Наночастицы черного фосфора способствуют остеогенной дифференцировке EMSC посредством усиленной экспрессии TG2

Введение

В клинических условиях отсутствие регенерации кости может привести к плохому прогнозу даже при обычных переломах костей, и существует острая потребность в материалах для регенерации кости [1]. Впоследствии многие терапевтические стратегии, такие как аутотрансплантаты, аллотрансплантаты и искусственные костные каркасы, были использованы в качестве регенеративных материалов. В последние годы было успешно продемонстрировано, что биоматериалы способствуют регенерации костей, что свидетельствует о впечатляющем прогрессе в разнообразных применениях биоматериалов [2]. Однако разработка искусственного заменителя кости с отличной остео-проводимостью, остеоиндукцией и остеоинтеграцией по-прежнему остро необходима. Биоактивные полимеры [3,4,5] и керамика [6] были превращены в каркасы для костной инженерии, и особую озабоченность вызывают каркасы, усиливающие остеогенез за счет высвобождения ионов [7]. Примечательно, что неорганические фосфаты, которые специфически действуют на клетки или ткани-мишени, могут предоставить многообещающий путь для изучения биологических процессов, связанных с минерализацией, и развития медицинской инженерии, основанной на биоинспирации [8].

В 2014 году Ли и его сотрудники сообщили, что нанолисты черного фосфора (БФ) могут быть отслоены от массивного БП, и продемонстрировали потенциал нанолистов БП в качестве нового двумерного (2D) материала для применения в наноэлектронных устройствах [9]. Благодаря превосходным свойствам БП, таким как отдельные гофрированные структуры в слоях, регулируемая прямая запрещенная зона, высокая подвижность носителей и множество интересных внутрислойных анизотропий, БП в настоящее время исследуется на предмет потенциальных биомедицинских приложений [10]. Благодаря этим преимуществам каркасы на основе наноматериалов БП для стимуляции регенерации костей интенсивно исследуются в последние 2 года. Предыдущие исследования показали, что биоматериалы на основе фосфора могут усиливать минерализацию и регенерацию костей за счет увеличения локальной концентрации фосфат-ионов [11]. Хотя БП можно считать идеальным кандидатом для ускорения регенерации кости, его обычно инкапсулируют в полимеры или вводят на каркасы из биоматериала путем погружения для применения инженером по костной ткани. До сих пор молекулярные механизмы, которые модулируют регенерацию кости с помощью АД, остаются в значительной степени неизвестными и, таким образом, препятствуют дальнейшему развитию методов лечения на основе АД для восстановления костей в клинике.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой мультипотентные стромальные клетки, обладающие способностью к самообновлению и дифференцировке нескольких линий [12]. После переломов костей МСК играют ключевую роль в процессе восстановления кости in vivo [13,14,15]. Стволовые клетки костного мозга (BMSC) и их потенциал остеогенной дифференцировки активно изучались на протяжении многих лет. Однако процесс сбора BMSC может быть болезненным для поставщиков, чреват риском заражения. Эктодермальные мезенхимальные стволовые клетки (EMSC), происходящие из краниального нервного гребня во время эмбрионального развития, могут быть легко получены из слизистой оболочки дыхательных путей носовой полости у взрослых. Кроме того, EMSC являются самообновляемыми с потенциалом разнонаправленной дифференциации, который был подробно охарактеризован в наших предыдущих исследованиях [16, 17]. Мы доказали, что EMSC могут дифференцироваться в несколько клеточных линий, включая адипоциты, нейроциты, хондроциты и остеоциты [18, 19]. Эти особые свойства делают EMSCs перспективным инструментом для изучения потенциальных молекулярных механизмов, которые модулируют остеогенную дифференцировку EMSC с помощью химических сигналов, включая BP. Однако остеогенная дифференцировка - сложный процесс, включающий тесную координацию пролиферации и дифференцировки различных клеток, синтез и минерализацию внеклеточного матрикса (ЕСМ) [20]. Предыдущие исследования показали, что трансглутаминаза 2 (TG2) способна стимулировать остеогенез остеобластов, влияя на пролиферацию, дифференцировку, образование внеклеточного матрикса и минерализацию остеобластов [21,22,23].

Приведенные выше отчеты показывают, что BP обладают огромным потенциалом для биомедицинских приложений, которые могут быть превосходным индуктором остеогенной дифференцировки для EMSC. До сих пор не сообщалось об исследованиях влияния БП на дифференциацию EMSC. Основная цель настоящего исследования состояла в том, чтобы изучить влияние BP на EMSC-ассоциированную остеогенную дифференцировку и пролиферацию in vitro. После этого исследования также был тщательно изучен потенциальный молекулярный механизм BP на пролиферацию EMSC и остеогенную дифференцировку. В целом, наши данные показывают, что БП могут быть потенциально полезным химическим агентом для тканевых каркасов.

