SPIO усиливают кросс-презентацию и миграцию DC, а анионный SPIO влияет на наноадъювантные эффекты, связанные с интерлейкином-1β

Фон

Адъюванты широко применялись в клинических и экспериментальных целях, и долгое время их считали иммуностимулирующими агентами, пассивными депо или носителями, способными стимулировать требуемые иммунные ответы [1, 2]. В последние десятилетия в качестве адъювантов использовалось множество различных классов соединений, включая наночастицы, микробные продукты, эмульсии, цитокины, полимеры и липосомы [3,4,5]. Развитие наночастиц в качестве иммунных адъювантов (наноадъювантов) представляет собой замечательную область доставки антигена, основанную на усилении иммунных ответов. Среди всех типов наночастиц суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (SPIO) обладают высокой биосовместимостью, правильной структурой поверхности и гибким лигандным конъюгированием [6]. Эти свойства делают их применимыми во многих различных биомедицинских областях, таких как магнитно-резонансная томография (МРТ), адресная доставка лекарств и гипертермическая терапия [7, 8].

Дендритные клетки (DC), основные профессиональные антигенпрезентирующие клетки (APC), играют решающую роль в клеточно-опосредованном адаптивном иммунитете, в котором иммунологическая память генерируется после первичного ответа на конкретный антиген, и эта память приводит к усиленному ответу. к последующим встречам с этим антигеном [9, 10]. Кроме того, DC могут способствовать презентации экзогенных антигенов с помощью главного комплекса гистосовместимости класса I (MHC-I), процесса, называемого перекрестной презентацией, и затем активировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) [11]. Растворимые антигены, предназначенные для перекрестной презентации, интернализуются посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза и затем переносятся в цитоплазму для протеасомной деградации и загрузки пептидов. Обычные вакцины DC приводят к умеренному иммунному ответу из-за относительно неудовлетворительного транспорта растворимых антигенов. Поэтому во многих исследованиях наноадъюванты изучались как носители растворимых антигенов для усиления перекрестной презентации в ДК [12,13,14].

Материалы покрытия играют решающую роль в стабилизации и последующей функционализации водных суспензий SPIO [15]. В предыдущих исследованиях было показано, что положительно заряженные SPIO способствуют перекрестной презентации DCs для усиления иммунного ответа, и они превосходят эффект своих противоположно заряженных аналогов [16, 17]. Механизм, посредством которого по-разному заряженные SPIO могут влиять на кросс-презентацию антигенов DCs, не выяснен. Интерлейкин-1β (IL-1β), прототип провоспалительного цитокина, который участвует во врожденном иммунитете, может секретироваться иммунными клетками, такими как DC, при распознавании патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) и ассоциированных с повреждениями молекулярных паттернов (DAMP) [ 18]. Продукция IL-1β строго опосредуется инфламмасомами, особенно NLRP3 (белок 3, содержащий домены NACHT, LRR и PYD). Активация NLRP3 индуцирует продукцию каспазы-1, которая затем расщепляет неактивный про-ИЛ-1β до активной формы ИЛ-1β [19]. Некоторые неорганические наночастицы, такие как диоксид кремния, двойные углеродные нанотрубки и диоксид титана, могут вызывать образование инфламмасом [20,21,22]. Предыдущие исследования сообщили о корреляции между поверхностным зарядом наночастиц магнетита и их клеточной эффективностью [23]. Здесь мы предполагаем, что различные поверхностные заряды на SPIO-нагруженных DC могут также влиять на секрецию IL-1β, и наша цель - исследовать взаимосвязь между этими поверхностными зарядами и функцией перекрестного представления DC.

Методы и материалы

Подготовка SPIO

Для приготовления SPIO был использован простой метод соосаждения, как сообщалось ранее [24]. Вкратце, смешанный раствор FeCl ₃ и FeSO ₄ (мольное соотношение Fe ³⁺ :Fe ²⁺ =2:1) готовили в атмосфере азота и энергично перемешивали при 37 ° C в течение 30 мин. Осадок Fe ₃ черного цвета. О ₄ образовывались наночастицы, которые сразу пять раз промывали дистиллированной водой с использованием магнитной сепарации. Fe ₃ О ₄ затем диспергировали в дистиллированной воде до концентрации 3 мг / мл при pH 3. В конечном итоге суспензию аэрировали (воздухом) при 95 ° C и выделяли коричневые SPIO.

