Оболочки диатомовых водорослей из кремнезема, адаптированные с использованием наночастиц Au, позволяют проводить чувствительный анализ молекул для биологических, безопасных и экологических приложений

Фон

Диатомовые водоросли - одноклеточные водоросли, массово присутствующие на Земле, более 100 000 видов распространены в водных (океаны, озера, реки) и полуводных (водно-болотные угодья и почвы) нишах. Они составляют примерно 40–50% от общего содержания органических материалов в океанах и ~ 20% превращения углекислого газа в органические соединения (т.е. фотосинтез) в биосфере [1,2,3].

Диатомовые водоросли защищены функциональной оболочкой из диоксида кремния (панцирями) со сложной архитектурой микрометрового размера и размером пор, различающимся у разных видов. Из-за своей микроструктуры раковины диатомовых водорослей показывают значения удельной прочности до ~ 1700 кН м / кг, что намного выше, чем у других натуральных ячеистых, композитных и шелковых материалов, включая шелк пауков (1000 кН м / кг) [4,5, 6,7]. Более того, из-за регулярности и симметрии решетки пор, выровненных на поверхности панциря, часто рамки диатомовых водорослей демонстрируют естественные оптические свойства и обнаруживают эффекты конвергенции, концентрации и захвата света в зависимости от геометрии и топологии пор, длины волны и клапана. ориентация [8,9,10,11,12].

Таким образом, диатомовые водоросли являются естественными (в отличие от искусственных), многочисленными, дешевыми и легкодоступными трехмерными микро- или наноразмерными структурами, которые не требуют традиционных методов нанопроизводства для их производства и, с учетом их масштаба, морфологии, и их свойства, демонстрируют возможность использования в качестве миниатюрных сенсоров, капсул для доставки лекарств и других микроустройств [2, 13, 14]. Тем не менее, несмотря на это обещание, диатомей в нанотехнологиях относительно мало применений [15,16,17], возможно потому, что, хотя оболочки диатомей представляют собой необходимую опору для многих структур, необходимы дальнейшие функционализации (модификации) для обеспечения этих структур правильные функции.

В этом письме , мы демонстрируем метод функционализации панцирей кремнеземных диатомовых водорослей наночастицами Au. Это приводит к появлению устройств с несколькими шкалами в иерархической структуре. Каждая оболочка представляет собой цилиндр из диоксида кремния со средним диаметром d . ~ 8 мкм и высотой h ~ 10 мкм (рис. 1а и дополнительный файл 1). Поверхности скорлупы включают плотные структуры пор, которые имеют приблизительно круглую форму, и их размер варьируется в узком интервале p _s =200 ± 40 нм (рис. 1б, в). Наночастицы золота затем равномерно распределяются по внешней поверхности оболочек со средним диаметром частиц Au - НП _s ~ 20 нм и небольшие отклонения от среднего (рис. 1б, в). Поскольку раковины диатомовых водорослей здесь получены из диатомовой земли, то есть недорогого, теоретически неограниченного источника панциря (дополнительный файл 2), этот метод позволяет получать большие объемы наноустройств за короткое время (рис. 1d, e).

Представление художника о панцирях диатомовых водорослей из диоксида кремния, которые выглядят как микрометровые цилиндры со средним диаметром d . ~ 8 мкм и высотой более h > 10 мкм массивы пор украшают внешнюю поверхность диатомовых водорослей ( a ). СЭМ-микрофотографии оболочек кремнезема, функционализированных наночастицами золота (системы D24), полученные при низких ( b ) и высокий ( c ) коэффициенты увеличения. По ним можно наблюдать регулярный узор пор, пронизывающих поверхность диатомей, украшенную хаотично расположенными наночастицами золота, с размером пор ~ 200 нм и размером частиц ~ 20 нм. SEM большого поля ( d ) и оптический ( e ) изображения систем D24 оценивают возможность процесса функционализации для производства больших объемов микроустройств. Исследование систем D24 с помощью флуоресцентной микроскопии после инкубации с флуоресцентными желтыми микросферами 50 нм выявляет селективность, специфичность и чувствительность устройств ( f )