Материалы и методы

Наночастицы черного фосфора

Массовый BP был приобретен у Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd. Диметилсульфоксид (ДМСО), гидроксид натрия (NaOH) и N -метил-2пирролидон (NMP) был предоставлен Aladdin Industrial Co., Ltd. Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) был получен от Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. Модифицированная Дульбекко смесь среда / питательные вещества F12 (DMEM / F12; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences), стрептомицин, пенициллин, фетальная бычья сыворотка (FBS) были получены от BI Science and Technology Co., Ltd.

Синтез БП был аналогичен таковому в предыдущих отчетах с небольшими изменениями [24]. Сначала 20 мг нерасфасованного БП погружали в насыщенный раствор NaOH / NMP и очищали механическим способом измельчения. Затем смесь центрифугировали 10 мин при 1500 об / мин, после чего осадок отбрасывали. После этого смесь обрабатывали ультразвуком в течение 6 ч на бане лед / вода, а затем смесь фильтровали через фильтр BD Falcon 100 мкм (Becton Dickinson, Саннивейл, Калифорния). Наконец, было выполнено дополнительное центрифугирование суспензии (10 мин при 13000 об / мин, 4 ° C), и осадок был собран.

Иммунофлуоресцентное окрашивание EMSC слизистой оболочки носа

Чтобы показать EMSC in vivo, слизистую дыхательных путей носовой перегородки иссекали и затем фиксировали в 4% PFA в течение ночи для иммунофлуоресцентного окрашивания. Ткани промывали PBS, а затем обезвоживали градиентными растворами сахарозы. Ткани помещали в ОКТ (Sakura Finetek, Япония) для криосрезов и вырезали коронковые серийные срезы толщиной 25 мм с помощью криомикротома Leica. Эти срезы промывали PBS в течение 10 минут и повышали проницаемость с помощью 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Triton-X 100 в PBS. EMSC в слизистой оболочке носа иммунофлуоресцентно окрашивали первичным антителом против нестина и вторичным антителом, конъюгированным с Cy3. Параллельные отрицательные контроли подвергали тем же процедурам без первичных антител. Окрашенные ткани наблюдали под иммунофлуоресцентным микроскопом (AxioObserver, ZEISS, Германия).

Культура клеток

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и этике Университета Цзяннань, и в этом исследовании строго соблюдались Международные рекомендации по исследованиям на животных. Первичные эктомезенхимальные стволовые клетки были выделены из слизистой оболочки дыхательных путей крыс согласно нашим предыдущим исследованиям [17, 25]. Вкратце, 100 г взрослых крыс Sprague Dawley (SD) анестезировали внутрибрюшинными инъекциями пентобарбитала натрия (0,05 г / кг). Среднюю треть перегородки носа измельчали, а затем инкубировали в 0,25% растворе трипсина (Hyclone; GE Healthcare Life Sciences) при 37 ° C в течение 25 минут, после чего слизистую оболочку носовой перегородки осторожно отделяли. Наконец, ткань слизистой оболочки носовой перегородки разрезали на кусочки. Полученную суспензию тканей пропускали через сито с нейлоновыми ячейками 100 мкм, центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин и затем дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Суспензию ткани помещали в колбу для культивирования клеток в среде для выращивания (DMEM / 12 содержит 10% FBS, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) и культивировали при 37 ° C в 5% CO 2. / sub> и 95% воздух с насыщенной влажностью. Среду заменяли каждые три дня, а клетки пассировали каждую неделю. Клетки в третьем пассаже использовали для всех исследований характеристик. Иммунофлуоресценция была проведена для характеристики культивируемых клеток с помощью антител против маркеров стволовых клеток, включая виментин и нестин [26].

Определение возможности многонаправленной дифференциации EMSC

EMSC высевали в 6-луночные планшеты и культивировали со средой DEME / F12 в течение 24 часов до 70% слияния. Затем среду заменяли средой для остеогенной дифференцировки (DMEM с добавлением 10% FBS, 0,1 мМ дексаметазона, 10 мМ β-глицерофосфата динатрия и 0,2 мМ l-аскорбиновой кислоты) для индукции остеогенеза. Среду меняли каждые семь дней, и окрашивание ализарином Red S выполняли с 0,5% ализарином Red S (Sigma-Aldrich) на 28 день. EMSC, выросшие до 90% слияния, культивировали в среде для адипогенной дифференцировки, чтобы вызвать адипогенез в течение 21 дня. Окрашивание масляным красным проводили с помощью набора для окрашивания масляным красным (Solarbio) в соответствии с инструкциями производителя.

