Воздействие наночастиц диоксида титана во время беременности изменило микробиоту кишечника матери и повысило уровень глюкозы в крови крыс

Введение

Наночастица диоксида титана (TiO ₂ NP) является одним из наиболее широко используемых наноматериалов, и его можно легко найти в солнцезащитных кремах, красках, чернилах и пищевых продуктах [1, 2]. Они могут легко высвобождаться и попадать в организм человека при использовании коммерческих продуктов. Примечательно, что беременным женщинам не избежать контакта с ними. Исследования на животных показали, что наблюдалась дисфункция яичников и репродуктивной системы [3], а также нарушение моноаминергических нейромедиаторов [4], когда взрослые самки мышей подвергались воздействию TiO ₂ НП. Кроме того, осложнения беременности и неблагоприятные исходы родов наблюдались также после воздействия на беременных мышей TiO ₂ НП [5]. Все вышеперечисленные исследования показали, что TiO ₂ НЧ были вредны для взрослых самок животных, а также для беременных самок, но механизмы не были полностью изучены. Поэтому для оценки безопасности TiO ₂ необходимо провести соответствующие исследования. НП.

TiO ₂ НП используется как своеобразное мощное антибактериальное средство; они могут убить многие виды бактерий, в том числе золотистый стафилококк , Сальмонелла, Streptococcus mutans и т. д. [6]. На самом деле антибактериальные эффекты были неселективными, в то время как большинство текущих исследований в основном сосредоточено на их влиянии на уничтожение вредных бактерий, лишь немногие сообщили, что TiO ₂ НЧ убивают пробиотики или другие симбиотические бактерии и оказывают неблагоприятное воздействие на людей. Исследования о том, может ли TiO ₂ НЧ изменят нормальный состав микробиоты кишечника и причинят вред беременным самкам; поэтому мы провели это исследование с точки зрения микробиоты кишечника.

В последнее время все больше и больше исследований показывают, что микробиота кишечника тесно связана с заболеваниями человека, включая диабет 2 типа [7] и ожирение [8]. Пробиотики могут влиять на метаболизм беременных женщин с гестационным диабетом [9] и изменять метилирование связанных с диабетом генов у плода [10]. Исследования показали, что уровень глюкозы в плазме повышался, когда взрослые мыши подвергались воздействию TiO ₂ НП на 12 недель [11]. Не сообщалось, повысится ли уровень глюкозы в крови беременных женщин после воздействия и сократится ли период воздействия.

Все упомянутые выше исследования показали, что TiO ₂ НЧ могут влиять на микробиоту кишечника и повышать уровень глюкозы в плазме, но нет прямых доказательств, подтверждающих связь между микробиотой кишечника и уровнем глюкозы в крови матери, а механизмы также не ясны. Предыдущие исследования в основном сосредоточены на исследованиях на взрослых животных и влиянии TiO ₂ НЧ беременных женщин просто изучали с точки зрения микробиоты кишечника. В этом исследовании мы создали модель воздействия беременных крыс, чтобы выяснить, изменится ли микробиота кишечника матери и как они изменятся после воздействия TiO ₂ на беременных самок. NPs, и мы попытались ответить на вопрос, какие неблагоприятные последствия для беременных женщин вызовут изменения микробиоты кишечника после TiO ₂ Воздействие НЧ. Наше исследование вызвало опасения по поводу безопасности TiO ₂ НЧ беременным, и мы раскрыли потенциальные механизмы.

Материалы и методы

Дизайн исследования

На основе исследования, проведенного Weir A. и его коллегами на людях [12], были определены путь воздействия и доза воздействия на крыс. Самкам крыс ежедневно через желудочный зонд вводили 5 мг / кг массы тела / день TiO ₂ . НЧ с 5-го по 18-й день после беременности, и прогресс показан на рис. 1а. Каждую крысу взвешивали перед пероральным воздействием, и 0,5% метилцеллюлозы использовали в качестве контроля.

а Экспериментальный дизайн этого исследования. б ПЭМ-изображения TiO ₂ НЧ, бар =50 нм. c Основные характеристики TiO ₂ Были представлены NP, измеренные или зарегистрированные производителем

Животные

Исследования на животных проводились с разрешения комитета по этике. Крысы Sprague-Dawley (SD) были приобретены у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Самки крыс ( n =8, возраст 12 недель) были отделены от самцов крыс ( n =8, 14 недель), а крысы того же пола содержались в большой клетке. Всех крыс содержали в условиях с контролируемой температурой (22 ± 2 ° C) и влажностью (40-60%) с 12-часовым циклом свет / темнота с 1 недельным отдыхом. Затем крыс-самок случайным образом делили на контрольную группу ( n =4) и группа воздействия ( n =4) и спаривали с самцами в соотношении 1:1 в индивидуальных клетках. Каждое утро наблюдали за вагинальной пробкой, и наличие вагинальной пробки подтверждало беременность и регистрировало как 0,5 дня беременности (GD 0,5), а беременных крыс выращивали в отдельных клетках.