Устройство объединяет разные весы. (i) Субмиллиметровые размеры оболочек позволяют манипулировать системой, обращаться с ней и получать доступ. (ii) Микрометрический размер пор позволяет собирать молекулы, выбирать и (в более сложных вариантах развития устройства) фрагментировать. (iii) нанометровый размер Au – NP позволяет контролировать и усиливать внешнее электромагнитное (ЭМ) излучение. Таким образом, иерархическая многомасштабная архитектура позволяет извлекать из раствора специфические аналитические молекулярные мишени и характеризовать их с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с усилением поверхности (SERS) даже в очень низких диапазонах содержания. Инкубация с флуоресцентными микросферами 50 нм (желто-зеленые микросферы Fluoresbrite® - дополнительный файл 3) и последующий флуоресцентный анализ указывают на локализацию устройства, селективность, специфичность и отсутствие фонового сигнала (шума) (рис. 1f).

Результаты

Функционализация с помощью Au – NP

Кизельгур (DE) очищали раствором пираньи для удаления органических остатков. Затем образцы выдерживали в течение 120 с в разбавленном 2% растворе фтористоводородной кислоты (HF) для удаления мелких фрагментов, придания шероховатости поверхности диатомовых водорослей и стимулирования зародышеобразования Au. Затем образцы декорировали Au – NP с использованием процесса фотоосаждения. Раковины суспендировали в деионизированной воде с 0,1% раствором золотохлористоводородной кислоты (HAuCl ₄ ) в изопропиловом спирте и освещали лампой UVA / UVB Osram Ultra Vitalux. Время облучения, концентрация панцирей диатомовых водорослей в растворе и количество хлористоводородной кислоты варьировались в течение значительных интервалов для получения наночастиц различной морфологии. Для данной конфигурации мы использовали 20 мг оболочек в 50 мл растворителя и своевременные инъекции 30 мкл хлористоводородной кислоты каждые 5 мин в течение 1 часа. Обратите внимание, что метод не предполагает электрохимического восстановления ионов золота до металлического золота, как при химическом осаждении [18, 19]. В дальнейшем мы будем обозначать функционализированные Au – NPs раковины диатомей аббревиатурой D24. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) была использована для характеристики систем D24. Спектры XPS высокого разрешения были получены с использованием мощности P =100 Вт, энергия луча e =11,7 кэВ, разрешение δe =0,1 эВ, время накопления t =20 мин минимум. Пики в спектрах относятся к пику углерода C1s при энергии связи 284,8 эв. На рис. 2 мы приводим XPS-спектры систем до и после функционализации. Мы наблюдаем, что после функционализации системы D24 демонстрируют появление металлического золота (основная полоса Au4f5 при энергии связи 84 эв) и следы валентных зон, связанных с Au4d3 (353 эВ), Au4d5 (334 эВ), Au5d3 (6 эВ). ). Мы также наблюдаем следы натрия (Na1s, 1071 эВ и пики Оже при 497 эВ) и кремния (Si2s, 2p при 150 и 97 эВ), которые приписываются загрязнениям в подложке, используемой для осаждения капель наночастиц. Присутствие углерода (C1s) в спектрах случайно, не связано с процессом изготовления, и является результатом спонтанной адсорбции нормального уровня углерода, содержащегося в атмосфере, на поверхность диатомовых водорослей. Представленный метод синтеза наночастиц позволяет формировать наночастицы на внешней поверхности диатомовых водорослей и внутри пор. Изображения с дополнительной сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), представленные в дополнительном файле 1, демонстрируют отложение наночастиц Au глубоко внутри поровой матрицы диатомовых водорослей. Таким образом, в то время как поры в пористой матрице позволяют связывать, иммобилизовать и удерживать аналиты, массив наночастиц золота обеспечивает эффект SERS и обнаружение аналитов в очень низких диапазонах содержания. Эти эффекты тесно взаимосвязаны.