SPIO с покрытием DMSA (SPIO / D ^- ) и SPIO с покрытием APTS (SPIO / A ⁺ ) были получены путем покрытия SPIO мезо-2,3-димеркаптоянтарной кислотой (DMSA) и 3-аминопропилтриметоксисиланом (APTS) соответственно. Для SPIO / D ^- к 100 мл раствора SPIO добавляли водный раствор DMSA в молярном соотношении 1:40. После 4-часовой реакции при непрерывном перемешивании SPIO / D ^- отделяли со скоростью 500 об / мин при 50 ° C. Для SPIO / A ⁺ К раствору SPIO добавляли APTS в молярном соотношении 0.2:1 при интенсивном перемешивании в течение 5 ч. Затем осадок растворяли с помощью постоянного магнита и промывали деионизированной водой, а раствор обрабатывали ультразвуковыми волнами. Полученный раствор многократно промывали водой и SPIO / A ⁺ окончательно высушили в порошок при 37 ° C под вакуумом.

Мыши

Мышей C57BL / 6 и мышей C57BL / 6, трансгенных с усиленным зеленым флуоресцентным белком (EGFP), были приобретены в Центре исследований модельных животных Нанкинского университета и размещены в условиях, свободных от специфических патогенов (SPF), в Центральной лаборатории Нанкинского университета. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Медицинской школы Нанкинского университета, Китай.

Культура клеток

Мышиные DC были получены из костного мозга мышей, как описано ранее [25]. Вкратце, моноциты костного мозга 8-недельных мышей C57BL / 6 были отделены от их бедренных и большеберцовых костей. Затем клетки культивировали в RPMI-1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) вместе с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 10 нг / мл мышиного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).; Gibco, США) и 1 нг / мл мышиного интерлейкина-4 (IL-4, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA). Питательную среду заменяли свежей каждые 2 дня. Незрелые DC обычно собирали на 6 день. EGFP-DC получали от EGFP-трансгенных мышей C57BL / 6 в соответствии с методом, упомянутым выше.

Размороженные замороженные мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) выдерживали в течение ночи в полной среде, т.е. X-VIVOTM 15 (Lonza Group Ltd., Базель, Швейцария) =1:1. После центрифугирования в градиенте плотности PBMC суспендировали в среде в течение 4 часов. Человеческие DC из прикрепившихся клеток культивировали при 37 ° C в среде, содержащей человеческий GM-CSF (100 нг / мл; R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США) и человеческий IL-4 (10 нг / мл; PeproTech, Rocky Hill, США). Нью-Джерси, США). Половину среды меняли на 2 и 4 дни. Незрелые человеческие DC собирали на 5 день. Цитомегаловирусные вирус Эпштейна-Барра и вирус гриппа (CEF) -специфические Т-клетки получали из суспендированных клеток, которые культивировали в среде CMX, содержащей MHC. -I-рестриктированный пептид CEF (20 нг / мл, Panatecs, Heilbronn, Германия, PA-CEF-002) в течение примерно 48 часов. CEF-специфические Т-клетки увеличивали с помощью 1000 Ед / мл человеческого IL-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA, 200–02) в среде CMX в течение 12 дней. Для IL-2 среду заменяли свежей средой каждые 3 дня.

Характеристика

Морфологию и размер SPIO определяли с помощью просвечивающего электронного микроскопа (TEM, Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA). Картина дифракции рентгеновских лучей (XRD) использовалась для идентификации спектров катализатора. Анализ дзета-потенциала также измеряли для определения поверхностных зарядов наночастиц, покрытых различными полимерами. SPIO / A ⁺ и SPIO / D ^- наночастицы получали со значениями pH в диапазоне от 3 до 8. Измерения дзета-потенциала проводили с помощью анализатора потенциала Zetasizer Nano ZS90 (Malvern, UK). Магнитные свойства наночастиц анализировали при 37 ° C с помощью магнитометра с вибрирующим образцом (Lakeshore 7407).