TiO ₂ Подготовка и администрирование НП

TiO ₂ NP - коммерческий продукт, приобретенный у Sigma-Aldrich (13463-67-7). Стандартный раствор TiO ₂ НЧ растворяли в метилцеллюлозе (0,5%) в концентрации 5 мг / мл в соответствии с предыдущим исследованием [13] и обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин (100 Вт). Гидродинамический диаметр TiO ₂ НЧ в метилцеллюлозе измеряли с помощью динамического светорассеяния (DLS).

Сбор кала и подготовка общей ДНК фекалий

Кал каждой крысы собирали в GD 0 (перед спариванием), GD 10 и GD 17 в процессе беременности, соответственно. Перед анализом бактериального разнообразия фекалии хранили при -80 ° C. Тотальную ДНК фекалий экстрагировали с использованием набора Power Soil DNA kit (Mo Bio Laboratories, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя. А концентрации ДНК измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop (NanoDrop ™ 2000 / 2000C, США).

Секвенирование гена 16S рРНК и анализ данных

Бактериальное секвенирование генов 16S рРНК проводили с помощью платформы Illumina MiSeq (Hangzhou Guhe Information and Technology Co., Ltd., Zhejiang, China). Области V3 и V4 бактериальной 16S рРНК амплифицировали со специфическими праймерами, как описано ранее [14]. И ДНК подвергали секвенированию Illumina MiSeq после амплификации и очистки. Данные секвенирования были обработаны с использованием количественной информации о микробной экологии (QIIME) в соответствии с предыдущими исследованиями [15]. Данные считывались и объединялись из исходных фрагментов ДНК, и длина считывания составляла от 400 до 500 п.н. Химерные последовательности были дополнительно исследованы с использованием QIIME, если это произошло.

Сбор образца крови и определение уровня глюкозы в крови

Венозную кровь натощак у всех самок крыс также собирали соответствующим образом при сборе фекалий. Образцы крови собирали из хвостовой вены утром после 12 ч голодания при GD 0, GD 10 и GD 17 соответственно. Затем уровень глюкозы в крови натощак был сразу же определен с помощью глюкометра Roche ACCU-CHEK® Performa в соответствии с протоколом производителя после сбора.

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с помощью Graphpad Prism 6; все данные о разнообразии бактерий были представлены в виде прямоугольных диаграмм в виде среднего ± стандартная ошибка, а значимость среди всех групп была исследована с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета. P <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Характеристики TiO ₂ НП

Основные характеристики TiO ₂ НЧ были измерены и представлены перед исследованиями на животных. На рисунке 1b показано поле зрения TiO ₂ . НЧ под просвечивающим электронным микроскопом. Морфология TiO ₂ НЧ представляли собой почти сферу с первичным диаметром около 21 нм. Средний гидродинамический диаметр в растворе метилцеллюлозы составлял около 199,5 нм (рис. 1с). Чистота TiO ₂ НП равно ≥ 99,5%, а площадь поверхности 35–65 м ² / г по отчету производителя. Недавние исследования показали, что TiO ₂ как нано-, так и мелкой фракции может повышать уровень глюкозы в крови взрослых животных после перорального воздействия [11, 16], и неизвестно, повлияет ли это на уровень глюкозы в крови беременных самок. Чтобы прояснить этот вопрос и основные механизмы, мы создали модель воздействия на беременных крыс для оценки токсичности TiO ₂ NPs и исследовать вред беременным крысам.

Большинство TiO ₂ частицы в продуктах имеют первичный размер в основном от 60 до 300 нм, меньшая часть (~ 20%) составляла <100 нм [17], в то время как недавнее исследование показало, что количество TiO ₂ НЧ в некоторых пищевых продуктах намного больше, чем нам известно (~ 90%), например, в жевательной резинке [18]. Как известно, более мелкие наночастицы обладают более высокой токсичностью [19, 20], а самки более чувствительны к вредным субстратам во время беременности, поэтому меньшая часть TiO ₂ НЧ могут оказывать неблагоприятное воздействие на беременных женщин, чем большинство мелких частиц. В этом исследовании мы подвергли модель беременных крыс воздействию наноразмерного TiO ₂ (~ 21 нм) для изучения потенциальных рисков TiO ₂ НП беременным.