XPS-спектры оболочки диатомовых водорослей из диоксида кремния до (нижняя диаграмма) и после (верхняя диаграмма) функционализации наночастицами золота

Моделирование электромагнитного поля вокруг D24 / Au – NP

Мы использовали компьютерное моделирование и анализ конечных элементов (FEA) для оценки электромагнитного поля вокруг массивов наночастиц золота в системе D24 (методы и дополнительный файл 4). Поскольку образцы отверстий в диатоме демонстрируют гексагональную симметрию (рис. 3a), напоминающую фотонный кристалл, мы использовали численную схему, чтобы оценить, может ли аналогичная геометрия, украшенная равномерным распределением наночастиц Au, локально усилить электромагнитный сигнал. Смоделированные картины пор были воспроизведены с реального изображения SEM (рис. 3b). Вокруг каждой поры и между порами помещалось максимум 125 частиц (рис. 3b). Мы аппроксимировали падающее ЭМ поле линейно поляризованной плоской волной TM с центральной длиной волны λ =633 нм, мощность P _inc =1 Вт, и соответствующая удельная мощность I =2,5 × 10 ⁸ Вт / см ² . При моделировании раковина диатомей описывалась диэлектриком с показателем преломления n _D24 =1,3, а окружающая среда и поры считались воздухом с n _воздух =1. Au – NP моделировались с использованием формулировки Rakic ​​и соавторов [20]. Результаты показывают (рис. 3c), что электромагнитное поле, усиленное системой, неравномерно распределено в интересующем объеме, причем электромагнитное поле преимущественно сосредоточено вокруг золотых наночастиц, где оно достигает интенсивности до | E | ~ 3 × 10 ⁸ В / м и соответствующие факторы усиления Q ~ 10 ² если рассматривать ЭМ поле и Q ~ 10 ⁸ если мы рассмотрим эффекты поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (SERS). (В этом случае усиление пропорционально амплитуде местного электрического поля в четыре степени [21]). Поскольку в практических приложениях поверхность диатомовых водорослей может произвольно ориентироваться по отношению к внешнему излучению, анализ поведения | E | представляет определенный интерес. как функция направления θ, которое нормаль к поверхности диатомовых водорослей образует с распространяющейся TM-волной (рис. 3e). В диапазоне θ =0 - 70 ^° интервал, | E | колеблется между ~ 1,5 × 10 ⁸ В / м =| E | _мин при θ =20 ^° и ~ 4 × 10 ⁸ В / м =| E | _макс при θ =50 ^° . Таким образом, на интенсивность электромагнитного поля сильно влияет способ размещения систем D24 на поверхности для последующего анализа и проверки. Однако обратите внимание, что даже в худшей конфигурации вычисленные значения | E | _min достаточно велики, чтобы обеспечить надежный и чувствительный анализ сигнала, связанного с распространением электромагнитного поля.

СЭМ-изображение гексагональной решетки пор на поверхности диатомовых водорослей, воспроизводящее фотонный кристалл ( a ). Размер пор, форма и топология реального прототипа, а также случайные структуры золотых наночастиц, распределенных между порами, были воспроизведены в наборе инструментов численного анализа конечных элементов (FEA) ( b ). Результатом моделирования является усиление электромагнитного поля и электромагнитного поля вокруг агрегатов наночастиц золота с максимальным электромагнитным полем около ~ 3 10 ⁸ В / м ( c ). Распределение ЭМ показывает чувствительность к ориентации поверхности поры по отношению к внешнему падающему излучению ( d ). Изменяя угол падения внешнего излучения и нормали к поверхности поры на значительных интервалах, мы обнаруживаем, что максимальная напряженность электромагнитного поля колеблется в пределах ~ 1,5 10 ⁸ и ~ 4 10 ⁸ В / м ( э )