Характеристика БП

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) использовалась для характеристики морфологии и размера BP. Образцы готовили, помещая каплю раствора БП с концентрацией 1 мг / мл в деионизированной воде на медную сетку, покрытую формваром, и затем сушили на воздухе. Образцы фотографировали с помощью сканирующей электронной микроскопии (H-7500; Hitachi, Tokyo, Japan). Средний размер BP анализировали с помощью программного обеспечения image Pro Plus (Media Cybernetics Inc., MD, США). Оценка дзета-потенциала была подтверждена анализатором дзета-сайзера Malvern (ZEN3600). Рентгеновская дифракция (XRD) проводилась на дифрактометре Bruker D8 Discover в парафокусированном геометрии Брэгга – Брентано и Cu Kα-излучении. Дифрактограммы были получены между 10 ° и 80 ° 2 θ с шагом 0,01 ° 2 θ и время сбора данных 0,2 с на шаг. Полученные данные оценивали с помощью программного обеспечения HighScore Plus 3.0e. Рамановский спектрометр (LabRam HR800) с лазерным возбуждением 514 нм использовался для измерения рамановских спектров образца. Состав поверхности образца был измерен с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии ([XPS] Omicron NanoTechnology GmbH, Германия).

Анализ набора для подсчета клеток ‑ 8 (CCK ‑ 8)

Влияние BP на пролиферацию клеток оценивали с использованием набора для подсчета клеток (CCK-8). Вкратце, EMSC (3000 клеток / лунка) помещали в 96-луночные планшеты и обрабатывали БП (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 и 512 мкг / мл) в течение 24 часов при 37 ° С. ° C. Для обнаружения CCK8 в культуральную среду за 4 часа до анализа добавляли 10 мкл реагента CCK8. Оптическую плотность (OD) при 450 нм измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Thermo Fisher Scientific, Мадрид, Испания) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрация БП, используемая для дальнейшего исследования, была выбрана на основании результатов анализа CCK-8. Что касается окрашивания Ki-67, EMSC (1 × 10 ⁴ ) культивировали в 24-луночных планшетах и ​​окрашивали иммунофлуоресценцией на Ki-67 (кроличьи поликлональные; каталожный номер ab15580; abcam; 1:300). DAPI использовали для окрашивания ядер. Изображения были получены с помощью флуоресцентной микроскопии (увеличение 200 ×; Eclipse Ti; корпорация Nikon) и проанализированы с помощью программного обеспечения Image Pro Plus.

Остеогенная дифференциация

Для остеогенной дифференцировки EMSC были засеяны с плотностью 3000 клеток / см ² и культивировали в питательной среде до слияния 70%. Затем клетки индуцировали средой для дифференцировки остеогенеза в течение 2 недель. Примечательно, что во избежание влияния β-глицерофосфата натрия в среду для дифференцировки остеогенеза добавляли 10% FBS, 0,1 мМ дексаметазона и 0,2 мМ l-аскорбиновую кислоту (Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США), но не с β-глицерофосфатом натрия. После индукции дифференцировки использовали окрашивание щелочной фосфатазой (ЩФ) и ализариновым красным и ОТ-кПЦР для оценки любых эффектов БП на остеогенную дифференцировку ЭМС. ЭМС были засеяны с плотностью 2 × 10 ⁵ клеток / лунку в 6-луночных планшетах и ​​инкубировали с остеогенной средой. Согласно инструкциям производителя, окрашивание ALP оценивали с использованием набора для окрашивания ALP (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) на 14 день. Окрашивание ализарином красным S применяли для визуализации отложения фосфата кальция. Вкратце, фиксированные клетки снова промывали деионизированной водой и инкубировали с 1 мл / лунку окрашивающего раствора ализарином красным (0,5% (мас. / Об.) Alizarin Red S (Sigma-Aldrich) в PBS) в течение 10 минут при 37 ° C.После раствор удаляли, образец снова промывали деионизированной водой.Положительную площадь окрашивания, указывающую на кальцинированные узелки на поле, подсчитывали с помощью программного обеспечения Image-Pro plus и нормализовали к соответствующему контролю.

