Совместная доставка дакарбазина и полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA) с использованием липидных наноформ для синергетической противоопухолевой эффективности против злокачественной меланомы

Аннотация

Злокачественная меланома - это очень агрессивный рак кожи, на который приходится 80% смертности, а общая средняя выживаемость пациентов с метастатической меланомой составляет всего 6–9 месяцев. Было продемонстрировано, что комбинированное лечение путем одновременного введения двух препаратов на одном наноносителе является элегантным и эффективным средством борьбы с раком. Здесь мы используем комбинированную терапию на основе дакарбазина (DBZ), одобренного FDA препарата для лечения меланомы и полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA), многообещающих противораковых агентов, загруженных в липидные нанообразования (RD-LNF), в качестве новой стратегии лечения злокачественной меланомы. Мы успешно инкапсулировали оба препарата в липидные наноформы и показали контролируемое высвобождение полезной нагрузки с течением времени. Мы продемонстрировали, что одновременная доставка DBZ и ATRA может эффективно снижать пролиферацию клеток в зависимости от концентрации. Комбинационные наночастицы значительно снижали способность клеток меланомы B16F10 к образованию колоний. Анализ проточным цитометром показал, что RD-LNF индуцировал большую долю клеток апоптоза со значительным ингибированием прогрессии клеточного цикла и миграции клеток. Эти результаты предполагают многообещающий потенциал RD-LNF в лечении злокачественной меланомы с высокой эффективностью.

Введение

Злокачественная меланома - одно из агрессивных злокачественных новообразований, встречающихся преимущественно на коже человека [1]. Меланома составляет 4% всех дерматологических раков, однако она ответственна за 80% смертности от рака кожи и вызывает растущую озабоченность в слаборазвитых и развивающихся странах [2, 3]. Меланома имеет высокую тенденцию к метастазированию в различные части тела, включая мозг, сердце и легкие, что делает ее одной из агрессивных форм злокачественных новообразований [4]. Если диагноз поставлен на ранней стадии, хирургическое удаление является одним из возможных вариантов лечения. Однако хирургическое вмешательство не гарантирует полного излечения от меланомы [5]. Кроме того, лучевая фаза роста этого злокачественного новообразования становится устойчивой к большинству других методов лечения, включая химиотерапию и лучевую терапию [6]. Точнее говоря, пептидные рецепторы сверхэкспрессируются на поверхности рака меланомы, что делает его перспективным. Было показано, что рецептор соматостатина подтипа 2 (SSTR2) сильно экспрессируется в клетках меланомы [7].

Дакарбазин (DBZ) или диметил-триазеноимидазолкарбоксамид (DTIC), алкилирующий ДНК агент, является единственным химиотерапевтическим препаратом первого ряда, одобренным Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) [8]. DBZ - сильный алкилирующий агент, который убивает раковые клетки, добавляя алкильные группы к ДНК или ядерным материалам раковых клеток [9]. Несмотря на свое мощное действие, DBZ страдает плохой растворимостью в воде и коротким периодом полужизни (41 мин) в кровотоке, что снижает его терапевтический эффект при лечении злокачественных новообразований меланомы [10]. Кроме того, наблюдалась неутешительная частота ответа от 10 до 25% при полном выздоровлении менее 5%, что указывает на ограничение терапии одним агентом [11, 12]. Следовательно, существует острая необходимость в разработке альтернативной стратегии повышения эффективности лечения DBZ.

Совместная доставка нескольких терапевтических агентов при однократном введении оказалась более эффективной по сравнению с доставкой отдельного терапевтического агента [13]. Совместная доставка терапевтических агентов в одной системе-носителе будет обеспечивать синергетическую активность, аналогичные фармакокинетические свойства и более высокую противораковую эффективность [14]. Полностью транс-ретиноевая кислота (ATRA) является многообещающим противоопухолевым средством, используемым при лечении нескольких видов рака [15]. ATRA проявляет свою терапевтическую эффективность за счет связывания с рецепторами ретиноевой кислоты в ядре раковых клеток, что приводит к ингибированию роста, пролиферации, дифференцировки и, в конечном итоге, гибели клеток [16]. В отличие от других химиотерапевтических агентов, ATRA не вызывал побочных эффектов, таких как кардиотоксичность или гипоплазия костного мозга. Сообщалось, что ATRA увеличивает противоопухолевую эффективность при использовании в сочетании с подходящим химиотерапевтическим агентом. Опять же, липофильный ATRA плохо растворяется в воде и имеет быстрый системный клиренс, что требует стабильной системы доставки [17].