FEM-анализ, представленный на рис. 3a – c, моделирует электромагнитное поле в упрощенной двумерной плоской геометрии - для этой конфигурации электромагнитное поле развивается вокруг наночастиц Au на внешней поверхности диатомовых водорослей. Тем не менее, в трехмерной схеме на рис. 3d и других изображениях, представленных в дополнительном файле 4, наночастицы золота распределены по внутренней поверхности пор. Эта схема, более похожая на реальный физический прототип, указывает на то, что аналиты, адсорбированные устройствами D24, могут взаимодействовать с электромагнитным полем - и обнаруживаться - для любой взаимной локализации поры / аналита. Таким образом, даже если SERS является короткодействующим эффектом и электромагнитное поле затухает со степенью, равной трем расстоянию от наночастиц золота [22], сбор анализируемого вещества и совместная локализация анализируемого вещества / поры обеспечивают чувствительные возможности устройства. В дополнение к этому, мы демонстрируем локализацию аналита в порах с дополнительными флуоресцентными изображениями с большим увеличением систем D24, загруженных желто-зелеными наносферами 50 нм (дополнительный файл 3). Пространственное перекрытие между сигналом флуоресценции и диатомовыми устройствами D24 и исчезающе малым фоновым сигналом демонстрируют, что поглощение аналита очень эффективно, не оставляя остатков или оставляя их с минимальным количеством остатков.

Анализ SERS BSA в решении

Здесь мы оцениваем способность устройств D24 работать в качестве молекулярных собирающих агентов и сенсорных устройств в биологических системах. Мы инкубировали устройства D24 в растворе, содержащем бычий сывороточный альбумин (БСА) в 10 ⁻¹⁶ Концентрация M, при относительном содержании 1 мг устройств D24 в 1 мл раствора. Сложная сеть отверстий, проникающих в диатомовые водоросли, представляет собой фильтр, который может поглощать молекулы с гидродинамическим диаметром меньше размера поры. Учитывая, что для данной конфигурации средний размер пор составляет около 200 нм, белки BSA с характерным размером длины ~ 6 нм [21] легко будут накапливаться в матрице пор. Через 10 мин после инкубации системы D24 отделяли и экстрагировали из исходного раствора путем седиментации. Устройства D24, содержащие БСА, помещали на предметный столик микро-рамановского микроскопа Renishaw inVia для анализа.

На рис. 4а представлены измеренные спектры комбинационного рассеяния капсулы D24 (i), чистого BSA (ii), BSA + нефункционализированных панцирей диатомей (iii) и систем BSA + D24 (iv). Обратите внимание, что в последней конфигурации системы дают эффекты SERS. В таблице 1 , мы сообщаем о прямом сравнении и предварительном назначении пиков, измеренных в системах с (iii) и без (ii) эффектами SERS. Хотя BSA все еще обнаруживается в простых оболочках диатомовых водорослей, наночастицы Au в системах D24 подчеркивают присутствие ароматических компонентов BSA при 1392 см ⁻¹ а в 1556–1576 см ⁻¹ группа. Пик на 1670 см ⁻¹ указывает на присутствие амида I в образце, что, в свою очередь, предполагает наличие β - соответствие листа видимым с помощью SERS. Соответствующий пик в простом микро Рамановском спектре расположен при 1658 см ⁻¹ . , что по-другому предполагает α -спиральная структура. В то же время соответствующее усиление COO-симметричного растяжения на 1392 см ⁻¹ предполагает сильное электростатическое взаимодействие с поверхностью диатомовых водорослей / золота [23]. Сканирование SERS-матрицы образцов на конечных площадях проводилось на центральной частоте f =1576 см ⁻¹ для оценки ремонтопригодности, надежности и чувствительности измерений (рис. 4б). Растровый график сигнала SERS в двух различных конфигурациях (рис. 4c, d) указывает на способность системы реконструировать пространственное распределение содержания BSA по раковинам в исчезающе низких диапазонах численности. В ранее опубликованных экспериментах [24] мы исследовали локальный нагрев, вызванный ЭМ-усилением и плазмоникой. Хотя мы наблюдали релевантные и селективные по месту приращения температуры, связанные с устройствами нанофотоники на подложке, с абсолютными значениями температур до ~ 400 К, тем не менее мощность лазера, связанная с этими приращениями, должна быть установлена ​​в диапазоне 10 мВт, т. Е. на два порядка выше, чем мощность лазера P =0,18 мВт используется для измерения тока. Следовательно, в этом случае не учитываются эффекты искусственного нагрева и возможные конформационные изменения белков. Конформационные изменения и изменения относительного содержания β - листы в белках активируются внешними температурными полями, начиная с ~ 340 К [25].