Анализ CPRG

Б ₃ Z Т-клеточная линия (CD8 ⁺ Т-клеточная гибридома) может экспрессировать ген LacZ, когда его Т-клеточный рецептор взаимодействует с эпитопом овальбумина (OVA) 258–265 в присутствии молекулы H-2Kb MHC-I. DC (2 × 10 ⁴ ) и OVA (100 мкг / мл, Sigma-Aldrich) культивировали с SPIO, SPIO / A ⁺ , или SPIO / D ^- при 37 ° С. Шесть часов спустя DC были культивированы совместно с B ₃ Z (2 × 10 ⁵ ) с ночевкой. Анализ хлорфенолового красного-β-галактозидазы (CPRG, Sigma-Aldrich, США) был проведен для определения продукции β-галактозидазы B ₃ Z ячеек. В этом анализе оптическая плотность (OD) при 595 нм указывает на способность DC к перекрестной презентации антигена.

Анализ апоптоза клеток

Сортировка клеток с активацией флуоресценции (FCS) была использована для изучения эффектов различных концентраций SPIO на жизнеспособность DC. Вкратце, незрелые DC инкубировали с SPIO, меченным аннексином V и PI (Biouniquer, CHN), а экспрессию аннексина V и PI в DC исследовали с помощью FCS.

Визуализация интенсивности флуоресценции in vivo

Чтобы исследовать миграцию DC in vivo, TNF-α (60 нг / мышь) предварительно вводили в подушечки лап обеих задних конечностей ( n =8). Через 24 часа EGFP-DC, меченные SPIO (2 × 10 ⁶ ) в 40 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) вводили в подушечки левой ноги мышей C57BL / 6, и такое же количество немеченых EGFP-DC вводили в правую сторону. Чтобы изучить уровень миграции EGFP-DC в лимфатические узлы, использовали систему визуализации Maestro (CRi, Woburn, MA, США). Рассеченные лимфатические узлы наблюдали с использованием фильтров возбуждения 484 нм и фильтров эмиссии 507 нм. Затем флуоресцентные изображения, демонстрирующие зеленую флуоресценцию, анализировали с помощью программного обеспечения Living Image (версия 2,50; Caliper Corporation, Ньютон, Массачусетс, США). Анализы с конфокальной микроскопией использовали для определения иммуногистохимии. Замороженные лимфатические узлы разрезали на срезы толщиной 5 мкм, затем фиксировали, и срезы инкубировали с антителом к ​​зеленому флуоресцентному белку (GFP) (Invitrogen), с козьим антителом Alexa Fluor 488 нм (Invitrogen), используемым в качестве вторичного антитела. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (Fluoview, Fv10i; Olympus) использовался для наблюдения за образцами.

Анализ кросс-презентации антигена DC человека in vitro

Культивированные DC человека (2 × 10 ⁴ ) высевали в 96-луночный круглодонный планшет, на который SPIO / A ⁺ и SPIO / D ^- Добавляли наночастицы (100 мкг / мл) в сочетании с белком pp65 цитомегаловируса (CMV) (1 мкг / мл, MACS), и белок pp65 CMV и пептид CEF (1 мкг / мл, пептиды Think) использовали отдельно в качестве контроля. Через 6 часов CEF-специфические Т-клетки (2 × 10 ⁵ ) добавляли к человеческим ДК на 12 часов. Брефельдин А (10 мкг / мл, Sigma-Aldrich, США) выдерживали в среде еще 6 ч. После стимуляции и активации CEF-специфические Т-клетки собирали и окрашивали человеческими антителами против CD3, CD4, CD8 и IFN-γ (Invitrogen, США). После окрашивания образцы анализировали с помощью специального проточного цитометра LSR II (BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). Собранные данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, США).

Иммуноферментный анализ

Готовый набор SET-Go для анализа мышиного IL-1β (ELISA) (eBioscience, США) и набор ELISA для человеческого IL-1β (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) использовали для определения секреции IL. -1β от DC. Планшет для ELISA (Costar, США), покрытый 100 мкл / лунку IFN-γ, использовали для захвата антител в течение ночи при 4 ° C и блокировали буфером для ELISA. Затем в лунки добавляли образцы и стандарты и инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C. Обнаружен биотинилированный IFN-γ. Образцы измеряли с помощью микропланшет-ридера с настройкой OD 450 нм (BioTek, США).