RT-qPCR

RT-qPCR выполняли, как описано ранее. Вкратце, тотальную РНК выделяли из монокультуры или сортировали с использованием набора для очистки РНК (TaKaRa, Япония) в соответствии с инструкциями производителя. Два микрограмма мРНК были обратно транскрибированы в кДНК с использованием набора для синтеза кДНК (Fermentas). Праймеры, используемые для ОТ-ПЦР, были разработаны и сконструированы Nanjing GenScript Bioengineering Technology and Services Co., Ltd (Нанкин, Китай), как показано в таблице 1. Для обработки ОТ-ПЦР использовали набор SYBR Green / Fluorescein qPCR Master Mix (Fermentas). с системой ABI Prism 7500. Данные были нормализованы для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), чтобы указать относительные уровни экспрессии. Все измерения были выполнены в трех экземплярах.

Вестерн Блот

Культивируемые клетки дважды промывали PBS и затем лизировали на льду в течение 30 мин с буфером для лизиса RIPA, содержащим смесь ингибиторов фосфатазы и протеазы. Для сбора общего TG2 лизаты клеток и ЕСМ в 6-луночных планшетах собирали с помощью скребка для клеток. Планшеты промывали PBS, и жидкости для промывки клеток также собирали. Лизаты собирали из супернатанта центрифугированием при 12000 × g . в течение 5 мин, смешивали с равным объемом загрузочного буфера SDS, а затем кипятили в течение 5 мин. Концентрации белка определяли с использованием набора BCA Protein Assay kit (Beyotime, Шанхай, Китай, P0012). Белки экстрагировали в буфере для лизиса RIPA, разделяли на полиакриламидных гелях додецилсульфата натрия (SDS) и электрофоретически переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Millipore, LA, США). Мембраны блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в 0,01 M трис-буферном физиологическом растворе (TBS), содержащем 0,5% Tween 20 (Suolaibao, Пекин, Китай), и блотировали указанными антителами, включая анти-TG2 (1:200; sc-48387, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), анти-FN (1:500; каталожный номер BA1772; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.) и анти-LN (1:500; каталожный номер BM4921; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), анти-OCN (1:200; sc-390877, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), анти-OPN (1:200; sc-73631, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), анти- COL I (1:500; каталожный номер BA0325; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.) при 4 ° C в течение 12 часов. Затем мембраны реагировали с конъюгированным с пероксидазой хрена козьим анти-кроличьим IgG (1:5000; Boster, Ухань, Китай) в течение 2 часов при комнатной температуре. Полосы белка визуализировали с использованием субстрата Pierce ECL Plus (Thermo Fisher Scientific), а затем сканировали с помощью системы Chemiluminescence Imaging System (Clinx Science Instruments, Шанхай, Китай).

Эксперименты по подавлению

Чтобы подтвердить участие TG2, эксперименты по ингибированию TG2 были проведены на EMSC. Эксперименты по нейтрализации проводили с нейтрализующим антителом против TG2 (от BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния). Клетки высевали в 6-луночные планшеты с нормальной культуральной средой на 24 часа для прилипания и обрабатывали антителом против TG2 (10 мкг / мл). При этом была установлена ​​контрольная группа. После посева в 6-луночные планшеты в течение 24 часов, остеогенез EMSC индуцировали в течение 14 дней с использованием остеогенной среды с БП (2 мкг / мл), а культуральную среду, содержащую ингибиторы, заменяли свежей остеогенной средой каждые 7 дней. Окрашивание ализарином красным S применяли для визуализации отложения фосфата кальция. Вестерн-блоттинг использовался для оценки уровней остеокальцина, остеопонтина и коллагена типа 1 (экспрессия OCN, OPN и COL I соответственно).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Культивируемые клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 8 ч при 4 ° C. Фиксированные клетки промывали трижды PBS и в течение 30 минут подвергали проницаемости в PBS, содержащем 0,2% Triton X-100 и 1% BSA (Suolaibao, Пекин, Китай). После пермеабилизации эти фиксированные клетки промывали PBS и затем инкубировали с первичными антителами при 4 ° C в течение 8 часов с последующим удалением всех первичных антител. Затем клетки трижды промывали PBS и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре со вторичными антителами Alexa Fluor-594 (1:800, Life Technologies Molecular Probes, Карлсбад, Калифорния, США) при 37 ° C в течение 2 часов. Ядра контрастировали 4'6-диамидино-2-фенилиндолом ([DAPI]; Sigma-Aldrich). Все тестируемые группы наблюдались под иммунофлуоресцентным микроскопом.

