Портативное устройство на основе плазмонного теплового зондирования для определения и количественной оценки анализа бокового потока

Введение

Раннее выявление и быстрая диагностика важны для скрининга и лечения заболеваний. Большинство медицинских анализов отнимают много времени и требуют сложной подготовки клинических образцов, больших инструментов и хорошо подготовленных лабораторных специалистов [1]. Эти требования сильно затруднили лечение в районах с ограниченными ресурсами. Тестирование на месте (POCT) использует простое оборудование и сводит к минимуму время, необходимое для получения клинически значимых результатов, что позволяет клиницистам и пациентам быстро принимать решения. POCT имеет ряд очевидных преимуществ, таких как короткое время обнаружения, быстрая обработка образцов, простое оснащение и низкие эксплуатационные требования [2, 3]. Таким образом, появление POCT может помочь в ранней и быстрой диагностике заболеваний, особенно в районах с ограниченными ресурсами, тем самым улучшая состояние здоровья. Однако низкая аналитическая чувствительность, сложные рабочие процедуры и высокая стоимость оборудования обычно препятствуют применению этого метода. Поэтому срочно необходима дальнейшая работа по поиску приложений POCT с большинством идеальных характеристик при минимизации недостатков.

Для решения некоторых из этих проблем анализ бокового потока (LFA) является очень хорошим кандидатом в качестве инструмента тестирования в POCT. LFA - это бумажный стрип-биосенсор, используемый для идентификации целевых аналитов в данном образце [4, 5]. LFA выполняется на бумажной полоске (схема 1b), которая состоит из прокладки для образца, прокладки для конъюгата, впитывающей прокладки и нитроцеллюлозной мембраны, на которой происходит обнаружение. Среди преимуществ LFA стоит упомянуть быстроту и одностадийность анализа, рентабельность, простоту эксплуатации, небольшой объем образца и длительный срок хранения в различных условиях окружающей среды [6, 7]. Обычный LFA дает результаты «да или нет» путем проверки изменений цвета тестовой линии невооруженным глазом, что является наиболее популярным методом обнаружения для такого рода анализов. Таким образом, этот тип подхода имеет тенденцию страдать от недостатка точности и субъективного суждения [8]. Тем не менее, поскольку LFA легко интегрировать с электронными устройствами, подходящим подходом к обнаружению является разработка считывателей полосок для получения точных количественных результатов. Устройства с зарядовой связью (CCD) или дополнительные металлооксидные полупроводниковые датчики (CMOS) обычно применяются для захвата изображений в считывателях полос. Программное обеспечение для обработки изображений часто применяется для получения количественных результатов. В этих оптических считывателях записывается оптическая информация, полученная при отражении, пропускании или рассеянии света от внешнего источника, чтобы обеспечить возможность количественной оценки [9,10,11,12]. В колориметрических считывателях интенсивность цвета, такая как значение серого или координаты RGB, собирается из тестовых и контрольных линий для анализа полос LFA [13,14,15,16,17]. Одним из недостатков этого подхода является то, что краситель может со временем потерять свой цвет из-за фотоповреждений, механических средств или других процессов разложения, что приводит к плохой воспроизводимости и точности. В тех системах, которые используют флюоресцентные считыватели [18, 19], органические флуорофоры подвергаются воздействию определенной длины волны возбуждения, которая вызывает излучение флуорофора, присутствующего в полосках, на большей длине волны. Затем этот излучаемый свет собирается для количественного определения. Проблема, которую нельзя игнорировать, заключается в том, что органические флуорофоры, обычно используемые в этих приложениях, страдают от фотообесцвечивания и химического разложения, что со временем вызывает ослабление сигнала, что требует особого обращения и специального хранения [7].