Рамановские спектры чистого БСА, БСА, адсорбированного оболочками из диоксида кремния, и БСА, адсорбированного системами D24, в последних двух экспериментах начальная концентрация БСА составляла 10 ⁻¹⁶ ( а ). Оптическая микроскопия систем D24 после инкубации с BSA ( b ); Рамановская карта BSA, полученная по отдельным системам D24 ( c , d )

Анализ минерального масла SERS

Устройства D24 были продемонстрированы при анализе и обнаружении минеральных масел при все более низких факторах разбавления. Минеральное масло - это побочный продукт перегонки нефти для производства бензина. Оно содержит легкие смеси высших алканов с парафинами этого минерального масла в диапазоне от примерно C ₁₈ до C ₄₀ :примерно соответствует составу базового масла для производства смазочных или гидравлических масел [26]. В недавнем комментарии [26] рекомендуется снизить воздействие минерального масла до уровней ниже ~ 50 мг / кг, то есть 50 ppm. Поэтому анализ минеральных масел (m.o.) и связанных с ними продуктов представляет интерес с точки зрения загрязнения окружающей среды и безопасности пищевых продуктов. m.o исследовали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света в соответствии с методами, описанными в предыдущем анализе BSA.

На рис. 5а показаны измеренные спектры комбинационного рассеяния относительно единственной капсулы D24 (i), единственной m.o. (ii) и эмульсии m.o. и деионизированная вода в различных концентрациях (iii). Диоксид кремния является основным компонентом систем D24 (i). В рассматриваемом диапазоне частот 600–3200 см ⁻¹ , мы наблюдаем рамановские пики в полосе 950 см ⁻¹ , связанный с рассеянием кремния второго порядка, и в полосе 2130 см ⁻¹ , связанный с -SiH ₂ растяжение [27]. М.О. . спектр (ii) характеризуется пиком при 1450 см ^-1 , что указывает на CH ₂ вибрация ножниц, а пики в диапазоне 2850–2923 см ⁻¹ области, связанной с растяжением CH [28]. Рамановские спектры относительно D24 после адсорбции m.o. при различных концентрациях от 0,05 до 200 мкл / мл указывают на то, что относительное содержание m.o. в эмульсии кодируется полосами 1450 и 2850–2923 см ⁻¹ . Чем выше содержание м.о. в эмульсии тем выше пик комбинационного рассеяния в этих частотных диапазонах. Примечательно, что анализ D24 чувствителен к m.o. минимальные разведения 0,050 мкл / мл 50 ppm (m. o.:деионизированная вода), то есть пороговое значение, при превышении которого могут возникнуть опасения по поводу безопасности, токсичности или загрязнения. Рамановские карты m.o. при разведении 10 мкл / мл измеряются на поверхности D24 и представлены на вставке к рис. 5b. Карты рассчитываются на центральных частотах f =1450 см ⁻¹ (Рис. 5c) и f =2900 см ⁻¹ (Рис. 5d). Во всех случаях интенсивность комбинационного рассеяния пропорциональна содержанию m.o. в раковине диатомовых водорослей, а m.o. профиль реконструируется с субмикронным разрешением.