Изменение разнообразия бактерий во время нормальной беременности

Во время вынашивания беременные женщины становятся более чувствительными к физическим и химическим воздействиям; Чтобы уменьшить влияние ручной операции на имплантацию оплодотворенной яйцеклетки, 5-й день был выбран в качестве первого дня воздействия, когда имплантация бластул завершилась. GD 17 - последний день перед родами, GD 10 - середина беременности. Нормальную динамику микробиома кишечника во время беременности исследовали с использованием образцов фекалий из трех временных точек контрольных групп (GD 0, GD 10 и GD 17). Мы наблюдали альфа-разнообразие кишечного микробиома с течением времени, вычисляя индексы Шеннона, Симпсона и Chao1, но разница не была значительной (рис. 2а). На основании анализа неметрического многомерного масштабирования (NMDS) не было обнаружено заметных различий в образцах из разных временных точек (рис. 2b), что согласуется с предыдущими исследованиями [21, 22]. Диаграмма Венна (рис. 2c) показывает общие и специфические операционные таксономические единицы (OTU) в выборках в разные моменты времени, а общие OTU для трех временных точек (GD 0, GD 10, GD 17) в контрольных группах составили 164; эти результаты показали, что количество конкретных OTU увеличивалось со временем во время беременности. Наши результаты показали, что микробиота кишечника не выявила значительных изменений во время нормальной беременности, и эти изменения не принесут вреда и даже полезны для матери. Наши результаты предполагают, что изменение микробиоты кишечника может быть результатом процесса беременности, который может быть вызван гормональными изменениями у беременных женщин [23], подобно изменению микрофлоры влагалища во время беременности [24]. Кроме того, это может быть предпосылкой для нормальной беременности.

Изменение характеристик микробиоты кишечника у контрольных (необлученных) крыс при нормальной беременности. а Альфа-разнообразие кишечного микробиома, выявленное с помощью индекса Шеннона, Симпсона и Чао1. б Бета-разнообразие было выявлено с помощью неметрического многомерного масштабного анализа (NMDS). c Уникальные и общие номера операционных таксономических единиц (OTU) были представлены на диаграмме Венна. D0 Ctrl означает крыс в контрольной группе до спаривания, d10 Ctrl и d17 Ctrl означает контрольных крыс в GD 10 и GD 17 соответственно

Изменения разнообразия бактерий после воздействия TiO ₂ НП во время беременности

Исследования показали, что микробиота кишечника имеет решающее значение для поддержания нормального иммунитета [25]; естественное изменение микробиоты кишечника во время нормальной беременности может регулировать иммунную систему, чтобы принять имплантацию оплодотворенных яйцеклеток [26]. Между тем, естественное изменение микробиоты кишечника во время нормальной беременности также может помочь беременным женщинам адаптироваться к метаболическим изменениям во время беременности. Как только изменение микробиоты кишечника превысит «надлежащую степень», может наступить неблагоприятный исход беременности. Итак, мы проанализировали изменения микробиоты после TiO ₂ Экспозиция НЧ в следующей части. Эффекты TiO ₂ НЧ на разнообразие бактерий во время беременности оценивали путем анализа альфа-разнообразия и бета-разнообразия в GD 0, GD10 и GD17 после того, как самки подвергались воздействию наночастиц. Результаты показали, что альфа-разнообразие демонстрирует тенденцию к увеличению по Шеннону и значительное изменение индекса Симпсона ( P <0,05) по сравнению с нормальной беременностью, но без разницы в Chao1 (рис. 3a). Анализ NMDS (рис. 3b) также не показал значительной разницы, как при нормальной беременности, но после воздействия TiO ₂ NPs, удельные OTU в выборках уменьшались на средних и поздних сроках беременности (рис. 3c). Во время нормальной беременности разнообразие кишечной микробиоты не претерпело очевидных изменений, но мы наблюдали тенденцию к увеличению разнообразия бактерий в фекалиях матери после того, как самки мышей подверглись воздействию TiO ₂ НП во время беременности, что может быть связано с TiO ₂ НЧ являются высокоэффективным антибактериальным средством и могут убивать многие виды бактерий; они подавляли доминирующие бактерии в кишечнике, и изначально подавленные бактерии могли воспроизводиться в этом состоянии. Исследования показали, что микробиота кишечника связана со многими заболеваниями, включая диабет, ожирение, гипертонию [27] и рак [28]; также была подтверждена связь между микробиотой кишечника и гестационным диабетом [29]. Причина, по которой после воздействия не наблюдалось значительных изменений между GD 0, GD10 и GD17, может заключаться в том, что TiO ₂ НЧ были «относительно безопасными», или изменения микробиоты, вызванные TiO ₂ Воздействие НЧ может перекрываться изменениями микробиоты беременных.