Понятие плазмонного теплового зондирования. а Модель портативного устройства и основные компоненты (вверху) с двумя различными режимами зондирования (внизу). б LFA под настройкой термодатчика

В последнее время термическое зондирование постепенно применяется к обнаружению LFA. Термическое зондирование заключается в использовании теплового преобразователя, в котором выделяемое тепло увеличивается в присутствии аналита, что позволяет детектировать этот тепловой сигнал указанным преобразователем. Polo et al. [20] исследовали концепцию восприятия, вызванную плазмонным нагревом, путем обнаружения онкологического биомаркера карциноэмбрионального антигена (CEA) с использованием источника света в ближней инфракрасной области (NIR), чтобы вызвать тепловыделение с использованием плазмонных свойств анизотропных наночастиц золота. Qin et al. [21] предложили метод с использованием теплового контраста для количественной оценки LFA с использованием зеленого лазера в качестве источника света, который показал 32-кратное улучшение аналитической чувствительности. В 2016 г. Ванга разработал аналогичный термоконтрастный считыватель [22], который увеличил аналитическую чувствительность в 8 раз при количественной оценке LFA. Источник света, который используется для генерации тепла преобразователем, может быть настроен на определенные длины волн, чтобы не допустить воздействия на него других молекул, которые не поглощают на этих длинах волн, что обеспечивает специфичность обнаружения. Использование источников света, расположенных в ближней инфракрасной области электромагнитного спектра, позволяет предотвратить поглощение света большинством молекул биологического происхождения, особенно кровью [23]. Эти преимущества показывают, что плазмонное тепловое зондирование с источником света в ближнем инфракрасном диапазоне является многообещающим методом обнаружения LFA. Однако в предыдущих исследованиях не было разработано устройство POCT, использующее полосы LFA вместе с источником света NIR.

Здесь мы разработали портативное устройство на основе плазмонного термодатчика (схема 1а), которое улучшает аналитическую чувствительность LFA без дополнительной модификации полосок. Сигнал усиливался за счет включения плазмонного резонанса в полную силу при облучении лазером в ближнем инфракрасном диапазоне. Длина волны лазера в прототипе лежит в пределах пика локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) наночастиц (которые действуют как преобразователи света в тепло в наших условиях), таким образом выделяя тепло в тестовой линии. Затем тепловыделение регистрируется термодатчиком, расположенным в устройстве, который измеряет тепло, выделяемое либо инфракрасным излучением (излучением), либо теплопроводностью. Количество выделяемого тепла пропорционально количеству наночастиц в тестовой линии и мощности излучения [24]. Никаких дополнительных операций не требуется.

Теплопередача бывает трех основных форм:теплопроводность, конвекция и излучение. Чтобы изучить эффективность обнаружения различных форм теплопередачи, мы протестировали режим проводимости (контакт) и режим излучения (бесконтактный) с помощью двух типов датчиков (Схема 1a и Дополнительный файл 1:Рисунок S1). Весь прототип компактен и использует технологию встроенных систем и компоненты для поверхностного монтажа. Основные факторы, влияющие на способность обнаружения, были исследованы с целью оптимизации рабочих условий. Чтобы проверить способность портативного устройства обнаруживать, полоски LFA, непосредственно загруженные наночастицами на мембрану, были количественно определены и сравнены с обычным визуальным обнаружением. Поскольку наш метод обнаружения зависит от температуры, также было изучено влияние температуры окружающей среды на обнаружение теплового сигнала, и была получена калибровочная кривая для режима проводимости. Наконец, биомаркеры хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) были количественно определены в качестве модели для проверки способности обнаружения теплового зондирования.

Материалы и методы

Материалы и реагенты

Солевой раствор с фосфатным буфером (PBS) был приобретен у Lonza®. Гидрохлорид N- (3-диметиламинопропил) -N-этилкарбодиимида (EDC) и гетеробифункциональный полиэтиленгликоль (HS-PEG-COOH, MW =5000 г / моль (5 кДа)) были приобретены у SIGMA®. Твин 20, Тритон X100, бычий сывороточный альбумин (БСА), трегалоза, поливинилпирролидон (ПВП), N -гидроксисульфосукцинимид (S-NHS), гидроксид натрия, хлорид натрия, гидрат хлорида золота (III) и гормон ХГЧ были приобретены у Aladdin®. Сахароза, декагидрат тетрабората натрия, борная кислота, йодид калия и пентагидрат тиосульфата натрия были приобретены у Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Боргидрид натрия был приобретен у Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd. Вторичные антитела мыши, нитроцеллюлозная мембрана (NC-a110), прокладка для образца (стекловолокно BX108), прокладка для конъюгации (стекловолокно BX101) и поверхности из поливинилхлорида (ПВХ) были приобретены у JieyYiBiotech ™. 4-Морфолинэтансульфоновая кислота (MES) была приобретена в Shanghai Majorbio. Чистый этанол был приобретен у Changshu Yangyuan Chemical Co., Ltd.