Было показано, что системы доставки наночастиц улучшают терапевтическую эффективность инкапсулированных терапевтических средств, высвобождая их в ткани опухоли-мишени и избегая нецелевого эффекта в системном кровотоке, используя эффект усиленной проницаемости и удерживания (EPR) [18, 19]. Твердые липидные наночастицы (SLN) считаются альтернативой многим существующим носителям, включая липосомы или мицеллы, из-за таких характерных особенностей, как повышенная стабильность, контролируемое высвобождение лекарственного средства, высокая эффективность загрузки и простота приготовления / масштабирования [20] . Одним из важных аспектов СЛУ как носителя для доставки лекарств является профиль безопасности липидов, имеющих статус GRAS, хорошо переносимых и физиологических липидов [21]. Стабильное включение лекарств в липидное ядро улучшает растворимость в воде, улучшает фармакокинетический профиль и увеличивает физиологическую стабильность в большом круге кровообращения [22].

В этом исследовании мы рассматриваем многообещающую стратегию совместной доставки DBZ и ATRA с использованием липидных нанообразований для комбинированного лечения злокачественных новообразований меланомы. Ожидается, что DBZ загрузится в липидное ядро, в то время как ожидается, что ATRA будет частью структуры наночастиц. Мы изучили физико-химические свойства, клеточное поглощение и цитотоксичность комбинированных наночастиц in vitro. Кроме того, противоопухолевый эффект дополнительно оценивали с помощью анализа апоптоза, анализа клеточного цикла, образования колоний и анализа миграции клеток.

Заключение

В заключение, мы успешно создали дакарбазин и липидные наноформулы, содержащие полностью транс-ретиноевую кислоту. Наши результаты ясно демонстрируют, что RD-LNF ингибирует пролиферацию клеток меланомы, вызывает замечательный апоптоз и ингибирует прогрессию клеточного цикла и миграции клеток. Футуристическая работа будет сосредоточена на изучении противоопухолевой эффективности на клинически значимых моделях животных и разработке целевой терапии злокачественного новообразования меланомы. Это предварительное исследование, проведенное на клетках меланомы, и обширные исследования на различных клинически значимых моделях животных являются следующей частью нашей исследовательской работы.

Материалы и методы

Приготовление липидных наноформ, содержащих DBZ / ATRA

Липидные наночастицы, содержащие лекарственное средство, были приготовлены методом обработки ультразвуком. Вкратце, 10 мг DBZ и 10 мг ATRA растворяли в 2 мл раствора хлороформа, содержащего 50 мг яичного 1-α-фосфатидилхолина (PC) и 2 мг DSPE-метил (полиэтиленгликоль) -2000 (mPEG ₂₀₀₀ ). Органический растворитель сушили с использованием газообразного аргона в течение 20 мин. К высушенной смеси лекарственное средство + липид добавляли 80 мг тримиристина (Tm) и инкубировали при 65 ° C в течение 1 часа. К этой масляной смеси добавляли 5 мл 4% раствора полоксамера и немедленно обрабатывали зонд ультразвуком при 80 Вт в течение 6 мин. Полученную эмульсию охлаждали на льду в течение 30 мин. Наночастицы подвергали центробежной фильтровальной установке Amicon Ultra 0,5 (отсечка 3 кДа; Merck, Германия) при 12000 × g на 20 мин. Количество свободных DBZ и ATRA в фильтрате оценивали методом ВЭЖХ и рассчитывали эффективность загрузки и емкость загрузки. Для анализа лекарственных средств использовали систему ВЭЖХ Waters, состоящую из бинарного насоса Waters 1525, УФ-детектора Waters 2487, флуоресцентного детектора Waters 2475, нагревателя колонки 1500 и колонки Symmetry C18. Для ATRA подвижная фаза состояла из ацетонитрила и трифторуксусной кислоты в соотношении 90/10 об / об при скорости потока 1 мл / мин и определялась при 348 нм. Для DBZ использовали ацетонитрил и 0,05 М гидрофосфат натрия в соотношении 30/70 по объему, содержащий 0,5% TEA. Поддерживали pH подвижной фазы на уровне 3,7 и использовали скорость потока 1 мл / мин.