Изменения характеристик кишечной микробиоты крыс, подвергшихся облучению, во время беременности. а Альфа-разнообразие кишечного микробиома, выявленное с помощью индекса Шеннона, Симпсона и Чао1. б Бета-разнообразие было выявлено с помощью анализа NMDS. c Уникальные и общие номера OTU были представлены на диаграмме Венна. D0 Test означает образцы, взятые у крыс до воздействия TiO ₂ NPs, d10 Test и d17 Test означают образцы, собранные от подвергшихся воздействию крыс на GD 10 и GD 17 соответственно

Изменения кишечной микробиоты во втором триместре после воздействия TiO ₂ НП

Чтобы исключить последствия беременности и дополнительно выяснить независимые эффекты TiO ₂ НЧ на микробиоту кишечника, мы сравнили различия микробиома кишечника между контрольной группой и группой лечения с использованием образцов, собранных во втором триместре (GD 10). Существенной разницы в альфа-разнообразии по индексам Шеннона, Симпсона и Чао1 не обнаружено (рис. 4а). Заметное различие было обнаружено между двумя группами на основании анализа NMDS (рис. 4b). Рисунок 4c показывает, что воздействие TiO ₂ NPs привели к изменениям некоторых специфических OTU в экспериментальной группе по сравнению с контролем (Venn). Эти результаты показали, что TiO ₂ НЧ были относительно безопасными и не вызывали явного дисбактериоза. Но состав флоры, а именно численность определенного рода, изменилась во втором триместре и на поздних сроках беременности соответственно. Чтобы дополнительно выяснить потенциальные риски изменений, произошедших во время беременности, и изучить возможные побочные эффекты, мы определили функциональные изменения микробиоты кишечника с помощью биоинформатики. Результаты показали, что два доминирующих биомаркера, Ellin6075 и Clostridiales, были обнаружены с помощью анализа LefSe (линейный дискриминантный анализ (LDA)> 2). Изобилие Ellin6075 было уменьшено, а количество Clostridiales увеличилось после TiO ₂ Воздействие НЧ соответственно (рис. 4г). Ellin6075 был изолирован на ферме в Австралии, но информации о его фенотипических особенностях или функциях было мало, поэтому их влияние на беременность требует дальнейшего изучения. Ян и его коллеги показали, что Clostridium значительно увеличивался у крыс SD с ожирением [30], что согласуется с нашим выводом о сосуществовании Clostridiales с высоким уровнем глюкозы в крови. Чтобы выявить влияние изменения микробиоты кишечника на беременность, мы предсказали различия генов в образцах фекалий, используя филогенетическое исследование сообществ путем реконструкции ненаблюдаемых состояний (PICRUSt) (рис. 4e), и обнаружили, что гены, отвечающие за функцию, связанную с сахарным диабетом 2 типа, и Белки биосинтеза липидов были усилены в группе лечения, в то время как метаболизм таурина и гипотаурина был ослаблен. Исследователи продемонстрировали, что микробиота кишечника может генерировать короткоцепочечные жирные кислоты, включая уксусную кислоту, пропионовую кислоту, и, в свою очередь, регулировать уровень глюкозы в крови хозяина [31]. И изменение таурина и гипотаурина также соответствовало тому факту, что таурин мог снижать концентрацию глюкозы в крови матери [32].

Изменения характеристик кишечной микробиоты между контрольными крысами и TiO ₂ NP подвергал крыс воздействию GD 10. a , b Альфа- и бета-разнообразие кишечного микробиома было представлено в виде индексов Шеннона, Симпсона и Чао1, а также анализа NMDS. c Диаграмма Венна показывает характеристики OTU. г , e Доминирующие биомаркеры и связанные с ними функции генов были обнаружены Lefse и филогенетическим исследованием сообществ путем реконструкции предсказания ненаблюдаемых состояний (PICRUSt) соответственно. D10 Ctrl означает контрольных крыс в GD 10, d10 Test означает экспериментальных крыс в GD 10

Изменения кишечной микробиоты на поздних сроках беременности после воздействия TiO ₂ НП

