Повышенная стабильность магнитных наночастиц золота с помощью сополимера поли (4-стиролсульфоновой кислоты и малеиновой кислоты):оптимизированные оптические свойства для обнаружения белков

Аннотация

Магнитные наночастицы золота (GoldMag) привлекли большое внимание благодаря своим уникальным физическим и химическим характеристикам, сочетающим свойства отдельных Fe ₃ О ₄ и наночастицы Au. Покрытие GoldMag полимерами не только увеличивает стабильность композитных частиц, взвешенных в буфере, но также играет ключевую роль в проведении оптических тестов для клинически значимых биомолекул в месте оказания медицинской помощи. В настоящей статье для покрытия положительно заряженной поверхности GoldMag (30 нм) использовали сополимер поли (4-стиролсульфоновой кислоты и малеиновой кислоты) (PSS-MA), отрицательно заряженный полиэлектролит с сульфонатными и карбоксилатными анионными группами. Покрытый PSS-MA комплекс GoldMag имеет стабильный пик адсорбции плазмонного резонанса при 544 нм. Пара антител против D-димера была связана с поверхностью этой композитной наночастицы GoldMag, и был обнаружен целевой белок, D-димер, в диапазоне 0,3–6 мкг / мл. Сдвиг характеристического пика, вызванный сборкой GoldMag из-за образования сэндвич-мостиков D-димер-антитело, позволил обнаружить.

Фон

Используя преимущество определенного свойства намагничивания, то есть суперпарамагнетизма, магнитные наночастицы широко исследуются для биомедицинских приложений, таких как доставка лекарств / генов, магнитно-резонансная томография и биологические анализы [1,2,3]. Магнитные наночастицы золота (GoldMag), состоящие из Fe ₃ О ₄ / Au не только обладают физико-химическими свойствами наночастиц оксида железа, но также обладают такими характеристиками наночастиц золота, как легкость функционализации поверхности и уникальные оптические свойства. Эти отличительные особенности привлекли большое внимание в области биологии [4, 5], особенно при обнаружении биомолекул на основе оптических свойств. Например, Wang et al. б / у Fe ₃ О ₄ -Au стержни в качестве оптических зондов для множественного обнаружения патогенов [6]. Однако, как и в случае с другими наночастицами, высокая поверхностная энергия заставляет частицы GoldMag сближаться друг с другом, так что они образуют кластеры в буферном растворе. Это сильно ограничивает их применение для оптического обнаружения в биомедицинской области. Поэтому крайне важно предотвратить агрегацию GoldMag и обеспечить стабильный коллоидный раствор. Настройка GoldMag для обнаружения целевых молекул на основе покрытия из полимеров очень полезна. Сообщалось, что дисперсность GoldMag может быть улучшена за счет модификации поверхности различными макромолекулярными органическими соединениями, такими как 11-меркаптоундекановая кислота (MUA) [7], полистиролсульфонат (PSS) [8] и полиэтиленимин (PEI) [9]. MUA был нанесен на поверхность GoldMag с использованием стратегии обмена лиганда. Он повысил стабильность коллоидных растворов GoldMag за счет модификации поверхности с помощью MUA [7]. Эти MUA-GoldMag использовались для обнаружения белков на основе оптических свойств. Однако цепочка MUA была слишком короткой, чтобы обеспечить достаточные стерические препятствия для обеспечения достаточной дисперсности частиц. Более того, низкая плотность карбоксильных групп в MUA ограничивает количество белка, которое может абсорбироваться GoldMag. Эти недостатки ограничивают применение MUA-частиц в оптических приборах и ограничивают чувствительность, необходимую для обнаружения биомаркеров.

Поли (4-стиролсульфоновая кислота-малеиновая кислота) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20000), блок-сополимер, образуется ковалентным связыванием PSS и полималеиновой кислоты и содержит как сульфонат, так и карбоксилатные группы. Электростатическое отталкивание, обеспечиваемое большим количеством карбоксильных групп и сульфонатных групп, а также стерические препятствия, исходящие от длинной полимерной цепи PSS-MA, делают этот полимер очень полезным для поддержания стабильности наночастиц. Фактически, PSS-MA использовался в качестве стабилизатора при получении наночастиц, таких как наноматериалы оксида железа, палладий и биметаллические наноструктуры Ag-Au [10,11,12]. Johnston et al. сообщили, что нанокластеры оксида железа, покрытые сополимером, обеспечивают более высокую степень электростерической стабилизации, чем нанокластеры оксида железа, покрытые полимером из одной макромолекулы [13]. Кроме того, большое количество карбоксильных групп в фрагменте полималеиновой кислоты PSS-MA позволяет проводить химическую модификацию биомолекул для биомедицинских применений.