Статистический анализ

Данные были получены из трех отдельных экспериментов, описанных выше, и представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Анализ распределения данных проводился с использованием студенческой t -тест для анализа значимости различий между обработанной и контрольной группами. Для оценки значимых различий между группами выполняли односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки. p <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Характеристика БП

Распределение BP по размерам, измеренное с помощью динамического рассеяния света (DLS), было относительно узким в диапазоне от 100 до 200 нм с пиковым значением при 132 нм. Результат показан на рис. 1А. Дзета-потенциал BP был определен как -23,7 ± 0,65 мВ (рис. 1B), что подтверждает стабильность BP. Размер частиц был дополнительно исследован с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) (рис. 1C). Результаты хорошо согласуются с измерением гранулометрического состава методом DLS.

Характеристика БП. А Распределение наночастиц черного фосфора (БЧ) по размерам; Б отчет о дзета-потенциале БП с дзета-потенциалом - 23,7 ± 0,65 мВ; В Сканирующая электронная микроскопия (SEM) изображения нанолистов BP (BPN). D Рамановские спектры БП; E Рентгеновская дифрактограмма и F P 2p спектры рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии высокого разрешения (XPS) БП; G XPS-спектры БП

Рамановское рассеяние (рис. 1D) выявило три заметных пика при 362,3, 438,5 и 466,9 см ⁻¹ . связанный с внеплоскостной фононной модой ( A ¹ _g ) и два режима в плоскости ( B ² _g и A ² _g ) БП, [17, 18] соответственно. XRD (рис. 1E) показывает чистоту фазы приготовленного материала со средним размером кристаллов 102,7 нм. Расширение дифракционной картины указывает на нанометровый размер отдельных кристаллитов. Спектры РФЭС высокого разрешения P 2 p (рис. 1F) показывают основной пик при 130 эВ, соответствующий связи P – P черного фосфора, в дополнение к дополнительному пику при 135 эВ, происходящему от связей P – O, вызванных окислением поверхности. БП. Поверхность БП исследовали с помощью рентгеновского излучения с широким сканированием (рис. 1G).

Характеристика EMSC

Иммунофлуоресцентное окрашивание слизистой оболочки носа показало, что нестин-положительные EMSC расположены в собственной пластинке под респираторным эпителием носовой перегородки (рис. 2А). Культивируемые EMSC на третьем пассаже выглядели как фибробластоподобные клетки и быстро размножались на пластиковых планшетах (рис. 2B). Мы оценили остеогенную дифференцировку в остеогенной среде по окрашиванию ализарином красным на 28 день (рис. 2С). Адипогенную дифференцировку в адипогенной индукционной среде оценивали на 21 день путем окрашивания масляным красным раствором O (фиг. 2D). Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что почти все EMSC экспрессировали клеточные маркеры нервного гребня, такие как нестин (> 95%), как показано на фиг. 2E, и виментин (> 95%), как показано на фиг. 2F. Результаты совместной экспрессии маркеров стволовых клеток показывают, что эти EMSC являются типом мезенхимальных стволовых клеток.

Идентификация эктодермальных мезенхимальных стволовых клеток (EMSC). А Нестин-положительные EMSC (cy3, красный) располагались в собственной пластинке под респираторным эпителием носовой перегородки; Б Фазово-контрастное изображение показало, что культивируемые EMSC на третьем пассаже выглядели как фибробластоподобные клетки и быстро размножались на пластиковых пластинах; В Остеогенно дифференцированные ЭМС в остеогенной среде окрашивали ализариновым красным; D Адипогенно дифференцированные ЭМС в среде для индукции адипогена окрашивали масляным красным-O; E , F Иммунофлуоресцентное окрашивание маркеров клеток нервного гребня показало, что почти все EMSC экспрессируют нестин и виментин. IgG-Cy3 (красный) использовали в качестве второго антитела для иммунофлуоресцентного окрашивания, а ядра контрастно окрашивали Hoechst 33342 (синий)

Цитотоксичность

В качестве предварительного эксперимента был проведен анализ CCK-8 для оценки цитотоксичности BP. Жизнеспособность EMSC через 24 часа воздействия BP показана на рис. 3. Не было отмечено значительной цитотоксичности после воздействия до 32 мкг / мл BP. Однако воздействие БП вызывает значительную цитотоксичность при более высоких дозах (> 32 мкг / мл). Экспрессия Ki-67 в ядрышке и хромосомах наблюдалась в группе низких доз (рис. 4A – C). Однако соотношение между Ki-67-положительными ядрами и общей популяцией ядер не показало значительной разницы в EMSC, обработанных низкими дозами BP, по сравнению с необработанными контролями (фиг. 4D). Поэтому в настоящем исследовании мы выбираем концентрации БП 2 и 4 мкг / мл в следующих экспериментах, в которых не наблюдалось значительной цитотоксичности.