Статистический анализ

Данные были проанализированы с использованием статистического пакета для социальных наук (SPSS 13.0, Чикаго, Иллинойс, США). Результаты были представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение, а различия между контрольной и тестовой группами оценивались с помощью одностороннего дисперсионного анализа, двустороннего критерия Стьюдента t тесты, а также двухфакторный дисперсионный анализ. Различия при * P <0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Характеристика SPIO

Морфологию и размер синтезированного SPIO наблюдали с помощью ПЭМ. Изображение ПЭМ показало, что SPIO имел средний размер 8,7 нм и сферическую форму (рис. 1а). Анализ XRD показал шесть пиков, которые явно соответствовали стандартному γ-Fe ₂ О ₃ отражений (рис. 1б). Результаты вибрационного магнитометра показали, что полученный SPIO обладал суперпарамагнитным поведением с намагниченностью насыщения на 60,4 ЭМЕ / г лучше, чем у Fe ₃ О ₄ (Рис. 1в). График DLS показал, что распределение SPIO по размерам в растворе составляет 22 нм (рис. 1d). Чтобы подтвердить, что DC содержат SPIO, было проведено окрашивание берлинской лазурью, чтобы убедиться, что DC содержат железо (рис. 1e).

Характеристика SPIO. а ТЕМ изображение полученного SPIO. б Картина рентгеновской дифракции наночастиц катализатора, показывающая, что материал представляет собой γ-Fe ₂ О ₃ . c Кривые намагничивания полученных SPIO и Fe ₃ О ₄ наночастицы. г Гидродинамический диаметр СПИО. е Морфология ДК, меченных 50 мкг / мл SPIO, после 12 ч инкубации:немеченые ДК и ДК, меченные красителем берлинской синей

Перекрестная презентация контроллеров домена, активированная SPIO

Для дальнейшего изучения влияния SPIO-меченных ДК на активацию Т-клеток в мышиной системе уровень B ₃ Активацию Z T-клеток определяли путем исследования продукции β-галактозидазы с помощью анализа CPRG. В этом исследовании были приняты фиксированная концентрация 100 мкг / мл OVA и пять соотношений доз SPIO (1, 5, 10, 25 и 50 мкг / мл через 6 часов). По мере увеличения концентрации SPIO степень активации B ₃ Z-клетки постепенно увеличивались и достигли стабильности при 25 мкг / мл (рис. 2а). Чтобы исследовать, влияет ли жизнеспособность DC, меченных SPIO в различных концентрациях, DC и SPIO-меченые DC анализировали с помощью FCS после окрашивания аннексином V и PI. Результаты показали, что общий процент DC аннексина V / PI при концентрациях SPIO 10, 25 и 50 мкг / мл существенно не различается, в то время как процент апоптотических клеток увеличивается после нагрузки 100 мкг / мл SPIO (рис. 2b). ). Поверхностные костимулирующие молекулы DC, меченные SPIO в различных концентрациях, наблюдались с помощью FCS. Экспрессия CD80 и CD86 заметно увеличивалась при 25 мкг / мл по сравнению с экспрессией без метки SPIO (фиг. 2c). ДК, меченные 25 мкг / мл SPIO, не демонстрировали изменений в апоптозе клеток в разные моменты времени (рис. 2d). В следующих экспериментах мы использовали 25 мкг / мл.

Влияние перекрестной презентации DC и биосовместимости после маркировки SPIO. а Перекрестная презентация ДК повышается при различных концентрациях SPIO. б Апоптотические ДК и SPIO-меченные ДК исследовали с помощью FCS при различных концентрациях (10, 25, 50 и 100 мкг / мл). c Фенотипы ДК, включая CD11c ⁺ CD80 ⁺ и CD11c ⁺ CD86 ⁺ после мечения SPIO (10, 25, 50 мкг / мл). ДК, стимулированные LPS (1 мкг / мл), использовали в качестве положительного контроля. г Апоптотические ДК, нагруженные 25 мкг / мл SPIO, исследованные с помощью FCS в разные моменты времени (6, 12, 18 и 24 ч)

Маркировка EGFP-DC с помощью расширенных сигналов EGFP SPIO во вторичных лимфатических узлах