Анализ размера и морфологии частиц

Гранулометрический состав объединенных наночастиц оценивали с помощью Malvern Zetasizer Nano ZS90 с гелий-неоновым лазером (633 нм). Все образцы разбавляли дистиллированной водой, и эксперименты проводили при 24 ° C в трех экземплярах. Морфологию наночастиц оценивали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ; JEOL JEM200CX при 120 кВ). Разбавленные частицы окрашивали 2% -ной фосфорновольфрамовой кислотой, сушили и наблюдали под ТЕМ.

Высвобождение препаратов наноформ, содержащих лекарственные препараты, in vitro

Высвобождение инкапсулированных препаратов оценивали методом диализа. Два миллилитра нагруженных лекарством наночастиц, содержащих эквивалент 1 мг ATRA и 1 мг DBZ, герметично закрывали диализной мембраной (Spectra / Por, MWCO 3,5 кДа). Трубку для диализа помещали в 25 мл буфера для высвобождения и поддерживали скорость вращения 100 об / мин при 37 ° C. Через заданный интервал времени до 72 ч отбирали 1 мл образцов и заменяли свежим буфером равного количества. Количество DBZ и ATRA оценивали методом ВЭЖХ, как описано выше.

Анализ клеточной культуры и клеточного поглощения

Клетки меланомы кожи мыши (B16F10) были приобретены в China Infrastructure of Cell Line Resources (Пекин, Китай). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и 1% смеси антибиотиков. Среды регулярно меняли каждые 2 дня и культивировали после 90% слияния. Для анализа клеточного поглощения клетки B16F10 высевали в 6-луночный планшет на 24 ч инкубации. Наночастицы были загружены кумарином-6 в качестве флуоресцентного трекера. Удаляли старую среду, заменяли свежей средой, содержащей наночастицы липида кумарин-6, и инкубировали в течение 1–3 ч в обратном порядке. Клетки промывали и удаляли скребком для клеток. Клетки центрифугировали при 1200 об / мин в течение 5 мин и осадок клеток ресуспендировали в 1 мл холодного PBS. Образцы оценивали с помощью проточного цитометра AccuriTM C6 (BD Co., США).

Анализ цитотоксичности in vitro

Цитотоксический эффект свободных ATRA, DBZ, D-LNF и RD-LNF на клетку B16F10 оценивали с помощью анализа MTT. Ячейки (1 × 10 ⁴ ) высевали в каждую лунку 96-луночного планшета и инкубировали в течение 24 часов. Сначала клетки обрабатывали различными концентрациями свободного ATRA и DBZ и тестировали его противораковое действие на клетки меланомы. Затем клетки обрабатывали фиксированной концентрацией свободных ATRA, DBZ, D-LNF и RD-LNF, равной 25 мкг / мл и 50 мкг / мл соответственно. Клетки инкубировали в течение 24 ч, затем среду осторожно удаляли и дважды промывали PBS. В конце клетки обрабатывали 100 мкл 5 мг / мл раствора МТТ и инкубировали в течение 4 часов. Культуральную среду осторожно удаляли, добавляли 100 мкл изопропанола и инкубировали в течение 15 минут при встряхивании. Растворенные кристаллы формазана изучали при 570 нм с помощью ридера для микропланшетов. Необработанные клетки использовали в качестве контроля, и вычисления были сделаны на основе жизнеспособности контрольных клеток.