D-димеры являются стабильными конечными продуктами распада поперечно-сшитого фибрина в результате усиленного образования фибрина и фибринолиза [14]. Определение уровня D-димера в крови широко используется в диагностике тромбоэмболических событий и инфаркта миокарда [15, 16]. Здесь мы использовали D-димер в качестве модели для оценки возможности использования PSS-MA-GoldMag для оптического обнаружения определенных белков. Мы использовали пару антител против D-димера для иммобилизации на PSS-MA-GoldMag, чтобы сформировать зонды для обнаружения D-димера с помощью двойного сэндвич-иммуноанализа.

Таким образом, в настоящем исследовании PSS-MA использовался для модификации поверхности GoldMag. Это не только повысило стабильность магнитных наночастиц, но также опосредует конъюгацию между наночастицами и антителами для обнаружения димеров.

Методы

Материалы и реагенты

GoldMag (5 мг / мл) был предоставлен Xi’an GoldMag Nanobiotech Co., Ltd. (Сиань, КНР). Борная кислота, бура, бромид цетилтриметиламмония (CTAB), сополимер поли (4-стиролсульфоновой кислоты и малеиновой кислоты) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20000) были приобретены у Sigma-Aldrich, США. Пару моноклональных D-димерных антител (антитело 1:M-2.1.16; антитело 2:M-1.2.57) приобретали у Roche. D-димер был приобретен у Meridian Chemicals, США.

GoldMag с модифицированной поверхностью с PSS-MA

GoldMag были синтезированы, как описано ранее [17]. 13,3 мл CTAB (50 ммоль / л) добавляли к 13,3 мл GoldMag (приблизительно 3 мг / мл). Смесь механически перемешивали (200 об / мин) в сочетании с обработкой ультразвуком (SB-5200DTD, Китай) в течение 30 минут с последующим перемешиванием без обработки ультразвуком в течение еще 30 минут. Частицы тщательно промывали деионизированной водой. CTAB-GoldMag повторно диспергировали в 10 мл деионизированной воды и 16 мл 25% ( w / w ) Добавляли раствор PSS-MA с последующим перемешиванием (180 об / мин) в течение 90 минут. Модифицированные частицы дважды промывали деионизированной водой и диспергировали в деионизированной воде.

Характеристика

PSS-MA-GoldMag наблюдали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ, Hitachi H-600, Hitachi Corporation, Япония). Распределение по размерам анализировали с помощью DLS (zeta-sizer, Malvern Instruments, UK). Инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье (FTIR, Thermo Nicolet 5700, Thermo Nicolet Corporation, США) использовали для характеристики функциональных групп PSS-MA-GoldMag. Термогравиметрический анализатор (ТГА) Metter Toledo SDTA 851e был использован для анализа доли полимерной поверхностной оболочки среди PSS-MA-GoldMag. Спектр поверхностного плазмонного резонанса (ППР) GoldMag регистрировали с помощью спектрофотометра UV-2550 (Shimadzu, Япония) в диапазоне длин волн 450–700 нм.

Приготовление зонда Anti-D-димер-антитело-PSS-MA-GoldMag

Один миллиграмм GoldMag суспендировали в 1 мл буфера бура / борат (0,02 M, pH 7,4), содержащего 75 мг / мл 1-этил-3- (3-диметил-ламинопропил) карбодиимида (EDC). Затем к суспензии добавляли 100 мкг анти-D-димера антитела с последующей обработкой ультразвуком в течение 1 часа. В смесь добавляли три миллилитра блокирующего буфера (0,02 М бура / боратный буфер, pH 7,4, содержащий 5% BSA) и инкубировали в течение 1,5 часов. После разделения во внешнем магнитном поле композит анти-D-димер антитело-PSS-MA-GoldMag выдерживали в буфере борак / борат при 4 ° C. Конъюгация анти-D-димера антитела на поверхности PSS-MA-GoldMag была подтверждена с помощью спектроскопии SPR и измерения динамического светорассеяния (DLS).