EGFP-DC были успешно получены от EGFP-трансгенных мышей in vitro, и изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии показали, что почти все EGFP-DC проявляли зеленую флуоресценцию (рис. 3a). Чтобы исследовать, может ли SPIO влиять на зеленую флуоресценцию EGFP-DC, была проведена FCS. Результаты показали, что экспрессия флуоресценции EGFP не ослаблялась после мечения SPIO (рис. 3b, c). Затем 25 мкг / мл SPIO-меченых EGFP-DC вводили в подушечки правой задней лапы мышей C57BL / 6, а немеченые EGFP-DC вводили в противоположную сторону. Сигналы EGFP измерялись в подколенных лимфатических узлах (PLN) и паховых лимфатических узлах (ILN), которые являются сигнальными лимфатическими узлами и вторичными лимфатическими узлами, соответственно. Результаты показали, что миграция SPIO-меченых EGFP-DC и немеченых EGFP-DC в сторожевых лимфатических узлах достигла пика на 7 день. Существенных различий в сигнале EGFP между двумя группами не наблюдалось, тогда как было обнаружено значительное снижение. в группе PLN на 14 день. Сигналы EGFP, обнаруженные в группе ILN, соответствовали сигналам группы SPIO-меченых EGFP-DC на 4-й и 7-й день, что указывает на миграцию SPIO-меченных DC во вторичную лимфу. узлы (Рис. 3d – f).

Миграция и расположение EGFP-DC после маркировки с помощью SPIO. а Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия EGFP-DC, меченных наночастицами SPIO 25 мкг / мл, после 12 ч инкубации. б , c Интенсивность флуоресценции SPIO-меченных EGFP-DC через 12 часов. Оптическая визуализация in vitro дренажных лимфатических узлов после обратного переливания SPIO-меченных EGFP-DC в разные дни. TNF-α сначала вводили в подушечку лапки мыши заранее, чтобы способствовать миграции EGFP-DC. г - е Оптическая визуализация in vitro и анализ интенсивности сигнала лимфатических узлов в разные дни после инъекции EGFP-DC с или без SPIO. е EGFP-положительные клетки дренирующих лимфатических узлов были обнаружены с помощью лазерной конфокальной микроскопии

Кросс-презентация мышиных контроллеров домена с измененным зарядом измененных SPIO

SPIO были покрыты APTS или DMSA. Чтобы проверить поверхностный заряд SPIO, мы измерили характеристику дзета-потенциала. Дзета-потенциалы SPIO / A ⁺ и SPIO были положительными, тогда как дзета-потенциал SPIO / D ^- показал отрицательный заряд в растворе при значении pH 7 (рис. 4а). Ультраструктура меченных SPIO ДК, покрытых полимерами с различным зарядом, наблюдалась с помощью ПЭМ. ДК, обработанные SPIO, казались электронно-плотными по сравнению с необработанными клетками, и многочисленные SPIO были сгруппированы вместе в цитоплазме. SPIO / A ⁺ были поглощены эндосомами в цитоплазме, тогда как большее количество SPIO / D ^- были обнаружены в цитоплазме ДК, и почти все эти наночастицы были окружены многослойными мембранными структурами, напоминающими лизосомы (рис. 4b). Мы исследовали, может ли противоположно заряженный SPIO запускать разные уровни IL-1β. Согласно нашим результатам, DC, загруженные SPIO / A ⁺ и SPIO / D ^- индуцировал дозозависимую секрецию IL-1β. Независимо от концентрации, мы обнаружили, что SPIO / D ^- индуцировал значительно более высокие уровни IL-1β, чем SPIO / A ⁺ (Рис. 4c). Из-за очевидной корреляции между IL-1β и путем TLR3, для дальнейшего изучения влияния IL-1β на активацию Т-клеток, DC были получены от мышей с нокаутом TLR3 и совместно культивированы с SPIO / A ⁺ , SPIO / D ^- , и OVA. Контроллеры домена, загруженные с SPIO / A ⁺ + OVA может эффективно активировать B ₃ Z T-клетки, что означает, что молекула TLR3 в DC была определенно необходима для перекрестной презентации (рис. 4d).