Цитотоксичность БП. Клетки обрабатывали BP (0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 и 512 мкг / мл) в течение 24 часов, и жизнеспособность EMSC проверяли с помощью набора для подсчета клеток (CCK-8), пролиферации (<я> н =9). Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). ** p <0,01.

Оценка пролиферации клеток в группе, получавшей БП. EMSC обрабатывали БП (0, 2 и 4 мкг / мл) в течение 24 часов. Пролиферацию клеток измеряли иммунофлуоресцентным окрашиванием антителом против Ki67 (красный) и DAPI (синий), и были показаны объединенные изображения ( A - C ). Ki67-положительные клетки среди 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) -положительных клеток подсчитывали в двух полях высокого увеличения в каждой из трех чашек. Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение ( D ).

Красное окрашивание ализарином

Как показано на фиг. 5А, минерализацию клеток оценивали по окрашиванию ализарином красным S после обработки кондиционированной средой в течение 14 дней. Все кальциевые узелки наблюдались в трех группах, тогда как неформованные кальциевые узелки присутствовали в контрольной группе. По сравнению с контрольной группой кальциевые узелки, отложившиеся в группах 2 и 4 мкг / мл, были больше ( p <0,05), но явных различий между группами лечения не наблюдалось ( p > 0,05), как показано на рис. 5C.

Тесты на окрашивание щелочной фосфатазой (ЩФ) и ализарином красным. А Остеогенно дифференцированные ЭМС, окрашенные раствором ализарина красным на 14 день; Б Окрашивание ЩФ визуализировали под микроскопом; В диаграмма показывает количественную оценку площадей отложения ализаринового красного; D значительно более высокая активность ЩФ была показана в группе EMSC, получавшей БП, чем в контрольной группе. Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. ** p <0,01

Тесты ALP

Окрашивание ALP было проведено для изучения остеогенной дифференцировки EMSC. По сравнению с контрольной группой, EMSC в группах с 2 и 4 мкг / мл BP были более темными по цвету (фиг. 5B), что свидетельствует о том, что добавление BP вызывало усиление экспрессии ALP в EMSC. Клетки, обработанные БП, имели более высокую активность ЩФ, чем контрольная группа на 7 день ( p > 0,05), но существенной разницы между 2 и 4 мкг / мл не наблюдалось ( p > 0,05), как показано на рис. 5D.

RT-qPCR

Основные маркеры дифференцировки, включая связанный с runt фактор транскрипции 2 (RUNX 2), ALP, COL 1, OCN, OPN и костный морфогенный белок 2 (BMP-2), были проанализированы на 14 день, как показано на рис. 6. Экспрессия всех этих генных маркеров был обнаружен в трех группах клеток на 7 день. Не было обнаружено явных различий в экспрессии генов между группами 2 и 4 мкг / мл. Однако по сравнению с контрольными клетками экспрессия описанных выше генов в клетках, обработанных BP, была значительно увеличена.

БП потенцирует остеогенез ЭМС. EMSC выращивали в остеогенной среде с 0 мкг / мл, 2 мкг / мл, 4 мкг / мл БП в течение 14 дней. Экспрессию генов, участвующих в остеогенезе EMSC, количественно оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-qPCR). ** p <0,01, * p <0,05.

БП усиливают остеогенез EMSC за счет повышающей регуляции экспрессии TG2

Поскольку существенное влияние TG2 на интегрин-опосредованную дифференцировку и отложение ECM было продемонстрировано для широкого круга клеток, мы исследовали, будут ли BP способствовать остеогенной дифференцировке EMSC посредством усиления экспрессии TG2. Как показано на фиг. 7, мы обнаружили очевидную активацию внутриклеточного и внеклеточного TG2 в группах, получавших BP. Ламинин (LN) и фибронектин (FN) в клетках, обработанных 2 и 4 мкг / мл BP, были выше уровней, чем в контрольной группе (фиг. 7A). EMSC, подвергавшиеся воздействию BP, показали примерно двукратное увеличение уровней TG2 по сравнению с контрольной группой, но не наблюдалось значительной разницы между группами, получавшими BP (рис. 7B). Как макромолекулярный белок, антитело против TG2 не может проникать через клеточные мембраны. Таким образом, внеклеточный TG2 был заблокирован антителом и не смог сшить различные факторы роста и белки ЕСМ. Результаты Alizarin Red S (фиг. 8A, C) показали, что анти-TG2 заметно подавляли опосредованное АД увеличение кальция и отложения ECM. Между тем, как показано на фиг. 8D, анти-TG2 значительно ингибировали увеличение активности ЩФ в клетках, обработанных ВР. Более того, анти-TG2 эффективно устраняет влияние BP на экспрессию белков костного матрикса, включая OCN, OPN и COL I (рис. 9).

