала наивысшую интенсивность флуоресценции через 2 дня после наноинкапсуляции (рис. 1a и b), и последующая наноинкапсуляция NPCC была проведена при этой концентрации.

Оптимизация концентрации PSome для эффективного наноинкапсулирования через 0 и 2 дня. Оптимизация концентрации PSome для эффективного наноинкапсулирования. а NHS-PSome, нагруженный DiD, обрабатывали в NPCC в различных концентрациях (BF; светлое поле). Масштабные линейки представляют 200 мкм. б MFI нанокапсулированных нанокапсулированных клеток PSome, загруженных DiD ( n =3) и ЧПУ ( n =1)

Повышенная эффективность наноинкапсуляции в среде F-10 с физиологическим pH

Наноинкапсуляция островков поджелудочной железы (содержащих NPCC) часто выполняется в основном буфере HBSS (pH 8,0 или выше) для повышения аффинности связывания между NH2 в ECM островков и NHS, конъюгированным в полимере. Однако наноинкапсуляция в базовом буфере HBSS может потенциально повредить NPCC. Таким образом, чтобы минимизировать повреждение NPCC и определить влияние pH на NHS-NH ₂ связывания, NPCC были нанокапсулированы через NHS-PSome в буферы HBSS или простые культуральные среды F-10 (используемые в этом исследовании для культивирования NPCC) с pH 7,3 (физиологический) или pH 8,0 (основной), соответственно. Когда NPCC были нанокапсулированы в F-10, нормальная морфология NPCC сохранялась (рис. 2a), а эффективность наноинкапсулирования на основе MFI была значительно увеличена по сравнению с таковой в группе HBSS независимо от pH в дни 0. и 6 (рис. 2б). Хотя группы HBSS показали значительную разницу между pH 7,3 и 8,0 на 6-й день, интенсивность наноинкапсулирования была значительно снижена по сравнению с таковой в группе F-10. Таким образом, мы использовали физиологическую культуральную среду F-10 (pH 7,3) в качестве буфера для реакции наноинкапсуляции в последующих экспериментах, чтобы минимизировать потенциальное повреждение NPCC.

Сравнение эффективности покрытия при наноинкапсулировании в различных реакционных буферах через 1 и 6 дней. Сравнение эффективности покрытия наноинкапсулирования в различных реакционных буферах. а Наноинкапсулированные NPCC в HBSS (pH 7,3 и pH 8,0) или F-10 (pH 7,3 и pH 8,0) с использованием DiD-конъюгированных NHS-PSome (BF; светлое поле). Масштабные линейки представляют 200 мкм; б MFI нанокапсулированных NPCC в HBSS (pH 7,3 и pH 8,0) или F-10 (pH 7,3 и pH 8,0) с использованием DiD-конъюгированных NHS-PSome (все группы; n =3). Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. * p <0,05, *** p <0,001 и **** p <0,0001 по сравнению с другими группами

Повышенная скорость восстановления NPCC после наноинкапсуляции

Хотя клеточное повреждение NPCC было минимизировано в F-10, количество NPCC, собранных после наноинкапсулирования, было заметно снижено. Чтобы решить эту проблему, мы добавили 0,25% БСА в среду F-10 во время культивирования и наноинкапсулирования NPCC с помощью NHS-PSome. Первоначально мы подтвердили, влияет ли добавление 0,25% БСА в среду F-10 на эффективность покрытия и селективную проницаемость, позволяя прохождение небольших молекул (10 и 20 кДа FITC-конъюгированный декстран) при блокировании более крупных молекул (70 и 250 кДа FITC-конъюгированных). декстран), как важная функция PSome. В результате конформное покрытие было показано на изображениях CLSM (рис. 3a, середина), а селективная проницаемость поддерживалась нормально (рис. 3b, FITC-конъюгированный декстран) в нанокапсулированных NHS-PSome нанокапсулированных NPCC с F-10, содержащим 0,25 % BSA по сравнению с F-10, хотя MFI был немного снижен (рис. 3b). Количество NPCC, собранных после наноинкапсулирования, показало значительно более высокую скорость восстановления (71,9%) в F-10 с 0,25% BSA, чем в F-10 без BSA (42,3%) (рис. 3c). Жизнеспособность (NC:89,5%, NHS-PSome:90,3%) и стимулированная глюкозой секреция инсулина (NC:2,1, NHS-PSome:1,6) NPCC в F-10 с 0,25% BSA также сохранялись после наноинкапсуляции (рис. . 4а, б, дополнительный файл 1:рис. S2). Наши результаты показывают, что добавление 0,25% БСА может значительно повысить скорость восстановления NPCC после наноинкапсуляции и не повлияло на эффективность покрытия или функцию PSome.