Микробиом кишечника на поздних сроках беременности исследовали по образцам фекалий, собранным в GD17. Не было обнаружено значительных различий в альфа-разнообразии (рис. 5а). Эти образцы были значительно разделены по контрольной группе и группе лечения в модели NMDS (рис. 5b). Как показано на рис. 5c, в группе лечения было обнаружено уменьшенное количество наблюдаемых OTU. Мы также использовали Lefse для определения потенциальных биомаркеров. Примечательно, что, как показано на рис. 5d, количество персистирующего Ellin6075 снизилось в экспериментальной группе на поздних сроках беременности (LDA> 2), а численность Dehalobacteriaceae снизилась из-за воздействия TiO ₂ Также НП (LDA> 2). На этом этапе изменений генов, связанных с сахарным диабетом, не наблюдалось, что позволяет предположить, что второй триместр, а не последний триместр, был чувствительным окном для TiO ₂ НП для повышения уровня глюкозы в крови матери. И результат согласуется с нашим клиническим признанием того, что наши врачи проводили пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), распространенный диагноз гестационного диабета у человека, для скрининга гестационного диабета у беременных во втором триместре (примерно на 26-й неделе беременности). беременные женщины). Результаты показали, что уровень глюкозы в крови натощак увеличился на GD 10 после того, как беременные крысы подверглись воздействию TiO ₂ NPs и предшествовал ранее опубликованному результату (~ 12 недель) у взрослых животных [11], который доказал тот факт, что беременные самки были более чувствительны, чем взрослые.

Изменения характеристик кишечной микробиоты между контрольными крысами и TiO ₂ NP подвергал воздействию крыс в GD 17. a Показатели Шеннона, Симпсона и Чао1, которые представляют альфа-разнообразие, сравнивались между двумя группами. б Бета-разнообразие было выявлено с помощью анализа NMDS. c Диаграмма Венна, показывающая уникальные и общие OTU в двух группах. г Лефсе нашел кандидатные биомаркеры (LDA> 2) и предсказал различия функций генов. е Уровни глюкозы в крови натощак у крыс измеряли при GD 0, GD 10 и GD 17 после воздействия TiO ₂ НП. D17 Ctrl и d17 Test означает контрольную и подвергшуюся воздействию крыс на 17-й день беременности соответственно

Эффекты TiO ₂ НЧ на уровень глюкозы в крови после пренатального воздействия

Чтобы подтвердить результаты прогноза PICRUSt, мы измерили уровень глюкозы в крови крыс натощак на GD10 и GD17 соответственно. После воздействия на беременных крыс TiO ₂ НЧ в течение 12 дней (GD5 – GD17) измеряли уровень глюкозы в крови натощак. Как показано на фиг. 5e, по сравнению с контрольной группой, уровни глюкозы натощак у крыс значительно повысились на обоих уровнях GD10 ( P <0,05) и GD17 ( P <0,01) после воздействия TiO ₂ НП, что в соответствии с предыдущими отчетами, что TiO ₂ НЧ могут повышать уровень глюкозы в крови взрослых животных [11, 33]. Но прирост значения между контрольной группой и GD 17 был относительно небольшим (~ 0,5 мМ) и не достиг стандарта гестационного диабета [34]. Результаты показали, что одинокая мать, подвергшаяся воздействию TiO ₂ НЧ во время беременности недостаточно, чтобы вызвать гестационный диабет, но повышенный уровень глюкозы в крови может иметь неблагоприятные последствия для беременных женщин и их потомков. Также сообщалось, что воздействие более высокого уровня глюкозы в крови матери во время беременности может увеличить риск ожирения и аномальной толерантности к глюкозе у плода [35], что также напомнило нам, что TiO ₂ НП могут нести потенциальный риск для потомства.

Заключение

Наши исследования показали, что пренатальное воздействие TiO ₂ НЧ могут повышать уровень глюкозы в крови матери натощак, и изменения кишечной микробиоты могут быть основным механизмом. И делаем вывод, что TiO ₂ НЧ могут увеличивать риск гестационного диабета у беременных женщин, что должно привлечь наше внимание.

Сокращения

DLS:

Динамическое рассеяние света

GD:

День беременности

LDA:

Линейный дискриминантный анализ

NMDS:

Неметрическое многомерное масштабирование

OGTT:

Пероральный тест на толерантность к глюкозе

OTU:

Оперативные таксономические единицы

PICRUSt:

Филогенетическое исследование сообществ путем реконструкции ненаблюдаемых состояний

QIIME:

Количественное понимание микробной экологии

SD:

Спраг-Доули

TiO ₂ НП:

Наночастицы диоксида титана