SPIO, покрытый разными зарядами, влиял на перекрестную презентацию DC и секрецию IL-1β. а PH-зависимый дзета-потенциал SPIO, покрытого различными заряженными молекулами. б Расположение наночастиц с разным зарядом в ДК под ПЭМ. c IL-1β, индуцированный SPIO, покрытым разно заряженными молекулами. г Кросс-презентация SPIO / A ⁺ + OVA и SPIO / D ^- + OVA от контроллеров домена через путь TLR3

SPIO, модифицированный с помощью противоположно заряженных покрытий, способствовал кросс-презентации антигена DC человека и был затронут IL-1β

Чтобы изучить взаимосвязь между IL-1β и перекрестной презентацией, мы выбрали ингибитор каспазы-1 YVAD и обнаружили, что он может значительно ингибировать секрецию IL-1β человеческими DC после предварительной обработки 50 мкМ липополисахарида (LPS) в течение 3 часов (рис. . 5а). Кроме того, мы обнаружили, что YVAD может ингибировать секрецию IL-1β из человеческих DC, вызванную SPIO / A ⁺ и SPIO / D ^- (Рис. 5б). Затем мы исследовали, можно ли использовать человеческие DC в качестве эффективных APC и перекрестно представлять CMV pp65 с CEF-специфическими Т-клетками. Чтобы измерить перекрестную презентацию антигена, было введено внутриклеточное окрашивание (ICS), чтобы определить процент антиген-специфичного CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ и CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ Т-клетки от FCS. Контроллеры домена загружены с SPIO / A ⁺ в сочетании с белком pp65 CMV индуцировал больше CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ и CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ Т-клетки, чем DC, загруженные SPIO / D ^- . Наши данные показали, что ингибитор каспазы-1 YVAD значительно увеличивал Т-клеточные ответы, индуцированные SPIO / D ^- + Белок pp65 CMV, тогда как он частично ингибировал ответы Т-клеток, индуцированные SPIO / A ⁺ + Белок pp65 CMV (рис. 5в, г). Эти результаты показали, что для эффективной перекрестной презентации необходим средний уровень активации IL-1β и что высокий уровень активации IL-1β подавляет перекрестную презентацию в DC.

SPIO, покрытый противоположными зарядами, влияет на функцию DC человека через путь IL-1β. а После предварительной обработки LPS в течение 3 часов человеческие DC инкубировали с возрастающими концентрациями YVAD (1, 10, 25 и 50 мкМ), а затем супернатанты собирали для ELISA на IL-1β. б YVAD может ингибировать секрецию IL-1β из человеческих DC через SPIO / D ^- . SPIO / A ⁺ , и SPIO / D ^- влияют на кросс-презентацию DC под влиянием IL-1β. c CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ и d CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ Т-клетки анализировали путем внутриклеточного окрашивания с использованием FCS

Обсуждение

Иммунотерапия была в центре внимания клинических и экспериментальных исследований с момента развития биотехнологии. Однако предыдущие клинические испытания традиционных вакцин DC, разработанных для индукции иммунитета, не вызвали достаточных иммунных ответов [26]. Наночастицы представляют собой тип адъюванта и могут способствовать функции DC по активации Т-клеток [27]. Наиболее характерными особенностями нашего SPIO являются их биосовместимость и применение маркировки DC в качестве иммунного адъюванта. Изображения ПЭМ показывают, что наши SPIO имеют средний размер 8,7 нм в сухом состоянии и сферическую форму (рис. 1а). Окрашивание берлинской лазурью продемонстрировало, что SPIO подвержены фагоцитации DC (рис. 1e), что указывает на эффективность приема внутрь.

Сообщается, что SPIO имеет широкое биомедицинское применение, например, для маркировки клеток, доставки лекарств, МРТ и магнитной гипертермии [28], которые требуют биосовместимости. Следовательно, необходимо исследовать, влияют ли DC, меченные SPIO, на апоптоз DC. Наши данные предполагают, что не было значительной разницы в апоптозе DC, когда DC были помечены SPIO менее 50 мкг / мл (рис. 2b). В следующем исследовании мы выбрали белок OVA в качестве модельного белка и B ₃ Z T-клетки как эффективные T-клетки для наблюдения за тем, может ли SPIO влиять на перекрестную презентацию DC. Наши результаты показывают, что меченные SPIO DC могут заметно облегчить перекрестную презентацию OVA и активацию B ₃ Z Т-клетки. Поверхностные молекулы CD80 и CD86, которые являются маркерами зрелых ДК, являются двумя критическими костимулирующими факторами, необходимыми для активации Т-клеток. При 25 мкг / мл активированный B ₃ Z T-клетки увеличивались с дозой наночастиц и в конечном итоге стабилизировались (рис. 2a). Более того, экспрессия CD80 и CD86 на поверхности ДК достигла максимума (рис. 2в). Поэтому мы приняли концентрацию 25 мкг / мл и обнаружили, что апоптоз ДК не зависит от времени (рис. 2d), что доказало превосходные наноадъювантные функции и биосовместимость SPIO.