Раствор D-димера получали разбавлением исходного раствора D-димера (40 мг / мл) сывороткой теленка. Три концентрации D-димера (0,6, 2 и 6 мкг / мл) использовали для оптимизации времени реакции между D-димером и комплексом анти-D-димер антитело-PSS-MA-GoldMag. Десять микролитров анти-D-димера антитело-PSS-MA-GoldMag (0,3 мг / мл) смешивали с 80 мкл раствора D-димера (0,6, 2 и 6 мкг / мл), и смесь инкубировали при 25 ° C. C в течение 10, 20, 30 и 40 мин. Длину волны пика SPR композита PSS-MA-GoldMag считывали с помощью спектрофотометра UV-2550.

Растворы D-димера с концентрациями 6, 3, 1,5, 0,75 и 0,3 мкг / мл были приготовлены для анализа связи между концентрацией D-димера и изменением спектра ППР. Десять микролитров анти-D-димера антитело-PSS-MA-GoldMag (0,3 мг / мл) смешивали с 80 мкл раствора D-димера (6, 3, 1,5, 0,75 и 0,3 мкг / мл) и смесь перемешивали. инкубируют при 25 ° C в течение 30 мин. Длину волны пика SPR PSS-MA-GoldMag считывали с помощью спектрофотометра UV-2550.

Чтобы оценить, могут ли триглицериды, билирубин и гемоглобин влиять на нашу систему обнаружения белка, были приготовлены растворы D-димера (0 и 3 мкг / мл) и 22 мг / мл триглицеридов, 0,2 мг / мл билирубина и 2 мг / мл. мл образцов гемоглобина добавляли отдельно. К вышеуказанным смесям добавляли десять микролитров анти-D-димера антитело-PSS-MA-GoldMag и считывали длину волны пика SPR композита PSS-MA-GoldMag с помощью спектрофотометра UV-2550.

Результаты и обсуждение

Схема 1 иллюстрирует процедуры, разработанные для модификации поверхности и функционализации частиц для колориметрического обнаружения белков. Для изучения адсорбции и включения PSS-MA в структуры PSS-MA-GoldMag были выполнены FTIR-спектроскопические анализы, SPR-спектроскопия и TGA. На рис. 1а показан спектр FTIR для чистого PSS-MA, PSS-MA-GoldMag и GoldMag, соответственно. Широкая и сильная полоса 3000–3700 см ⁻¹ соответствует растяжению групп –CO – OH и гидроксильных групп –SO ₂ –ОН в полимерных цепях [18]. Симметричные колебания сульфонатных групп:(SO ₃ ^- ) были на 1037 и 1126 см ⁻¹ а валентные колебания C =C бензола были при 1403 и 1637 см ^-1 [19]. Эти характерные полосы поглощения PSS-MA наблюдались в PSS-MA-GoldMag, демонстрируя, что необработанные частицы были успешно покрыты PSS-MA. Изменение поверхностных химических групп GoldMag было подтверждено четким синим сдвигом на 11 нм от 555 до 544 нм в полосе ППР после модификации (рис. 1b). Положение и ширина пика ППР зависели от поверхности, окружающей среды и дисперсности наночастиц [20,21,22,23]. Анализ ТГА показал, что массовое отношение органического материала к GoldMag было примерно 1:4 (рис. 1c). При низкой температуре похудание можно отнести к обезвоживанию; потеря веса при повышении температуры может быть связана с окислительным разложением органических молекул на поверхности модифицированных частиц [19, 24]. Во время модификации CTAB-GoldMag заряжались положительно (+ 12,2 мВ), а поверхность частиц становилась отрицательно заряженной (-24,5 мВ) после покрытия PSS-MA на поверхности частиц (рис. 1d). Все приведенные выше результаты показывают, что PSS-MA успешно прикрепляются к поверхности наночастиц.

Микрофотографии (рис. 2а, б) GoldMag и PSS-MA-GoldMag, полученные с помощью ПЭМ, показывают, что эти частицы после модификации были монодисперсными. Слой полимера на поверхности частиц отчетливо виден под электронно-микроскопическим изображением высокого разрешения, что дополнительно указывает на успешное нанесение полимерного покрытия на GoldMag (рис. 2b). Рисунок 2c показывает, что средний диаметр PSS-MA-GoldMag составляет 116 нм. Суспензия PSS-MA-GoldMag имеет винно-красный цвет, что свидетельствует о хорошей стабильности наночастиц (1 год в воде).