Сравнение эффективности покрытия после добавления 0,25% БСА в буферы для реакции наноинкапсулирования для увеличения скорости восстановления. Сравнение эффективности покрытия после добавления 0,25% БСА в буферы для реакции наноинкапсулирования для увеличения скорости восстановления. а Эффективность покрытия и избирательная проницаемость нанокапсулированных NPCC с NHS-PSome в F-10 или F-10 с 0,25% BSA (BF; светлое поле, среднее; среднее изображение с использованием CLSM нанокапсулированных DiD-конъюгированных NHS-PSome нанокапсулированных NPCC, FITC-конъюгированный декстран; среднее изображение с использованием CLSM FITC-конъюгированного декстрана в нанокапсулированных NHS-PSome NPCC). Синий в середине представляет клетку, окрашенную DAPI. Шкала составляет 200 (BF и DiD) и 100 (Mid и FITC-конъюгированный декстран) мкм; б MFI нанокапсулированных NPCC с использованием DiD-конъюгированных NHS-PSome; c Скорость восстановления NPCC после наноинкапсуляции в F-10 ( n =12) или F-10 с 0,25% BSA ( n =12). Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. * p <0,05 по сравнению с F-10

Жизнеспособность и функциональность нанокапсулированных NHS-PSome NPCC с использованием F-10 с 0,25% BSA. Жизнеспособность и функциональность нанокапсулированных NHS-PSome NPCC с использованием F-10 с 0,25% BSA. а Жизнеспособность нанокапсулированных в NHS-PSome клеток NPCC ( n =6) и ЧПУ ( n =6); б SI нанокапсулированных NPCC NHS-PSome ( n =5) и ЧПУ ( n =5). Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение

Повышенная стабильность наноинкапсуляции за счет перекрестных ссылок PSomes

Чтобы вызвать более стабильную наноинкапсуляцию NPCC, мы попытались конъюгировать PSomes, имеющие две разные функциональные группы. Во-первых, мы провели наноинкапсуляцию NPCC путем одновременного добавления различных пропорций PSomes, содержащих NHS и NH ₂ бифункциональные группы (NHS- / NH ₂ -PSome) в одном PSome (Схема 1). Эффективность наноинкапсулирования была подтверждена MFI DiD, конъюгированного в нанокапсулированные в PSome NPCC. Полученные изображения с флуоресцентной микроскопии не показали значительных различий между группами нанокапсулированных NHS- / NH2-PSome 9:1, 5:5 и 1:9 нанокапсулированных NPCC (9:1, 5:5, 1:9) в день 0. и день (рис. 5а). Однако в результатах CLSM группа 5:5 казалась покрытой сверху, а 1:9 показала недостаточное покрытие, в то время как группа 9:1 сформировала конформное покрытие в день 1 (рис. 5b). Поэтому мы определили, что оптимальное соотношение NHS- / NH2 в PSome составляет 9:1. Когда функциональные анализы были выполнены для группы 9:1, наши результаты показали, что жизнеспособность группы 9:1 была значительно снижена по сравнению с контрольной группой NC (92,1%), но жизнеспособность сохранялась на нормальном уровне (87,8%). %). Функция SI в группе 9:1 была нормальной (3,0) по сравнению с функцией контроля NC (3,7) (рис. 5c, d).

Иллюстрация улучшенной стабильности наноинкапсуляции за счет сшивания ПСом

Эффективность покрытия и функциональность NHS- / NH ₂ -P Некоторые нанокапсулированные NPCC. Эффективность покрытия и функциональность NHS- / NH ₂ -P Некоторые нанокапсулированные NPCC. а DiD конъюгировал 9:1, 5:5, 1:9 NHS- / NH ₂ -P Некоторые нанокапсулированные NPCC (9:1, 5:5, 1:9) (NC; NPCC без покрытия). MFI показывает интенсивность нанокапсулированных DiD-конъюгированных PSome NPCC ( n =3) и ЧПУ ( n =3). Масштабные линейки представляют 200 мкм; б CLSM DiD-конъюгированного NHS- / NH ₂ -PS Некоторые нанокапсулированные NPCC (Среднее; среднее изображение с использованием CLSM DiD-конъюгированного NHS- / NH ₂ -P Некоторые нанокапсулированные NPCC). Синий в середине представляет клетку, окрашенную DAPI. Масштабные линейки представляют 100 мкм; В. Жизнеспособность 9:1 ( n =9) и ЧПУ ( n =3). Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. ** p <0,01 по сравнению с NC; D. SI 9:1 ( n =9) и ЧПУ ( n =3). Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение

Обсуждение

Сахарный диабет, широко известный как диабет, - это нарушение обмена веществ, характеризующееся высоким уровнем глюкозы в крови. Диабет 1 типа возникает в результате неспособности бета-клеток поджелудочной железы производить достаточное количество инсулина [16]. Трансплантация островков поджелудочной железы, содержащих инсулин-продуцирующие β-клетки, недавно была использована для лечения диабета 1 типа. Однако трансплантация алло-островков ограничена из-за нехватки доноров; вместо этого ксенотрансплантация с использованием островков от животных, кроме человека, стала альтернативным источником донорской ткани. Благодаря их физиологическому сходству с людьми, простоте массового разведения и доступности разведения в условиях, свободных от патогенов, свиньи считаются оптимальной животной моделью для трансплантации ксено-островков [1]. В частности, NPCC используются так же эффективно, как и API. Хотя зрелость NPCC ниже, чем у API, NPCC имеют некоторые преимущества перед API, включая относительно простую и недорогую процедуру выделения островков, способность развивать устойчивость к гипоксической среде и пролиферацию in vivo после трансплантации [1,2,3] . По этим причинам в качестве источника островков в этом исследовании мы использовали 3–5-дневных новорожденных свиней.

К сожалению, после имплантации островков свиней в кровеносные сосуды человека или нечеловека приматов часто возникают тяжелые иммунные реакции, такие как IBMIR или сверхострое отторжение. IBMIR обычно возникает из-за нескольких тканевых факторов (TF), экспрессируемых в островках свиней, которые опосредуют коагуляцию в кровеносных сосудах человека через активацию внешнего пути. Альфа-галактозные или не-gal антигены, экспрессируемые на поверхности клеток свиней, также могут быть мишенями для естественных человеческих антител, за которыми следует дополнительная каскадная активация, называемая сверхострым отторжением. В результате трансплантаты теряются из-за гипоксии из-за образования сгустка из-за пути коагуляции и гибели клеток из-за активации комплемента в организме хозяина [3]. Для решения этих проблем была опробована инкапсуляция - метод покрытия островков поджелудочной железы биосовместимыми материалами для защиты их от атаки антителами или реакциями комплемента. Во-первых, при макрокапсулировании используется устройство с полупроницаемой мембраной, содержащее островок, которое имплантируется рядом с кровеносными сосудами, где оно высвобождает инсулин в кровоток в ответ на уровень глюкозы в крови [4]. Во-вторых, микрокапсулирование, в основном с использованием альгината, обладает избирательной проницаемостью и может позволить кислороду и питательным веществам проходить через его пористую поверхность, блокируя при этом множественные цитокины и инфильтрацию иммунных клеток. Однако, поскольку они используют капсулы одного и того же размера, независимо от размера островков, трудно обеспечить конформное покрытие островков. Кроме того, может возникнуть фиброз, охватывающий трансплантат после трансплантации [17]. Наконец, для модификации поверхности островков (наноинкапсуляция) в основном используется полиэтиленгликоль (PEG), который обладает свойством «невидимого» эффекта, который блокирует взаимодействие материалов, покрытых «невидимым» полимером (PEG), и компонентов в крови (иммунных клеток) в vivo [11, 18]. Наша стратегия наноинкапсуляции NPCC использует модифицированные сополимеры PEG (PEG-b-PLA, Polymersome, PSome). Кроме того, псомы обладают как гидрофильными, так и гидрофобными свойствами и могут включать иммунодепрессанты или факторы, участвующие в дифференцировке или росте клеток [8].

Наноинкапсуляция островков с использованием PEG была выполнена в основном буфере HBSS (pH 8,0 или выше) для повышения аффинности связывания между NHS на PEG и NH ₂ на ECM островка [10,11,12]. Однако, поскольку эти условия не могут обеспечить подходящую среду для культивирования клеток, мы предприняли попытку наноинкапсулирования в среде, имитирующей условия культивирования NPCC. Чтобы решить вышеупомянутые проблемы, мы протестировали простую среду F-10, базовую среду для культивирования NPCC, с физиологическим pH (без каких-либо добавок), используемым в качестве буфера для реакции наноинкапсуляции. Наноинкапсуляция в F-10 с физиологическим pH показала аналогичную эффективность покрытия и поддержала нормальную морфологию NPCC по сравнению с условиями культивирования с использованием основного буфера HBSS (рис. 3). Таким образом, мы можем предложить платформу, которая минимизирует повреждение NPCC во время наноинкапсуляции в среде, имитирующей культуру NPCC.