Анализ апоптоза - проточный цитометр

Эффект апоптоза свободных ATRA, DBZ, D-LNF и RD-LNF в клетках B16F10 оценивали после окрашивания PE аннексином V и набором для апоптоза на основе 7AAD. Клетки высевали в 12-луночный планшет при плотности клеток 2 × 10 ⁵ . клеток / лунку и инкубируют в течение 24 часов. Клетки обрабатывали 25 мкг / мл эквивалентами свободных композиций ATRA, DBZ, D-LNF и RD-LNF, и необработанные клетки считали контролем. После 24-часовой обработки клетки окрашивали в соответствии с протоколом производителя. Проточный цитометр AccuriTM C6 использовался для экспрессии PE и 7AAD, и в проточном цитометре было зарегистрировано не менее 10 000 событий. PE-положительные и 7AAD-отрицательные клетки были ранними апоптозными; PE-положительные и 7AAD-положительные клетки имели поздний апоптоз.

Анализ клеточного цикла - проточный цитометр

Клетки высевали в 12-луночный планшет при плотности клеток 2 × 10 ⁵ . клеток / лунку и инкубируют в течение 24 часов. Клетки обрабатывали 25 мкг / мл эквивалентами свободных композиций ATRA, DBZ, D-LNF и RD-LNF, и необработанные клетки считали контролем. Через 24 часа обработанные клетки промывали и собирали трипсинизацией и фиксировали 70% этанолом в течение 2 часов при 4 ° C. Затем клетки обрабатывали рибонуклеазой, чтобы избавиться от любых загрязнений РНК. Теперь клетки окрашивали иодидом пропидия (PI) в течение 30 мин при 37 ° C в инкубаторе. Флуоресценцию клеток, окрашенных PI, определяли с помощью проточного цитометра AccuriTM C6. Фаза клеточного цикла была разделена на фазы subG1, G1, S и G2 / M.

Анализ образования колоний

Клетки высевали в 12-луночные планшеты при плотности клеток 2 × 10 ⁵ . клеток / лунку и инкубируют в течение 24 часов. Клетки обрабатывали 25 мкг / мл эквивалентами свободных композиций ATRA, DBZ, D-LNF и RD-LNF. Обработанные клетки были обработаны трипсином, промыты и подсчитаны с использованием счетчика клеток. Затем клетки высевали в 6-луночный планшет при плотности 1500 клеток / лунку. Затем клетки инкубировали в условиях окружающей среды при 37 ° C в течение 12 дней, пока колонии не стали видны. Клетки промывали PBS и фиксировали метанолом, уксусной кислотой и водой (1:1:8) в течение 10 мин с последующим окрашиванием 0,1% раствором кристаллического фиолетового в течение 45 мин. Затем окрашенные клетки наблюдали под световым микроскопом.

Анализ миграции клеток

Для этого анализа использовали 12-луночную трансвеллентную камеру с размером пор 8 мкм. Чтобы начать исследование, 5 × 10 ⁴ клеток / лунку засевали в верхнюю камеру. Верхняя среда не содержит FBS, а среда нижней камеры состоит из 10% FBS. Через 24 ч количество клеток, мигрировавших к нижней поверхности мембраны, фиксировали и окрашивали 0,5% -ным красителем кристаллического фиолетового. Количество клеток подсчитывали в пяти полях, которые случайным образом выбирали под световым микроскопом; было записано и проанализировано среднее количество клеток.

Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение и выполняются в трех экземплярах, если иное не указано отдельно. Две группы сравнивались с использованием непарных t тесты, в то время как сравнение более двух групп проводилось с использованием одностороннего ANOVA с тестом множественного сравнения Турции. Статистические данные были выполнены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism и разницы в p <0,05 считалось значимым.