Рамановские спектры систем D24, чистого минерального масла и минерального масла, адсорбированного системами D24 во все более низких концентрациях ( a ). Оптическое изображение систем D24 после инкубации с минеральным маслом и седиментации ( b ). Рамановские карты минерального масла, адсорбированного микроустройством D24, полученные на f =1450 см ⁻¹ ( c ) и f =2900 см ⁻¹ ( д )

Обсуждение

Описанная схема позволяет осуществлять захват, локализацию, секвестрацию и обнаружение аналитов. Аналиты, адсорбированные пористыми диатомовыми водорослями D24, можно легко собрать, обработать, разделить и разделить на аликвоты в образцы. Каждый образец состоит из (i) функционализированных диатомовых водорослей, нагруженных (ii) конкретными аналитами. Таким образом, образец представляет собой комбинацию анализируемого вещества и устройства, необходимого для его обнаружения. Различные аликвоты можно обрабатывать, используя простые схемы комбинационного рассеяния, хранить для будущего анализа, возможно, хранить в холодильнике или морозильной камере в течение длительных периодов времени. Таким образом, системы D24 представляют собой гибридное устройство, которое работает в симбиозе с целевыми молекулами, которые нужно анализировать. В то время как традиционные субстраты SERS или металлические наночастицы до сих пор использовались изолированно, а взаимодействие между субстратом SERS и аналитом происходит периодически и часто ограничивается во время измерения, системы D24 объединяют датчик и целевую молекулу в единое целое. индивидуальное многофункциональное, управляемое и портативное устройство. Более того, в отличие от традиционных субстратов SERS, системы D24 достаточно малы, чтобы действовать как индикаторы. Высвобождаемые в контурах микроциркуляции, системы D24 будут транспортироваться через артерии, артериолы и микрососуды живой ткани, взаимодействовать с кровью и отходами клеток, усваивать аналиты, пептиды и биомаркеры и управлять анализом биомолекул с повышенным пространственным и временное разрешение. Аналитические карты биомолекул могут, в свою очередь, быть связаны с индивидуальным риском рака, патологическим риском или физиологическим состоянием пациента, чтобы поддерживать медицинские решения и планировать вмешательства.

Обратите внимание, что идея использования диатомовых водорослей в качестве микрокапсул для восприятия не нова. Тем не менее, ранее опубликованные работы отклоняются от нашего анализа до такой степени, что это зависит от индивидуальных вкладов, как объясняется в следующем разделе.

В ссылке [29] Рен и его коллеги использовали моделирование для изучения усиления электрического поля, создаваемого плазмонными наночастицами, нанесенными на поверхность скелетных панцирей диатомовых водорослей. Затем они подготовили субстраты из SERS, собирая наночастицы серебра на поверхности диатомовых водорослей. В то время как аналогичные устройства обеспечивают превосходные коэффициенты усиления восприятия, диатомеи иммобилизуются на субстрате, и их нельзя свободно вводить в микроциркуляцию, в биологические жидкости или растворы, биологические отсеки, акведуки, каналы, морскую воду, океанские потоки и течения, для биологических или технических целей. приложения.

В ссылке [30] Чен и его коллеги прессовали диатомитовую землю, покрытую наночастицами Au, в твердые таблетки миллиметрового размера, напоминающие пуговицы. Затем они использовали эти планшетные устройства SERS для анализа химического состава эккринного пота в скрытых отпечатках пальцев, что является блестящим и очень практичным применением устройства в медицине. Тем не менее, он специфичен, и анализ по-прежнему выполняется на макроуровне.

В ссылке [31] группа во главе с Лукой Де Стефано функционализировала панцири диатомовых водорослей наночастицами Au с помощью химического осаждения. Затем они протестировали устройство с использованием п-меркаптоанилина (pMA). pMA может образовывать самоорганизующийся монослой на металлических поверхностях и поэтому используется в качестве молекулы поверхностного зонда в SERS. Химическое осаждение - это оцененный метод синтеза наночастиц золота на автокаталитической поверхности, который позволяет достичь высокого контроля над размером и плотностью частиц [18, 19, 32]. В отличие от этого подхода, здесь мы использовали процесс фотоосаждения, который является более прямым, быстрым и не требует обработки образца или требует минимальной обработки по сравнению с осаждением методом химического осаждения. Тем не менее подход, предложенный Де Стефано, является многообещающим и заслуживает дальнейшей проверки в биологических или экологических приложениях.