Синтез наночастиц (золотые нанопризмы, AuNPrs)

Наночастицы, использованные в этом исследовании, были получены с использованием варианта нашего ранее опубликованного протокола [25], который позже был улучшен [26]. Вкратце, объем 220 мл 0,5 мМ Na ₂ S ₂ О ₃ добавляли 20 мкл 0,1 М KI. Затем 110 мл указанного выше раствора постепенно добавляли к раствору, содержащему 2 мМ HAuCl ₄ . в течение 30 с и инкубировали при комнатной температуре в течение всего 4 мин, момента, когда в раствор добавляли 110 мл оставшегося Na ₂ S ₂ О ₃ + Раствор KI в течение 30 с и инкубируют еще 4 мин. Наконец, 100 мл Na ₂ S ₂ О ₃ без KI добавляли к полученному раствору и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре с получением конечных призматических наночастиц. Все этапы инкубации, описанные ранее, выполнялись без встряхивания. После синтеза наночастицы были стабилизированы ПЭГ (ПЭГилирование). Количество PEG, добавленного к наночастицам, было приготовлено в соотношении 1:2 (NP к PEG) от общей массы золота, используемого в синтезе. ПЭГ разбавляли 1 мл воды Milli-Q и определяли объем NaBH ₄ . затем добавляли для достижения молярного отношения ПЭГ к NaBH ₄ 1:1. . Весь объем ПЭГ до NaBH ₄ раствор полностью добавляли к AuNPrs и доводили до pH 12 с помощью 2 M NaOH при мягком перемешивании. Наконец, раствор обрабатывали ультразвуком в течение 60 минут при 60 ° C, а затем центрифугировали в течение 15 минут при 4400 G при комнатной температуре для отделения AuNPrs от избытка PEG и непрореагировавших материалов. Гранулы ресуспендировали в воде Milli-Q и трижды центрифугировали по 9 мин при 4400 G при комнатной температуре. Эти окончательные образцы были разбавлены до одной четверти их первоначального объема, чтобы дать им возможность декантировать при комнатной температуре в течение нескольких недель. По истечении этого времени верхний слой раствора (содержащий большую часть более мелких и легких нанометровых побочных продуктов золота) можно было удалить из AuNPrs, которые осаждаются на дне. Концентрация наночастиц была получена путем измерения их оптической плотности (OD) при 400 нм с помощью УФ-видимой спектроскопии и применения коэффициента преобразования (ε) 11,3 мл мг ^-1 см ⁻¹ . Это значение было получено экспериментально путем сопоставления концентрации золота, полученной с помощью ICP, с OD при 400 нм в УФ-видимой области конечных продуктов синтеза.

Конъюгация наночастиц с антителом против ХГЧ

Вкратце, 3 мл раствора, содержащего 0,5 мг / мл ПЭГилированных наночастиц, трижды промывали 0,1 М буфером MES pH 5,5 центрифугированием в течение 9 мин при 6000 об / мин в микроцентрифуге с мини-вращением при комнатной температуре. Окончательно промытые наночастицы ресуспендировали в конечном объеме 1 мл того же буфера (0,1 M буфер MES, pH 5,5), и к раствору добавляли 4 мг EDC и S-NHS. Затем образцы инкубировали в течение 20 минут при мягком перемешивании, центрифугировали в течение 9 минут при 6000 об / мин и промывали буфером MES. Затем к образцу добавляли 20 мкл исходного раствора антител (200 мкг) и инкубировали 3 часа при 37 ° C с последующей второй инкубацией в течение ночи при 4 ° C (без встряхивания). На следующий день конъюгированные наночастицы центрифугировали (9 мин при 6000 об / мин) и дважды промывали боратным буфером 5 мМ pH 9. Затем к раствору добавляли 25 мг BSA. После 1 ч инкубации при комнатной температуре при легком встряхивании образец промывали (9 мин при 6000 об / мин) боратным буфером с добавлением Твин 20 (5 мМ, pH 9) и, наконец, хранили при 4 ° C до дальнейшего использования не более 4 дней. –5 дней.