Результаты и обсуждение

Приготовление и характеристика липидных наноформ, содержащих DBZ / ATRA

Лечение меланомы остается серьезной проблемой, и стандартные варианты лечения, включая химиотерапию, лучевую терапию или хирургическую резекцию, будут эффективны только в отношении солидных опухолей с плохим прогнозом. FDA одобрило такие препараты, как паклитаксел или его комбинация, но им не удалось улучшить общее влияние на выживаемость пациентов и излечение от рака. Дакарбазин (DBZ) - химиотерапевтический препарат первой линии, одобренный FDA; однако DBZ страдает плохими физико-химическими свойствами и приводит к разочаровывающим результатам от 10 до 25%. Чтобы справиться с этими проблемами, мы разработали новую терапевтическую стратегию комбинации с ATRA и DBZ в липидных наноформациях (рис. 1). Мы предположили, что комбинация двух терапевтических компонентов повысит противоопухолевую эффективность при злокачественных новообразованиях меланомы. Стоит отметить, что ATRA, хотя и проявляет противораковые свойства, не оказывает какого-либо неблагоприятного воздействия на системную среду [23]. Поскольку DBZ является гидрофобным по своей природе, мы разработали липидные нанообразования, которые могут стабильно включать гидрофобные лекарственные средства в липидное ядро, а ATRA будет загружаться в качестве структурного компонента наночастиц. Липидные наночастицы, несущие терапевтические компоненты, помогут проникнуть в очень глубокую опухоль тела. Эффективность загрузки DBZ и ATRA составила 91,2 ± 1,25% и 95,8 ± 1,14% соответственно. Нагрузочная способность DBZ и ATRA в RD-LNF составляла 7,07 ± 0,65% по массе и 7,48 ± 1,05% по массе соответственно. Размер частиц D-LNF составлял 121,5 ± 1,65 нм с индексом полидисперсности (PDI) 0,134 и дзета-потенциалом -23,5 ± 0,85 мВ. Размер частиц RD-LNF составлял 138,2 ± 1,28 нм с PDI 0,159 и дзета-потенциалом -25,4 ± 0,58 мВ. Увеличение общего размера частиц в основном объясняется структурной нагрузкой ATRA; однако конечный размер RD-LNF составлял менее 150 нм, что позволяло преимущественно накапливать злокачественные опухоли меланомы из-за эффекта ЭПР. Кроме того, присутствие гидрофильного PEG предотвращает агрегацию частиц и снижает его захват ретикулоэндотелиальной системой (RES) и, таким образом, улучшает его системные характеристики в организме. Поверхностный заряд около -25 мВ обеспечивает отличную стабильность при хранении. Морфологию частиц исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) (рис. 2). Как видно, и D-LNF, и RD-LNF имеют идеально сферические размеры и равномерно распределены в медной сетке. Разница в размере между D-LNF и RD-LNF соответствовала наблюдениям DLS. Отсутствие обломков частиц, мелких частиц и агрегации свидетельствует об успехе процесса приготовления.

Анализ стабильности и высвобождение лекарств in vitro из D-LNF и RD-LNF

RD-LNF показал превосходную стабильность как при pH 7,4 (PBS), так и в сыворотке (10% FBS) (фиг. 3a). Размер частиц не показал какого-либо значительного увеличения в обоих условиях в течение периода исследования, что указывает на стабильность наночастиц. Способность высвобождать лекарство своевременно определяет эффективность систем наночастиц, содержащих лекарство. Мы выполнили кинетику высвобождения DBZ и ATRA из D-LNF и RD-LNF в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4). Как показано на фиг. 3b, ни в одной из систем из двух наночастиц не наблюдалось ни всплеска высвобождения, ни поэтапного высвобождения лекарственного средства, что указывает на стабильную загрузку в ядре наночастиц, а не на поверхности наночастиц. Не наблюдалось значительной разницы в высвобождении DBZ из D-LNF и RD-LNF, что указывает на то, что присутствие ATRA не замедляет и не изменяет характер высвобождения лекарственного средства. Небольшая задержка высвобождения лекарственного средства DBZ из RD-LNF может быть объяснена увеличением длины пути, приписываемым ATRA в липидной структуре. Интересно отметить, что ATRA выпускается значительно медленнее, чем DBZ в несущей системе RD-LNF. Значительные различия начали проявляться через 24–72 часа, главным образом, из-за чрезвычайно гидрофобной природы ATRA и того, что он является частью структурного компонента. В целом, отсутствие импульсного высвобождения и контролируемого высвобождения терапевтических компонентов принесет пользу лечению рака меланомы.