Выводы

Мы разработали способы модификации экономичной, легкодоступной и обильной диатомовой земли для получения миниатюрных сенсорных устройств, в которых поры раковин диатомовых водорослей имеют способность захватывать молекулы в растворе, а наночастицы золота усиливают сигнал спектроскопии на несколько порядков, чтобы выявить молекулы в недостижимых иным образом диапазонах низкого содержания. Мы продемонстрировали аналогичные устройства D24 при анализе биологических белков BSA в растворе и для обнаружения следов минерального масла в бинарной эмульсии с водой. В обоих случаях мы выявили целевые молекулы в низких разведениях до 10 ⁻¹⁶ . M для BSA и 50 ppm для минерального масла. Устройства могут найти применение в аналитической химии, надзоре и оценке биологического риска, безопасности пищевых продуктов, мониторинге загрязнения и надзоре за морской водой, акведуками и питьевой водой.

Методы

Сканирующая электронная микроскопия образцов

Оболочки кремнезема, функционализированные наночастицами Au (системы D24), диспергировали непосредственно на углеродной липкой ленте для получения изображений с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Образцы получали с помощью Zeiss Auriga Compact FE-SEM, оборудованного детектором вторичных электронов InLens для морфологической визуализации и детектором кольцевого обратного рассеяния для получения изображений с Z-контрастом (чтобы выделить присутствие Au).

Характеристики диатомовой земли, использованные в этом исследовании

Материал диатомовых водорослей, использованный в этом исследовании, представлял собой высококачественную диатомовую землю пищевого качества, предоставленную Perma-Guard (Perma-Guard Europe Sollaris Sp. Z o.o., Отвоцк, Польша) в виде 1 кг бесплатного образца Fossil Shell Flour®. Текущая рыночная цена составляет ~ 16 евро за 1 кг. Он состоит из цилиндрических раковин вымершей пресноводной диатомеи Melosira preicelanica. Его основная фракция - аморфный кремнезем (до 94%), за ним следуют смектиты (~ 3%), каолинит (~ 2%), полевые шпаты (~ 1%), кальцит (> 1%) и кварц (> 1%). . Измельчение в низкооборотной молотковой мельнице было выполнено для гомогенизации частиц по размеру. Основные свойства (включая физические и оптические свойства) Fossil Shell Flour®:средний размер частиц:10 мкм, остаток на сите:2%; показатель преломления:1,43; маслопоглощение:120%; яркость (зеленый фильтр):85; удельный вес:2,2; площадь поверхности:44,2 м ² /г; pH:8,0; общий объем пор:0,132 см ³ /г; микропоры (<20 Å):14%; мезопоры (20–500 Å):65%.

Флуоресцентный анализ систем D24

Системы D24 инкубировали с желто-зелеными микросферами Fluoresbrite® диаметром 50 нм в течение 10 мин при соотношении D24:флуоресцентные частицы =1:10. Затем мы собирали системы D24 из раствора и помещали их на оптический столик. инвертированная система лазерной сканирующей конфокальной микроскопии Leica TCS-SP2®. Все измерения проводились с использованием ArUv-лазера. Точечное отверстие (80 мкм) и мощность лазера (мощность 80%) поддерживались на протяжении каждого эксперимента. Желтая флуоресценция (аналогичная FITC) возбуждалась с использованием λ ₁ =441 нм линия возбуждения и конфокальные изображения были получены в максимуме излучения λ ₂ =485 нм при использовании объективов × 10/20. Изображения были получены в интересующей области размером 975 × 750 мкм ² и были усреднены по четырем строкам и десяти кадрам для улучшения качества и уменьшения шума. Изображения были оцифрованы в 1280 × 960 пикселей.