Чтобы изучить влияние SPIO на миграцию DC, мы использовали EGFP-DC, которые показали зеленую флуоресценцию под конфокальной флуоресцентной микроскопией, для сокультивирования с 25 мкг / мл SPIO в течение 12 часов. Мы наблюдали, что экспрессия флуоресценции EGFP не ослабевала после мечения SPIO. В конечном итоге миграция DC во вторичные лимфоидные органы является ключевым параметром для оценки эффективности вакцин на основе DC. В нашем предыдущем исследовании в течение первых 24 часов SPIO-меченные ДК не были обнаружены в значительном количестве во вторичных лимфатических узлах [29]. Чтобы дополнительно определить, изменяется ли это явление со временем, как меченые, так и немеченые EGFP-DC собирали и вводили в подушечки лап мышей, чтобы оценить потенциал SPIO в миграции DC. Наши результаты показали, что зеленая флуоресценция появляется в ILN на 4 и 7 дни (Fig. 3d-f), таким образом демонстрируя, что SPIO может способствовать миграции EGFP-DCs во вторичные лимфатические узлы. Это свойство можно применять для ограничения метастазирования опухолей и активации большего количества клеток CTL в большем количестве лимфатических узлов.

В нашем исследовании мы изучили адъювантные свойства противоположно заряженных SPIO и возможный механизм, лежащий в основе изменений функции DC. Было показано, что поверхностный заряд наночастиц оксида железа влияет на эффективность поглощения клетками [30, 31]. В нашем предыдущем исследовании мы сообщили, что катионный SPIO может усиливать перекрестную презентацию антигена и, соответственно, активацию Т-клеток, в то время как анионный SPIO связан с аутофагией. [16] Некоторые наночастицы металлов могут вызывать воспалительные реакции [32, 33]. Сообщалось, что наночастицы оксида железа активируют NLRP3, разрывают мембраны лизосом, высвобождают катепсин B и индуцируют секрецию IL-1β [34]. Таким образом, мы предположили, что противоположно заряженные наночастицы SPIO могут выполнять разные функции в стимулировании продукции IL-1β как в мышиных, так и в человеческих DC. На рис. 4а наш анализ дзета-потенциала показал, что SPIO, покрытый APTS, несет положительные заряды, тогда как SPIO, покрытый DMSA, несет отрицательные заряды. Под ПЭМ мы обнаружили, что по-разному заряженные SPIO были собраны в разных положениях в цитоплазме (рис. 4b). Чтобы исследовать разницу между перекрестным представлением SPIO / A ⁺ и SPIO / D ^- , мы исследовали секрецию IL-1β в мышиных ДК, индуцированную наночастицами с разным зарядом. Мы оценили ответы мышиных ДК после обработки SPIO / A ⁺ и SPIO / D ^- . Воздействие SPIO / D ^- индуцировал явную активацию секреции IL-1β по сравнению с воздействием SPIO / A ⁺ (Рис. 4c). Этот феномен частично показал, что перекрестная презентация антигена, индуцированная SPIO / D ^- не так эффективен, как вызванный SPIO / A ⁺ . В дополнение к анализу CPRG увеличения B ₃ Активация Z-T-клеток после совместного культивирования мышиных ДК с SPIO / A ⁺ + OVA продемонстрировал, что положительно заряженные наночастицы могут работать лучше при использовании в качестве иммунных адъювантов. Toll-подобные рецепторы (TLR) важны для запуска иммунных ответов, таких как TLR3, и они могут в конечном итоге привести к продукции инфламмасом, активации белка каспазы-1 и секреции цитокина IL-1β [35]. Чтобы продемонстрировать, связан ли TLR3 с перекрестной презентацией антигена под влиянием нашего наноадъюванта, в нашем исследовании были использованы нокаутные по TLR3 DC. TLR3 ^{- / -} Контроллеры домена загружены с SPIO / A ⁺ + OVA и SPIO + OVA эффективно стимулировали B ₃ Активация Z T-клеток (рис. 4d), что указывает на то, что молекула TLR3 в DCs необходима для перекрестной презентации. В совокупности эти результаты показали, что полимеры с различным зарядом на поверхности наночастиц следует учитывать при исследовании их синергетического воздействия на активированные иммунные ответы.