Использование клеток in vitro

Более высокое или повышенное клеточное поглощение наночастицы определяет терапевтическую эффективность раковых клеток. Мы выполнили клеточный захват RD-LNF в раковых клетках B16F10, и кумарин-6 использовали в качестве флуоресцентного трекера. Как показано на рис. 4, заметная интернализация наночастиц наблюдалась через 1 час инкубации наночастиц, и поглощение постоянно увеличивалось до 3 часов. Замечательное поглощение липидных наноформулировок согласуется с более высоким клеточным поглощением системы-носителя на основе липидов. Было высказано предположение, что пассивная диффузия и механизм, основанный на эндоцитозе, могут быть ответственны за более высокое клеточное поглощение. Наночастицы после эндоцитоза достигнут лизосомы, где инкапсулированные лекарства высвобождаются и проявляют свое фармакологическое действие.

Анализ цитотоксичности in vitro

Анализ МТТ проводили на клетках B16F10 после обработки соответствующими составами для оценки противоракового действия отдельных терапевтических агентов (фиг. 5a). Сначала оценивалась цитотоксичность отдельных свободных DBZ и ATRA. DBZ проявлял зависящий от концентрации цитотоксический эффект в раковых клетках меланомы, тогда как ATRA проявлял значительно более высокий цитотоксический эффект в клетках B16F10. При 100 мкг / мл DBZ демонстрировал ~ 45% жизнеспособности клеток по сравнению с ~ 22% жизнеспособности клеток для ATRA, что указывает на превосходную терапевтическую эффективность ATRA. Чтобы доказать, что совместная доставка DBZ и ATRA может потенциально ингибировать прогрессирование рака, липидные нанообразования, нагруженные DBZ + ATRA (RD-LNF), обрабатывали клетки меланомы. Нагруженные DBZ липидные нанообразования (D-LNF), содержащие одно лекарственное средство, использовали в качестве контрольной группы, чтобы подчеркнуть синергетическую эффективность ATRA (фиг. 5b). Как и ожидалось, при фиксированной концентрации 25 мкг / мл ATRA показал немного более низкую жизнеспособность клеток по сравнению с таковой DBZ, в то время как D-LNF на основе наночастиц не улучшил противораковый эффект DBZ и оставался далеко не эффективным. Как и ожидалось, RD-LNF показал значительно более низкую жизнеспособность клеток и более высокий противораковый эффект по сравнению с D-LNF, что указывает на очевидный синергетический терапевтический эффект двойных компонентов в отношении гибели раковых клеток меланомы. RD-LNF показал значительно более высокий противораковый эффект по сравнению с другими группами лечения. Можно было ожидать, что медленное и продолжительное высвобождение DBZ наряду с медленным высвобождением ATRA из системы наноносителей может способствовать синергетическому терапевтическому эффекту. В этом исследовании дакарбазин (DBZ) был основным химиотерапевтическим препаратом, а ATRA использовался в качестве структурного компонента липидных наночастиц, поэтому не создавал отдельную группу для R-LNF. Мы изучили противоопухолевый эффект голых ATRA и DBZ на раковые клетки. Кроме того, многие опубликованные отчеты являются доказательством противоопухолевого эффекта ATRA; поэтому мы использовали ATRA в качестве структурного компонента, который также может синергетически улучшить противораковую эффективность инкапсулированных терапевтических средств.