Анализ образцов с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии

Рентгеновские фотоэлектронные спектры регистрировали с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) Versa Probe II (PHI, Chanassen, США) в режиме анализа большой площади, где монохроматный анодный пучок алюминия 100 мкм, мощность 100 Вт, нормальный к поверхность, растрирована на площади 1400 × 300 мкм ² с анализатором под углом 45 ° по отношению к поверхности образца. Обзорные спектры были получены с временем накопления не менее 20 мин при высокой энергии прохождения (187 кэВ), в то время как спектры с высоким разрешением интересующих элементов были получены при 11,7 кэВ с той же мощностью и разрешением 0,1 эВ. Спектры были проанализированы с помощью программного обеспечения Multipack (PHI, Chanassen USA), и все пики были привязаны к пикам углерода C1s при энергии связи 284,8 эВ.

Моделирование электромагнитного поля в системах D24

Для численного расчета профиля электрического поля по всей декорированной структуре была разработана трехмерная модель метода конечных элементов (МКЭ) с использованием коммерческого программного обеспечения COMSOL Multiphysics 5.3. Моделирование проводилось на одной кубической элементарной ячейке, где 125 частиц были размещены на поверхности диэлектрической поверхности с рисунком. Общий оптический отклик был исследован как функция угла падения электромагнитного поля, которое было аппроксимировано как линейно поляризованная плоская волна TM (дополнительный файл 4). Периодичность системы учитывалась путем применения граничных условий Флоке на боковых сторонах элементарной ячейки, перпендикулярных плоскости падения; впоследствии результаты периодически расширялись для визуализации массива диатомовых водорослей (дополнительный файл 4). Длина волны λ =633.0 нм. Мощность падающего излучения была выбрана произвольно как P . _inc =1 Вт, площадь элементарной ячейки равна 3,9 × 10 ⁻¹³ м ² and the resulting intensity is I  = 2.5 × 10 ⁻⁸ Вт / см ² (notice that intensity dependant non-linearity is here neglected). Regarding the materials, the diatom was optically described as a dielectric with refractive index n _diatom  = 1.3, whereas the surrounding environment is air with n _air  = 1. Gold nanoparticles, modeled as perfect spheres with a diameter d  = 20 nm, were modeled following the dielectric formulation reported in [20]. The geometrical domain has been discretized using tetrahedral elements. Maximum size of the mesh element has been chosen as 1/5 of the effective wavelength value that had to be resolved in each domain, depending on its refractive index. The minimum mesh element was set to r /1.5, r  = 10 nm is the radius of each nano-sphere. Maxwell equations have been numerically solved within the unit cell by placing perfectly matched layers at the top and the bottom of the structure, in order to avoid unphysical reflections at the boundaries of the domain. In addition, the electromagnetic field symmetry has been exploited to reduce the computational effort of the simulation. As a result, equations are solved for a half of a diatom only, and perfect magnetic conductor boundary conditions have been imposed to the lateral sides of the unit cell, parallel to the plane of incidence, coherently with the polarization of the incident field.

Raman Analysis of Samples

D24 devices containing BSA were positioned on the stage of a Renishaw inVia micro-Raman microscope for analysis. Samples were analyzed using × 20/50 objectives of a Leica microscope. Raman spectra were excited by the 633.0 nm line of an HeNe laser in backscattering geometry and acquired with a CCD with 1024 × 1024 pixels. Laser power was adjusted as 0.18 mW and maintained constant throughout the whole measurements. Interferograms were recorded with an integration time of 20 s. Each spectrum was base line corrected with a second degree polynomial function. Raman maps were performed with a step size of 400 and 600 nm in the x и y axes direction.

Сокращения

BSA:

Bovine serum albumin

D24 systems:

Silicon dioxide diatom shells functionalized with gold nanoparticles

DE:

Diatomaceous earth

MO:

Mineral oil

SERS:

Surface-enhanced Raman spectroscopy