Хотя метод наноинкапсулирования для минимизации повреждения NPCC был разработан, остаточное количество NPCC, собранных после наноинкапсулирования, уменьшалось, когда наноинкапсулирование выполнялось в чашках Петри. Это означает, что вам потребуется больше NPCC для наноинкапсуляции при трансплантации. Согласно предыдущим сообщениям, урожай островков был улучшен у некоторых линий мышей при использовании BSA во время изоляции [19]. Кроме того, BSA использовали в качестве суспензионной культуры путем предварительного покрытия поверхности чашек для культивирования клеток в культурах клеток гепатомы крысы [13]. Следовательно, чтобы увеличить количество NPCC после наноинкапсулирования, 0,25% BSA был добавлен в реакционный буфер для наноинкапсуляции F-10, так же как и концентрация BSA, используемая для культивирования NPCC. В результате скорость восстановления NPCC значительно увеличилась после наноинкапсулирования (рис. 4). Это означает, что правильное количество островков (содержащих NPCC) после наноинкапсуляции может быть предсказано и трансплантировано путем минимизации потери островков (содержащих NPCC). Таким образом, это исследование с использованием F-10 с 0,25% BSA для наноинкапсуляции показало, что (i) сохраняется нормальная морфология NPCC, (ii) не нарушается связывание между NHS-конъюгированными PSome и NH2 в ECM NPCC и (iii) скорость восстановления NPCC после наноинкапсуляции увеличилась.

Наконец, мы попытались повысить стабильность наноинкапсуляции посредством (i) конъюгации между PSomes и (ii) связывания между PSomes и ECM NPCC. Сначала полимеры NHS- и NH2-PEG-b-PLA смешивали пропорционально для образования бифункциональной PSome (NHS- / NH2-PSome), которая может связываться как с PSome, так и с ECM NPCC. Мы предположили, что конъюгация может быть эффективно достигнута с помощью бифункциональных групп внутри одной PSome, а не конъюгирования двух PSome с монофункциональными группами из-за потенциального прерывания, вызванного связыванием между PSome с одной и той же функциональной группой (NHS-NHS и NH2-NH2). Как видно из результатов, конформное покрытие NPCC было достигнуто при пропорции 9:1 нанокапсулированных NHS- / NH2-PSome нанокапсулированных NPCC, при этом жизнеспособность и функциональность сохранялись (рис. 5). Однако необходимы дальнейшие исследования для количественной оценки прочности связи PSome, чтобы доказать, что наноинкапсуляция с бифункциональными PSome приводит к более стабильной инкапсуляции, чем с монофункциональной PSome. Поэтому мы предлагаем, чтобы наши эффективные условия наноинкапсуляции, имитирующие среду культивирования NPCC, можно было использовать в стратегии наноинкапсуляции с использованием островков, содержащих NPCC (дополнительный файл 1).

Заключение

Это исследование было проведено для определения оптимального метода наноинкапсуляции островков поджелудочной железы (NPCC) с использованием полимерсом на основе PEG (PSomes). Во-первых, использование культуральной среды F-10 с pH 7,3 может поддерживать нормальную морфологию NPCC после наноинкапсуляции по сравнению с использованием основного буфера HBSS (pH 8,0), тем самым сводя к минимуму повреждение NPCC во время инкапсуляции. Во-вторых, добавление 0,25% БСА к среде F-10 улучшило выход NPCC примерно в 1,7 раза после наноинкапсулирования. Наконец, мы индуцировали более стабильную наноинкапсуляцию за счет конъюгации бифункциональных PSomes (NHS- / NH2-PSomes). Методы наноинкапсулирования, представленные в этой статье, могут быть применимы для наноинкапсулирования островков поджелудочной железы с использованием наночастиц на основе ПЭГ.

Доступность данных и материалов

Не применимо.

Сокращения

DiD:

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt

AO:

Acridine orange

APIs:

Adult porcine islets

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

BF:

Яркое поле

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

DAPI:

4′,6-Diamidino-2- phenylindole

DMSO:

Диметилсульфоксид

DH2O:

Distilled water

ELISA:

Иммуноферментный анализ

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FITC:

Флуоресцеина изотиоцианат

GSIS:

Glucose-stimulated insulin secretion

HBSS:

Hank’s balanced salt solution

IBMIR:

Instant blood-mediated inflammatory reaction

IEQ:

Islet equivalent

IBMX:

Isobutylmethylxanthine

KRBB:

Krebs–Ringer bicarbonate buffer

MFI:

Mean fluorescence intensity

HEPES:

N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)

NC:

Отрицательный контроль

NPCCs:

Neonatal porcine islet like cell clusters

NHS:

N-гидроксисукцинимид

NHP:

Non-human primate

PLA:

Poly lactide

PEG:

Полиэтиленгликоль

PSomes:

Polymersomes

PI:

Иодид пропидия

SI:

Stimulation index

TF:

Tissue factor