Анализ образования колоний

Анализ образования колоний выполняли для оценки возможности туморогенеза клеток меланомы. Как показано, свободные DBZ и ATRA имеют ограниченную роль в ингибировании образования колоний, и аналогичным образом D-LNF был неэффективен в контроле образования колоний (фиг. 6). Как и ожидалось, комбинация DBZ + ATRA приводила к значительному усилению ингибирования образования колоний по сравнению с ингибированием отдельных свободных лекарств или наночастиц, нагруженных одним лекарством. Анализ состава колоний еще раз подтверждает превосходную противораковую эффективность RD-LNF по сравнению с бесплатными лекарствами.

Анализ апоптоза in vitro и анализ клеточного цикла

Индукцию апоптоза клеток B16F10 после обработки D-LNF и RD-LNF изучали с использованием проточного цитометра после окрашивания клеток смесью аннексин V-FITC / PI (фиг. 7a). Как показано, ATRA и DBZ вызывают только 10–12% апоптоза раковых клеток, и большая часть клеток остается интактной. Незначительное увеличение числа клеток с ранним апоптозом наблюдалось после обработки D-LNF, что может указывать на эффект носителя для доставки. Важно отметить, что RD-LNF индуцировал большую долю клеток апоптоза с большей долей клеток в позднем апоптозе и раннем апоптозе, что указывает на превосходную противораковую эффективность комбинационных наночастиц. RD-LNF показал, что клетки позднего апоптоза увеличились на 21,5%, в то время как клетки раннего апоптоза увеличились до 18,3%, а доля жизнеспособных клеток снизилась с 95 до 52% соответственно, предполагая, что комбинация DBZ + ATRA способствовала апоптозу раковых клеток и могла подавляют пролиферативное ингибирование клеток меланомы B16F10. Эффект апоптоза составов был дополнительно подтвержден анализом клеточного цикла. Как показано, DBZ и ATRA продемонстрировали небольшое увеличение популяции суб-G0, в то время как D-LNF продемонстрировали относительно более высокую популяцию суб-G0 по сравнению с отдельными свободными лекарствами (рис. 7b). Примечательно, что заметное увеличение популяции суб-G0 наблюдалось для клеток меланомы, обработанных RD-LNF, что указывает на выраженный апоптоз раковых клеток. Хорошо известно, что DBZ может увеличивать уровни экспрессии p21, каспазы-3 и расщепленного PARP и тем самым способствует апоптозу клеток за счет стабилизации p53. Индукция р53 будет тормозить развитие клеточного цикла [24, 25]. Ожидается, что комбинация DBZ + ATRA будет усиливать механизм апоптоза и останавливать развитие клеточного цикла раковых клеток и проявлять противораковую эффективность.

Влияние комбинационных наночастиц на миграцию клеток

Миграцию клеток анализировали через мембрану трансвелл и наблюдали за мигрирующими клетками по окрашиванию кристаллическим фиолетовым (фиг. 8). Через 24 часа контрольные клетки почти достигли полной миграции раковых клеток. ATRA, по-видимому, относительно лучше ингибирует миграцию клеток, чем клетки, обработанные DBZ. D-LNF также показал заметный ингибирующий эффект на миграцию клеток; однако наиболее заметный эффект миграции клеток наблюдался в клетках меланомы B10F16, обработанных RD-LNF. Как видно, наблюдалось многократное уменьшение миграции клеток по сравнению с необработанными контрольными клетками. Эти результаты ясно демонстрируют, что RD-LNF потенциально снижает аберрантную пролиферацию злокачественных клеток и эффективно подавляет миграцию клеток.

Доступность данных и материалов

Не применимо

Сокращения

DBZ:: Дакарбазин
ATRA:: Полностью транс-ретиноевая кислота
D-LNF:: Наноформулы липидов, содержащие DBZ
RD-LNF:: Наноформы липидов, содержащие ATRA / DBZ
SLN:: Твердые липидные наночастицы

Высокопроизводительные двухканальные HEMT AlGaN с улучшенной плотностью тока стока и высоким напряжением пробоя Электроды без связующего и их применение в литий-ионных аккумуляторах

Наноматериалы