Стабильность оптических характеристик GoldMag и PSS-MA-GoldMag в буферных растворах с различными значениями pH анализировали методом ППР-спектроскопии [7]. Как показано на фиг. 3a, характеристический пик SPR был смещен в сторону большей длины волны от 555 нм, когда GoldMag суспендировали в буфере боракса / бората с pH от 6,0 до 9,0. Состав буферного раствора также влияет на стабильность суспензии GoldMag. Положение характеристического пика SPR было перемещено в сторону более высоких длин волн (558 нм), когда GoldMag был суспендирован в буфере PB (pH 7,4), буфере боракса / бората (pH 7,4) и растворе NaCl (10 мМ) по сравнению с таковыми в деионизированной воде. (550 нм) (рис. 3в). Однако характерный пик SPR (545 ± 2 нм) существенно не изменился при диспергировании PSS-MA-GoldMag в растворе электролита или в буферном растворе с разными значениями pH (рис. 3b, d). Xia et al. и Сторхофф и др. также сообщили, что агрегация наночастиц может вызвать сдвиг спектра ППР в сторону более длинных волн [25, 26]. Также измеряли дзета-потенциал GoldMag и PSS-MA-GoldMag (рис. 3e, f). Сообщалось, что низкий дзета-потенциал (менее ± 30 мВ) приведет к агломерации частиц [27, 28]. Когда GoldMag суспендировали в буфере PB (pH 7,4), буфере боракса / бората (pH 7,4) и растворе NaCl (10 мМ), дзета-потенциал GoldMag составлял -16,7 ± 1,1 мВ, -14,3 ± 2,1 мВ и -8,9 ± 1,5 мВ соответственно. Дзета-потенциал GoldMag составлял -14,2 ± 1,7 мВ, -17 ± 1,1 мВ, 13,9 ± 1,7 мВ и -18,1 ± 1,6 мВ, когда частицы суспендировали в буфере бура / борат с pH от 6,0 до 9,0. Однако прилипание PSS-MA к GoldMag резко снижает его дзета-потенциал в различных растворах электролитов, а также при различных значениях pH. Во всех случаях дзета-потенциал был ниже -30 мВ. Эти результаты показывают, что модификация поверхности GoldMag с помощью PSS-MA значительно улучшает его устойчивость к изменениям состава и значений pH буферных растворов и обеспечивает высокий уровень дисперсности [29].

Чтобы исследовать взаимодействие между белком и PSS-MA-GoldMag, анти-D-димерные антитела конъюгировали с PSS-MA-GoldMag посредством реакции между аминогруппами белка и карбоксильными группами полимера, опосредованной EDC. Как показано на рис. 4а, красный сдвиг пика SPR наблюдался после реакции PSS-MA-GoldMag с анти-D-димерными антителами, что указывает на конъюгацию антител на наночастицах [30, 31]. Увеличение среднего диаметра частиц со 116 до 130 нм подтверждает введение анти-D-димерного антитела в PSS-MA-GoldMag (рис. 4b) [24]. Влияние массы антитела на оптические свойства PSS-MA-GoldMag оценивали с помощью SPR-спектроскопии после добавления различных количеств анти-D-димерного антитела (от 20 до 200 мкг) к суспензии PSS-MA-GoldMag. Как показано на рис. 4c, пик SPR не изменился и сохранялся на 548 ± 3,0 нм, независимо от количества добавленных антител.