Transglutaminase 2 (TG2) was involved in the osteogenic differentiation of EMSCs. EMSCs were incubated with BPs (2 and 4 μg/ml) for 14 days, and fibronectin (FN), LN, and TG2 levels were assessed by immunoblotting. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05.

Osteogenic differentiation of EMSCs with TG2 neutralizing antibody. А ALP staining. Б ARS staining performed to examine extracellular mineralization. В Quantitative ALP analysis. D Quantitative Alizarin red staining analysis. **p  < 0.01

Anti-TG2 inhibited BP-induced EMSC osteogenic differentiation. А Representative western blots of osteoponin, osteocalcin, and collagen 1 (OPN, OCN, LN, FN, and COL I, respectively) in differentiated EMSCs following treatment with 2 μg/ml BPs and 2 μg/ml anti-TG2 or 2 μg/ml BPs alone. Б Quantification of OPN, OCN, and COL I protein expression. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05

Discussion

To the best of our knowledge, modification of phosphorus was first exhaustively studied as early as 1914; unfortunately, these studies did not receive much attention for an entire century [27]. Phosphorus is one of the essential elements making up about 1% of the total body weight as a bone component in the human body [28], while most of the other materials cannot warrant such a natural biocompatibility. In 2014, BP was introduced as a new member of the 2D layered materials.

In this study, the BP nanoparticles were prepared on a large scale from bulk BP crystals by using an improved mechanical grinding and continuous ultrasound method. Compared with other methods, this ultrasound and mechanical grinding synthesis is facile and efficient and enables production of BPs on a large scale. For characterization of BPs, SEM was carried out to examine the morphology of BPs. SEM images illustrated that BPs were successfully synthesized, and the typical sizes of BPs are about 100 to 150 nm. The size of particles was further investigated using DLS in the relatively narrow range around 133 nm. The result of SEM corresponded well with the measurement of particle size measurements based on DLS. Interestingly, previous studies demonstrated that BP with larger lateral size has higher cytotoxicity than small BP, while ultra-small BPs were even considered nontoxic up to the high concentration of 1000 μg/ml [29, 30]. Thus, for biomedical applications, the BP nanomaterials still need further study. In addition, Raman scattering revealed the presence of three prominent peaks at 361.5, 437.1, and 465.2 cm ⁻¹ that were associated with the out-of-plane phonon mode (A ¹ _g ) and two in-plane modes (B ² _g and A ² _g ) of BPs. These results were consistent with previous reports [31] in which showed that the BPs had been prepared successfully from bulk BP. XRD shows the phase purity of the prepared BPs. Broadening of the diffraction pattern indicates the nanometer size of individual crystallites.

To evaluate the stability and degradation rate of BPs, Wang and co-workers performed an experiment in which normalized absorption spectra of the BP nanosheets were dispersed in water and exposed to air. After 6 days, they found that the absorbance of the BP nanosheets at 450 nm decreased by 43% compared to the initial value, indicating that BP is easily degraded in the physiological environment [32]. Also, it is well-known that BP is sensitive to water and oxygen, but this shortcoming is considered a merit for biomedical applications. Because of these special characteristics compared with other biomaterials, BPs could potentially avoid material accumulation in human body and then reduce cytotoxicity caused by such material noumenon.

Since MSCs play key roles in bone formation, there is no doubt that transplanting MSCs in animal models of bone defects enhance bone regeneration and promotes functional recovery via BMSC acquisition [33]. Unfortunately, BMSC acquisition procedures are painful for the donor and frequently cause surgical site infection, and the number of harvested BMSCs is low [34]. Previous studies from our laboratory and other reports have shown that EMSCs could be isolated from several adult tissues, such as dental pulp and the nasal mucosa, without causing invasive injury. Moreover, EMSCs were easily induced into osteoblasts, rendering those cells as promising seed cells for bone tissue engineering. Therefore, EMSCs were used in this study. We attempted to obtain the maximum safety BP concentration for EMSCs. As shown in the results, we achieved the maximum safe concentration of BPs (less than 64 μg/ml). The concentrations of 2 and 4 μg/ml of BPs were chosen for further study to avoid any possible potential toxic. The Ki-67 assay was also used to quantify and evaluate EMSC proliferation in these samples after treating these cells with BPs (2 and 4 μg/ml) for 24 h. We did not observe any statistically significant suppression of EMSCs growth in the case of BPs. Meanwhile, our results indicate that during treatment with safe concentrations of BPs, promotion of EMSCs proliferation also occurred.