После приготовления наночастиц была проведена сборка тест-полосок (описана в ESI).

Загрузка наночастиц на мембрану полосок

Чтобы нанести наночастицы на мембрану полосок, была получена концентрация исходного запаса ПЭГилированных наночастиц (без антител), и была проведена серия разбавлений в воде Milli-Q, в результате чего был получен диапазон концентраций от 0 (чистая вода Milli-Q без наночастиц) до 10 OD / мл для максимальной концентрации, что соответствует 0,9 мг / мл согласно коэффициенту пересчета, ранее определенному с помощью ICP-AES. Для простоты и экстраполяции значения OD были предпочтительнее массовой концентрации. Таким образом, 2 мкл каждого из вышеупомянутых разведений добавляли микропипеткой непосредственно на нитроцеллюлозную мембрану полосок и оставляли сушиться при комнатной температуре в течение ~ 2 часов. Перед испытаниями на облучение высушенные полоски хранили при комнатной температуре.

Для обнаружения антигена ХГЧ в полосках была проведена серия разведений аналита (ХГЧ) в PBS. Каждую полоску запускали, загружая 5 мкл AuNPr, конъюгированного с антителом против ХГЧ, в подушечку для конъюгата и 50 мкл необходимого разведения, содержащего ХГЧ. Полоски сушили так же, как и в предыдущем тесте.

Разработка портативного устройства

Портативное устройство (Рис. 1a и Дополнительный файл 1:Рисунок S1) было собрано с использованием технологии встроенных систем и компонентов для поверхностного монтажа, поскольку они имеют небольшие размеры и экономичны. Состав прототипа представлен на рис. 1б. Материнская плата (дополнительный файл 1:рисунок S1) является основным модулем устройства, функция которого заключается в обработке данных и управлении остальными компонентами. Этот модуль в основном состоит из микроконтроллера STM32F407, который отличается большим объемом памяти и низким энергопотреблением. На материнской плате была разработана схема преобразования напряжения, обеспечивающая правильное питание каждого модуля в устройстве.

Детали портативного устройства. а Портативное устройство на основе плазмонного термодатчика. б Схема аппаратного обеспечения:материнская плата, лазерный и сенсорный модуль, а также пользовательский интерфейс. c Картридж для полосок

На материнской плате было применено пять интерфейсов для связи с другими модулями. Датчик температуры был подключен к материнской плате через интерфейс IIC для приема сигналов температуры, передаваемых датчиком. Для точного измерения температуры мы выбрали датчики температуры с цифровым выходом. Датчик для режима проводимости представлял собой полупроводниковый датчик (ADT7420, Analog Devices) с 16-битным температурным разрешением (0,0078 ° C) и низким энергопотреблением (700 мкВт). В режиме излучения мы использовали инфракрасный термометр (MLX90614, Melexis) с разрешением по температуре 17 бит и потребляемой мощностью 3,9 мВт. Интерфейс между модулем управления лазером и материнской платой состоял из схемы управления реле для обеспечения точного управления лазерным диодом и защиты материнской платы от сильного тока. Лазерный модуль состоит из трех компонентов:(1) компонента управления лазером (дополнительный файл 1:Рисунок S1), (2) лазерного диода (Thorlabs, M9-A64-0200), который обеспечивает источник света с длиной волны 1064 нм. и максимальная выходная оптическая мощность 200 мВт, и (3) асферическая линза (Thorlabs, 354330-C), установленная в лазерном модуле, чтобы преобразовать свет, излучаемый лазерным диодом, в область размером 1 мм × 2,5 мм. Эти компоненты позволили точно осветить тестовую линию на полоске. Сенсорный ЖК-экран (TaoJinChi Corporation TJC4827K043_01RN, 480 × 272 пикселей) использовался для обеспечения графического пользовательского интерфейса. Интерфейс 4 платы оставлен для загрузки и отладки программы. В устройстве был собран интерфейс USB, который служил портом для зарядки аккумулятора и портом связи между устройством и дополнительным внешним компьютером. Прототип питался от литиевой батареи емкостью 10000 мАч. Программы в MCU были скомпилированы программным обеспечением IAR (версия 7.50.2.10505). Графический интерфейс пользователя был разработан с использованием программного обеспечения USART HMI.