Наши данные показывают, что противоположно заряженные наночастицы могут индуцировать выработку IL-1β, тогда как SPIO / D ^- может гиперактивировать секрецию IL-1β. Однако по сравнению с SPIO / A ⁺ , SPIO / D ^- индуцировал более низкий уровень B ₃ Z Активация Т-клеток. Таким образом, мы предполагаем, что аберрантная продукция IL-1β может способствовать клеточной дисфункции в DC. В большинстве исследований адъювантов из наноматериалов используются ДК от мышей, тогда как в немногих исследованиях используются ДК от людей [36, 37]. Чтобы дополнительно проверить нашу гипотезу, мы использовали YVAD, который, как было доказано, является эффективным ингибитором каспазы-1 (рис. 5a, b), для подавления секреции IL-1β из человеческих DCs. Белок pp65 CMV был выбран в качестве модельного антигена, а CEF-специфические Т-клетки, размноженные in vitro, использовали в качестве отвечающих клеток. Белок pp65 CMV является иммунологически доминантным белком, который легко активирует CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетки для производства цитокинов, особенно IFN-γ [38]. Пептид CEF использовали в качестве положительного контроля для проверки того, что добавление YVAD не повлияет на активацию Т-клеток, поскольку он может быть представлен непосредственно Т-клеткам. Интересно, что при использовании YVAD ответы Т-клеток в SPIO / A ⁺ группа была немного сдержана, а ответы в SPIO / D ^- группа увеличилась (рис. 5в, г). Влияние IL-1β на перекрестную презентацию DC предоставило убедительные доказательства того, что низкий уровень IL-1β, индуцированный SPIO / A ⁺ необходим для перекрестной презентации антигена, а высокий уровень IL-1β в цитозоле будет ингибировать функцию DC.

Выводы

Как показано в графической аннотации на рис. 6, SPIO может способствовать созреванию, миграции и перекрестному представлению контроллеров домена. Умеренная активность IL-1β частично связана с перекрестной презентацией антигенов DC. Кроме того, отрицательно заряженные наночастицы могут активировать избыточный IL-1β и впоследствии ингибировать функции DC. Таким образом, наши результаты показывают, что SPIO проявляет множество биологических свойств и имеет многообещающий адъювантный потенциал. Эти результаты помогут определить оптимальный выбор наноадъювантов для разработки вакцин постоянного тока в будущем.

Графическая аннотация SPIO как наноадъюванта для ДК. SPIO усиливает функцию контроллеров домена, способствуя загрузке контроллеров домена; таким образом, меченные SPIO DC могут мигрировать в ILN, активные в иммунном органе, и могут предложить новый подход в иммунотерапии рака. Анионно-заряженные SPIO активируют защитные ответы IL-1β, запуская каспазу-1 в DC, тем самым нарушая презентацию антигена активным Т-клеткам

Сокращения

APC:

Антигенпрезентирующие клетки

APTS:

3-аминопропилтриметоксисилан

ATP:

Аденозинтрифосфат

CPRG:

Хлорфенол красный-β-d-галактопиранозид

CTL:

Цитотоксические Т-клетки

DAMP:

Молекулярные структуры, связанные с повреждениями

DC:

Дендритная клетка

DMSA:

Мезо-2,3-димеркаптоянтарная кислота

EGFP:

Усиленный зеленый флуоресцентный белок

IL-1β:

Интерлейкин-1β

MHC-I:

Главный комплекс гистосовместимости I класса

NLRP3:

Белок 3, содержащий домены NACHT, LRR и PYD

OVA:

Овальбумин

PAMP:

Молекулярные структуры, связанные с патогенами

SPIO:

Суперпарамагнитные наночастицы оксида железа

SPIO / A ⁺ :

SPIO с покрытием APTS

SPIO / D ^- :

SPIO с покрытием DMSA

TLR:

Толл-подобные рецепторы