Чтобы оценить активность антител после конъюгации на PSS-MA-GoldMag, зонд A и зонд B были приготовлены путем иммобилизации пары антител (антитело 1 и антитело 2) и антитела 1 на PSS-MA-GoldMag, соответственно. Взаимодействие между двумя типами зонда и D-димером анализировали с помощью спектроскопии ППР. Наилучшее время реакции было получено при наблюдении за изменением максимума пика SPR в течение 40 минут после добавления трех концентраций D-димера (0,6, 2 и 6 мкг / мл) к зонду A. Как показано на рис. 5a, наблюдался значительный сдвиг в полосе поверхностных плазмонов в результате агрегации PSS-MA-GoldMag через поперечные связи между сэндвич-мостом антиген-антитело с течением времени. При низкой концентрации (0,6 мкг / мл) не было значительного изменения в спектре SPR от 20 до 40 минут, что указывает на то, что 20 минут достаточно для реакции 0,6 мкг / мл или более низких концентраций D-димера. Однако при использовании средних и высоких концентраций D-димера (2 и 6 мкг / мл) длина волны продолжала увеличиваться 30 мин. Это указывает на то, что лучшее время реакции составляет 30 мин. Как показано на рис. 5b, спектр ППР композитных частиц показал отчетливое красное смещение поверхностного плазмонного резонанса от λ _max =550-570 нм и уменьшение интенсивности характеристического пика при увеличении концентрации D-димера с 0,3 до 6 мкг / мл. Это вызвано агрегацией PSS-MA-GoldMag, вызванной перекрестным соединением D-димера с антителом 1 и антителом 2 на зонде A. Агрегация PSS-MA-GoldMag привела к изменению оптических свойств золота. часть PSS-MA-GoldMag. Jiang et al. и Ли и др. также сообщили, что агрегация нанозолота может вызвать красное смещение и границу спектра ППР наночастиц [32, 33]. Однако на рис. 5d не наблюдалось красного сдвига, поскольку взаимодействие между D-димером и антителом 1 не могло привести к сборке наночастиц. Кроме того, заметное красное смещение (5 нм) наблюдалось даже при том, что количество D-димера, добавленного к зонду A, составляло всего 0,3 мкг / мл, что указывает на то, что предел обнаружения ниже диагностических пороговых значений (0,5 мкг / мл) для этого биомаркера. Линейная зависимость между положением спектрального пика SPR и концентрацией D-димера была обнаружена в диапазоне 0,3–6 мкг / мл ( r ² =0,9944) (рис. 5в).

Как показано на фиг. 6, не было обнаружено значительного сдвига характеристического пика SPR PSS-MA-GoldMag в присутствии триглицеридов, билирубина и гемоглобина, соответственно. Этот результат указывает на то, что наша система обнаружения белков не взаимодействует с триглицеридами, билирубином и гемоглобином.

Эти результаты показывают, что PSS-MA-GoldMag является многообещающей магнитной наночастицей для иммобилизации белков и может образовывать многослойный мостик на поверхности частицы через антитело 1-целевой белок-антитело 2. Это делает PSS-MA-GoldMag ценным материалом для использования. в оптическом обнаружении биомаркеров в местах оказания медицинской помощи.

В данном исследовании PSS-MA впервые был использован для модификации GoldMag (схема 1). Введение PSS-MA на поверхность GoldMag значительно улучшило его стабильность в буферном растворе. Помимо стерических препятствий, которые вызваны длинной полимерной цепью PSS-MA, карбоксильные группы и сульфогруппа в PSS-MA вызывают электростатическое отталкивание между наночастицами [29]. Это значительно повышает стабильность PSS-MA-GoldMag. Большое количество карбоксильных групп на поверхности частицы отвечает требованиям конъюгации с биомолекулой.

Выводы

В настоящем исследовании описан простой и быстрый метод покрытия GoldMag PSS-MA. Результаты показывают, что коллоидная стабильность и дисперсность GoldMag были значительно улучшены за счет введения PSS-MA. Частицы обладают хорошей стабильностью в буферном растворе с широким диапазоном pH. Кроме того, наличие карбоксильной группы дает возможность конъюгировать белки с наночастицами. Взяв за модель D-димер и его антитело, было обнаружено, что оптические характеристики могут быть адаптированы посредством сшивания между антигеном и композитом антитело-наночастица. Результаты показывают, что GoldMag, модифицированный PSS-MA, может служить очень многообещающим кандидатом для оптического обнаружения на основе иммуноанализов.

Сокращения

DLS:: Динамическое рассеяние света
FTIR:: Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье
GoldMag:: Магнитные наночастицы золота
MUA:: 11-меркаптоундекановая кислота
PEI:: Полиэтиленимин
PSS:: Полистиролсульфонат
PSS-MA:: Поли (4-стиролсульфоновая кислота-малеиновая кислота)
SPR:: Поверхностный плазмонный резонанс
ТЕМ:: Просвечивающий электронный микроскоп
TGA:: Термогравиметрический анализатор

Синтез и люминесцентные свойства водорастворимых наночастиц α-NaGdF4 / β-NaYF4:Yb, Er Core – Shell Серебряный затворный электрод с УФ-отверждением для струйной печати с низким электрическим сопротивлением

Наноматериалы