Дизайн футляра-прототипа и картриджа с тест-полосками

Чтобы устройство было удобным и портативным, были спроектированы напечатанный на 3D-принтере корпус и картридж, улучшающие помехоустойчивость и стабильность устройства. В качестве материала корпуса и картриджа использовалась смола белого цвета. Для проектирования использовалось программное обеспечение Solidworks 2018.

Кубовидный корпус (дополнительный файл 1:рисунок S2a) и прямоугольная нижняя пластина (дополнительный файл 1:рисунок S2b) были разработаны для устройства в соответствии с формой внутренних компонентов. Кубовидный корпус обеспечивал фиксированное положение для монтажа ЖК-экрана и модуля управления лазерным диодом. Прямоугольная прорезь на боковой стороне корпуса использовалась для вставки картриджа с тест-полосками. Нижняя пластина была снабжена аккумулятором и основанием для монтажа материнской платы, что позволяло прикреплять компоненты к нижней пластине без перемещения. Все детали детектирования были закреплены на нижней пластине. Опорная рама для датчика и картриджа со стрипами была установлена ​​в нижней пластине, обеспечивая их тесный контакт. Для лазерного диода и линзы была предусмотрена подвижная дорожка точной настройки, позволяющая фиксировать и регулировать расстояние. Размер всего кожуха составлял 133 мм × 108 мм × 73 мм.

Для защиты тест-полосок был разработан специальный картридж (рис. 1в, 15 мм × 4 мм × 70 мм). Картридж имел три окна, одно для загрузки образца и еще два для визуализации тестовой линии и контрольной линии соответственно. Окно тестовой линии было спроектировано немного меньше ширины тестовой полоски, чтобы гарантировать, что лазер не может пройти через тест-полоску и повлиять на обнаружение датчика. На задней части картриджа была сделана опорная выемка, позволяющая проводящему датчику полностью касаться обратной стороны полосок в положении тестовой линии, при этом гарантируя, что датчик излучения может правильно определять температуру.

Алгоритм измерения температуры и расчета параметров

Поскольку лазер освещал наночастицы, в тестовой линии выделялось тепло, которое вызывало заметные изменения температуры. Это тепловыделение ( Q , Вт / м ³ ) зависит от концентрации наночастиц ( C , OD / мл), площадь освещения ( A , м ² ) и интенсивность лазера ( I , Вт / м ² ) [22] по следующей формуле:

Тепловой сигнал (температура) регистрировался, когда полоски освещались лазером. Поскольку площадь освещения и интенсивность лазера поддерживались постоянными, тепловой сигнал изменяется в зависимости от количества наночастиц, связанных на тестовой линии. Для количественной оценки тепловыделения сравнивались два метода. Первый использовал изменения температуры (Дополнительный файл 1:Рисунок S3) для количественной оценки теплового сигнала. Изменение температуры (∆ T ) был рассчитан для определения:

где T _конец конечная (максимальная) температура, достигнутая в конце облучения и T ₀ - начальная температура окружающей среды, зарегистрированная датчиком перед началом облучения. Другой метод использовал количественный расчет площади под кривой (AUC, дополнительный файл 1:рисунок S3). Этот метод делит кривую на трапеции в соответствии с частотой дискретизации 10 Гц с последующим вычислением сложения всех трапеций. Тепловой сигнал был получен путем деления площади на время обнаружения ( t _det ):

При применении обоих методов при обнаружении анализ AUC дал лучшую воспроизводимость количественной оценки (дополнительный файл 1:рисунок S4). Поэтому для использования в окончательной количественной оценке тепла был выбран анализ AUC.