Some reports have shown that the concurrent binding of BP and calcium ions may benefit osteogenic differentiation, thereby leading to enhanced bone regeneration [35, 36]. To investigate these effects, in vitro EMSCs exposed to BPs were used in osteogenic differentiation experiments. Interestingly, the results of the ALP test and Alizarin Red S staining show that exposure to BPs could promote rather than compromise osteogenetic differentiation of EMSCs compared to the control group. Similar findings have been reported in which phosphorus-rich materials can stimulate mineralization and bone regeneration. Co-expression of osteogenesis-related genes, including ALP, OPN, OCN, COL1, and RUNX2, in differentiated EMSCs was detected at days 7 and 14 by RT-qPCR. Indeed, the expression levels of these osteogenic genes significantly increased in differentiated EMSCs treated with BPs, also providing confirmation of the osteogenic potential of the BPs. Similar results were reported in which BP could induce both the proliferation and osteogenic differentiation of human pre-osteoblast cells. Together these results indicate that the BPs were able to induce osteogenic differentiation of EMSCs.

It can be asked, “How do BPs promote osteogenetic differentiation of EMSCs?” It is well accepted that phosphorus can capture Ca ²⁺ in vivo to form calcium phosphate deposits that accelerate bone regeneration, while BP can be the resource of phosphorus ions [36]. Tong et al. believes that BP generate mild heat (40–42 °C), which causes up-regulation of heat shock protein (HSPs) expression and stimulates bone regeneration [37, 38]. Moreover, in this study, the upregulated activation of TG2 levels was also observed in BPs treatment groups. To the best of our knowledge, TG2 has important enzymatic and non-enzymatic functions at these locations in which it crosslinks various ECM proteins and modulates the interactions of cells with the ECM and soluble growth factors by non-covalent interactions with and regulation of integrins [39,40,41]. Obviously, the BPs can react strongly with oxygen and water and finally degrade to non-toxic phosphate in aqueous solutions, which is a crucial component of ATP. Nakano Y et al. reported that ATP can act as a significant phosphate (Pi) source for mineralization in MC3T3-E1 osteoblast cultures, indicating that ATP-hydrolyzing enzymes could induce mineral deposition [42]. They also found that TG2 could not only act as a phosphatase but could be involved in ATP hydrolysis in the osteoblast cultures thus further contributing to the elevation in Pi levels required for mineral deposition, which may be beneficial to EMSC energy metabolism. This process may be part of the contribution that BPs makes toward enhancement of EMSC osteogenic differentiation. On the other hand, thanks to TG2 bio-functions, a wide variety of ECM adhesion proteins, including LN, COL I, and FN, could maintain a stable state. Indeed, in the present study, we observed that ECM (FN, COL I, and LN) were significant higher in BP-treated EMSC groups. BPs provide a favorable ECM microenvironment for promoting greater osteogenic EMSC differentiation and proliferation.

Until now, no secretory signal sequences and hydrophobic or transmembrane domains have been clearly identified in TG2 because the protein is not localized in the endoplasmic reticulum (ER)/Golgi compartments [39, 43], and only few studies reported about these factors that control TG2’s secretion. Therefore, it remains unclear as to the exact mechanism of BP regulation of expression patterns of TG2 in the progress of EMSC osteogenic differentiation.

Conclusion

In the present study, BPs were successfully fabricated using mechanical grinding and continuous ultrasound method. At bio-safe concentrations, BPs activated TG2, and promoted the expression of ECM, which further promoted osteogenic differentiation of EMSCs. From these results, we can conclude that BPs would be suitable for incorporation into tissue-engineered scaffolds that utilize EMSCs to repair bone defects. Although our research highlights the great potential of BPs in nano-biomedicine, large-scale preclinical and clinical studies concerning its safety are needed before any clinical applications are established.

Доступность данных и материалов

The datasets generated during and/or analyzed during the study are available from the corresponding author on reasonable request.

Сокращения

BPs:

Black phosphorus nanoparticles

EMSCs:

Ectodermal mesenchymal stem cells

TG2:

Transglutaminase 2

2D:

Two-dimensional

ECM:

Extracellular matrix

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

NMP:

N -Methyl-2pyrrolidone

PBS:

Phosphate-buffered saline

DMEM/F12:

Dulbecco's modified Eagle's medium/nutrient mixture F12

FBS:

Fetal bovine serum

SD:

Sprague Dawley

SEM:

Scanning electron microscopy

XPS:

X-ray photoelectron spectroscopy

CCK-8:

Cell counting kit

OD:

Optical density

RT-qPCR:

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

GAPDH:

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

BSA:

Bovine serum albumin

TBS:

Tris-buffered saline

DAPI:

4′6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Dynamic light scattering