Чтобы оценить эффективность различных методов обнаружения, мы оценили уровень детализации количественной оценки. В каждом эксперименте мы измеряли одну концентрацию для четырех образцов (четыре полоски, n =4). Учитывая стандартное отклонение (σ ₀ ) пустой группы и чувствительность ( S ), который представляет собой наклон стандартной кривой в линейном диапазоне, мы оценили LOD, как показано ниже:

Процедура анализа

Вся процедура анализа состояла из трех основных этапов:(1) сбор данных, (2) обнаружение и получение результатов и (3) отображение и хранение результатов. Сначала тест-полоска загружалась в картридж и вставлялась в устройство. Измерение проводилось простым нажатием кнопки обнаружения и вводом информации о пациенте (при желании вместо этого можно ввести анонимный код). Информация была передана в блок микроконтроллера (MCU) и сохранена. Затем MCU активировал датчик температуры и лазерный диод, чтобы начать тест. Между тем, данные о температуре, полученные MCU, отправлялись на ЖК-дисплей для отображения и построения графика в реальном времени. После обнаружения MCU рассчитал значение AUC и отобразил результат на экране.

Результаты и обсуждение

Характеристика наночастиц

УФ-видимые спектры сопряженных наноприемников показаны на рис. 2а, что указывает на то, что максимальный пик приходится на 1130 нм. Поглощение AuNPr на длине волны лазера (1064 нм) составляет 92% процентов от максимального поглощения на длине волны 1130 нм. СЭМ- и ПЭМ-изображения (рис. 2b, c) были собраны для визуализации морфологии наночастиц, подтверждая большинство треугольных форм.

Характеристика золотых наноприм. а УФ-видимые спектры наночастиц. Репрезентативные изображения неконъюгированных наночастиц, визуализированные b SEM и c ТЕМ

Оптимизация условий измерения на устройстве

При тепловом зондировании время обнаружения и расстояние от лазерного диода до тестовой линии являются основными факторами, влияющими на реакцию сигнала [27, 28]. Эти два фактора были изучены для оптимизации условий измерения. Для оптимизации времени облучения мы облучали полоски в течение 10 мин и регистрировали изменения температуры обоими датчиками соответственно. Как видно из рис. 3а, повышение температуры продолжалось в течение 10 мин, но через 120 с повышение температуры начинало выходить на плато. Этот результат совпадает с предыдущими исследованиями, в которых наблюдалась аналогичная тенденция изменения теплового сигнала во времени [28]. С учетом требований POCT и энергопотребления время обнаружения устройства было установлено на 120 с.

Оптимизация теплового зондирования. а Изменение температуры за 10 мин облучения. б Тепловой сигнал на разных дистанциях облучения

Затем была проведена оптимизация расстояния. Рисунок 3б показывает, что тепловой сигнал уменьшается с увеличением расстояния между лазерным диодом и тестовой линией. Причина может заключаться в том, что мощность лазера, достигающая тестовой линии, ослаблялась по мере того, как расстояние увеличивало эффективную облучаемую площадь. Для получения максимального отклика сигнала было установлено расстояние 7 мм.

Влияние температуры окружающей среды на тепловое зондирование

Поскольку измерение температуры тесно связано с температурой, необходимо было исследовать, как температура окружающей среды влияет на измерение температуры. Температура окружающей среды варьировалась от 27,5 до 40 ° C с использованием инкубатора. Всего было измерено 4 образца в каждой температурной точке с интервалом 2,5 ° C. Кривые зависимости температуры окружающей среды от теплового сигнала были измерены для холостых полосок и полосок с OD / мл соответственно обоими методами измерения температуры. Параметры аппроксимирующей кривой для температуры окружающей среды показаны в таблице 1. На рис. 4а показано, что в режиме проводимости наклон кривой в целом был согласован для разных концентраций, что указывает на то, что изменения температуры окружающей среды одинаково влияют на разные концентрации. В результате кривую внешнего воздействия можно использовать для калибровки количественных результатов. В режиме излучения наклоны кривых (рис. 4b), соответствующих двум концентрациям, согласовывались друг с другом, но обе кривые имели тенденцию к снижению. Результаты показывают, что режим проводимости более надежен при измерении образцов в условиях с высокой изменчивостью температуры.

Влияние температуры окружающей среды. а Тепловой сигнал изменяется в зависимости от температуры окружающей среды в кондуктивном режиме. б Тепловой сигнал изменяется в зависимости от температуры окружающей среды в режиме излучения

Количественная оценка наночастиц

Обнаружение теплового датчика

Для получения стандартных кривых количественного определения использовались два метода измерения температуры (дополнительный файл 1:рисунок S5), соответственно, для обнаружения тест-полосок, содержащих наночастицы в диапазоне от 0 до 10 OD / мл. Эти полоски (дополнительный файл 1:рис. S6a), содержащие наночастицы различной концентрации, были обнаружены упомянутым портативным устройством (см. Раздел «Материалы и методы»). Настройки обоих датчиков в устройстве представлены в Дополнительном файле 1:Рисунок S5a и S5b. Четыре образца были протестированы для каждой концентрации при температуре окружающей среды 27,5 ° C. Устройство применило метод AUC для расчета теплового сигнала на тестовой линии. Следовательно, количественная оценка теплового сигнала была пропорциональна количеству наночастиц на тестовой линии. Кривые количественного определения (рис. 5а) были построены путем линейной регрессии данных, полученных из теплового сигнала, в зависимости от концентрации наночастиц и представлены формулами в таблице 2.

Количественная оценка наночастиц. а Стандартные количественные кривые для трех методов. б Количественные результаты при низкой концентрации с линейными кривыми

Из таблицы 2 видно, что чувствительность режима излучения была в 15 раз выше, чем у режима проводимости. Предел обнаружения мод проводимости и излучения составлял 0,053 ОП / мл и 0,023 ОП / мл соответственно. При тепловом зондировании режим излучения улучшил предел обнаружения (LOD) в 2 раза по сравнению с режимом проводимости. Стабильность полосок LFA также была проверена, как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S7. Режим кондуктивного измерения температуры требует передачи тепла между двумя твердыми телами. Когда температура тестовой линии быстро повышается, требуется время (время релаксации) для того, чтобы датчик достиг той же температуры, что и тестовая линия. В результате температура датчика была ниже, чем фактическая температура в тестовой линии в конце обнаружения. С другой стороны, режим излучения не требовал передачи тепла датчику, поскольку датчик непосредственно регистрировал ИК-волну, излучаемую тестовой линией, чтобы получить ее текущую температуру. В кондуктивном режиме обнаружения часть тепла рассеивалась из-за наличия хороших теплопроводов, которые работали как радиатор, тогда как при обнаружении излучения только воздух и сама полоса участвовали в отводе тепла. Этими причинами можно объяснить, что чувствительность кондуктивного метода ниже, чем лучевого метода.

When testing strips with a concentration of 10 OD/mL, we found that there was a burning mark using the radiation (non-contact) sensing mode. One possible reason for this phenomenon is that in the non-contact measurement, the low thermal conductivity of the air allows the heat to be retained in the test line and dissipate less efficiently, increasing the effective local temperature and eventually causing the combustion of the membrane.

In the contact mode of detection, however, the sensor with a large thermal conductivity acted as medium and heatsink. In this way, heat was conducted to the sensor so that no combustion occurred in the test line.

Comparison Between Thermal Sensing and Visual Detection

Due to its popularity for portable devices and wide use, we compared the thermal sensing with visual detection for its detection ability. For visual detection, the pictures of the strip were taken by a conventional microscope digital camera. The test strips were mounted in the cartridge to ensure the positional consistency of the image analysis in a similar fashion than with the thermal sensing. Software Image J was used to analyze the grey value in the test line for different concentrations of nanoparticles. A standard curve (Fig. 5a) of the visual detection method was plotted based on the results of this analysis. The linear range between the grey value and the concentration of nanoparticles was 0.2–10 OD/mL (R ² was 0.770 for the range of 0–0.2 OD/mL, so they were thus discarded from further analysis). The detection limit was 0.268 OD/mL. The results indicated that thermal sensing could reduce LOD by 5- to 12-fold compared to visual detection. In Qin’s research, they found that the LOD for visual analysis was 100-fold higher than thermal contrast [21]. Since they employed a high laser power and an infrared camera, they gained greater difference in LOD. One reasonable explanation for the LOD improvement is that thermal sensing is able to measure the nanoparticles on top and beneath the membrane surface. Another advantage of thermal sensing is that it has a higher stability than visual detection. Thermal sensing generates heat by the nanoparticles on the entire test line. Visual detection relies only on the color reaction of the nanoparticles on the surface of the test line. Even if the analyte concentrations of two test strips are the same, the distribution of the nanoparticles on the T-line in the tangent plane is different; thus, the visual inspection will result in a difference in the detection results while the thermal sensing is more stable and reproducible. On the contrary, the sensitivity of the visual detection was 2-fold higher than thermal sensing. Visual detection is a direct method for quantifying nanoparticles, while thermal sensing is an indirect measurement of the concentration of the nanoparticles by measuring the temperature changes, which may partially explain the lack of sensitivity. Figure 5b demonstrates that the linear range of detection for thermal sensing can be as low as 0 OD/mL, with the R ² of 0.972 (conduction) and 0.987 (radiation), suggesting that thermal sensing has a better potential for its applications in early detection in POCT than color quantification, since the target analytes are in lower concentrations.

Quantitative Detection of HCG

Finally, the biomarker HCG was quantified using our system in order to validate the thermal sensing. Both conduction and radiation modes were applied to quantify the HCG. The optical power was turned down to 150 mW, preventing the strips from burning. Strips (Additional file 1:Figure S6b) with four different concentrations were tested. Figure 6a and b show that the thermal signals were linear to the concentration of HCG from 35 to 700 mUI/mL. When the concentration was extended to the range of 35–7000 mUI/mL, the linearity was between the logarithm of the concentration and the thermal signal as in Fig. 6c, d. In conduction mode, the LOD was 64.2 mIU/mL which is in a similar range than the visual detection. However, the ideal LOD of the radiation mode was 2.8 mIU/mL. The data matched with the quantification of nanoparticles. Compared with other devices that applied photothermal effect (LOD =5.5 mIU/mL) [27], our device in radiation mode reduced the LOD by nearly 2-fold. Those results proved that thermal sensing is an effective way in LFA detection and quantification.

The standard curves of HCG. а A linear curve between the logarithm of the HCG concentration and the thermal signal in radiation mode. б A linear curve between the logarithm of the HCG concentration and the thermal signal conduction mode. c The quantification results of HCG in radiation mode. г The quantification results of HCG in conduction mode

Conclusions

A plasmonic thermal sensing method for LFA detection was established. A portable device based on this method was developed by applying different temperature sensors (conduction and radiation modes). The study of the influence of the ambient temperature demonstrated that it has a negative impact on the thermal sensing and conduction mode was less affected than radiation mode. In radiation mode, the impact was more significant at high concentrations. Both modes were also tested to compare the quantification ability. When compared with the traditional visual detection, the thermal sensing methods showed a 5- to 12-fold improvement in LOD for nanoparticle quantification. The radiation mode showed a better performance than conduction mode in both sensitivity and LOD. In the validation of thermal sensing, LFA strips for the detection of HCG were tested and the results demonstrated that the radiation mode was much more sensitive than the conduction mode. In this way, we proved that thermal sensing is a feasible and effective way for early detection in LFA platforms.

In conclusion, plasmonic thermal sensing can truly improve the analytical sensitivity and shows a promising future in LFA detection for early diagnostic applications. The portable device described herein provided two sensing approaches to satisfy different requirements.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, использованные и / или проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Сокращения

AUC:

Area under the curve

AuNPrs:

Gold nanoprisms

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

CCD:

Устройство с зарядовой связью

CMOS:

Complementary metal oxide semiconductor

HCG:

Human chorionic gonadotropin

LFA:

Lateral flow assay

LOD:

Limit of detection

LSPR:

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс

MCU:

Microcontroller unit

MES:

4-Morpholineethanesulfonic acid

NIR:

Ближний инфракрасный порт

PBS:

Phosphate-buffered saline

POCT:

Тестирование на месте

PVC:

Polyvinyl chloride

PVP:

Poly-vinyl-pyrrolidone

S-NHS:

N -Hydroxysulfosuccinimide