Контроль транслокации ДНК через твердотельные нанопоры

Введение

В последние десятилетия был достигнут большой прогресс в применении секвенирования ДНК для чтения последовательностей оснований в геноме [1, 2]. Для разработки персонализированных лекарств исследователи искали более быстрый и дешевый метод секвенирования ДНК, при котором целевые лекарства и медицинские методы лечения можно было бы применять к конкретному человеку [3, 4]. Поскольку при обнаружении ДНК использовалась технология нанопор [5], она считалась эффективным методом секвенирования следующего поколения [6, 7]. Технология нанопор - многообещающая платформа для идентификации высокочувствительных детекторов одиночных молекул ДНК [5] или РНК [8]. В базовой схеме детектирования электрохимическая камера разделена на два резервуара (цис- и транс-отсек) тонкой мембраной с нанопорой [9], которая соединяет проводящий раствор и аналит в электрохимической камере. Подавая напряжение на мембрану, ионы электролита протекают через твердотельную нанопору и образуют ток поры, который измеряется с помощью патч-зажима со связанной сверхчувствительной электроникой. Когда молекула или молекулярный комплекс проходит через нанопору, аналит может исключить некоторые ионы из объема, определяемого нанопорой, что можно обнаружить, отслеживая кратковременные изменения тока. Информация о молекулах может быть получена как по времени пребывания (время пребывания) в нанопоре, так и по сигнатуре амплитуды тока. Пространственное разрешение секвенирования нанопор определяется размерами нанопоры, что позволяет предположить, что он может использоваться в качестве единственного датчика для небольших молекулярных объектов, что приводит к обнаруживаемой сигнатуре тока. Более того, датчики с нанопорами легко интегрируются в портативные устройства типа «лаборатория на кристалле» и уменьшаются в размерах [10].

Значительный прогресс был достигнут в секвенировании ДНК с помощью нанопор, таких как твердотельные нанопоры [2, 11] и белковые нанопоры [2, 7]. Выполнено секвенирование ДНК по нанопорам белков [7]. Однако системы белковых нанопор имеют ограничения для изучения биологических молекул. Твердотельные нанопоры имеют меньше ограничений по сравнению с биологическими / белковыми нанопорами. Эти трудности могут быть преодолены с помощью твердотельных нанопор. По сравнению с белковыми нанопорами, они работают в более широком диапазоне температур, напряжений и условий растворителя и могут быть настроены по диаметру с субнанометровой точностью. Они перспективны для применения в технологиях следующего поколения для секвенирования ДНК.

Для сенсоров ДНК создано множество твердотельных нанопор из различных материалов и структур. Однако секвенирование ДНК не достигается твердотельными нанопорами. Для твердотельных датчиков с нанопорами необходимо преодолеть два основных препятствия, касающихся их пространственного и временного разрешения, перед их коммерческим применением для секвенирования ДНК. Трудность в отношении пространственного разрешения состоит в том, что твердотельные нанопоры могут различать крошечные промежутки между двумя соседними нуклеотидами, чтобы достичь разрешения с одним основанием. Препятствие для временного разрешения состоит в том, что транслокация ДНК происходит слишком быстро под действием электрической силы, что приводит к получению очень небольшого числа достоверных точек данных с помощью существующих зажимов для заплат или других систем сбора сигналов. В этом мини-обзоре представлен обзор различных методов улучшения пространственного и временного разрешения обнаружения твердотельных нанопор ДНК. В этом мини-обзоре больше внимания уделяется методам замедления транслокации ДНК через твердотельные нанопоры.

Пространственное разрешение

В 2001 году о твердотельных нанопорах нитрида кремния впервые сообщили Li et al. [12]. Для обнаружения молекул ДНК были продемонстрированы различные твердотельные нанопоры, такие как оксид кремния [13], кремний [14], Al ₂ О ₃ [15], и HfO ₂ [16]. Хотя твердотельные нанопоры в конечном итоге могут быть устойчивыми к химическим и механическим условиям, у них есть некоторые ограничения, такие как низкое пространственное разрешение. Благодаря толщине материалов десятки оснований могут проходить через твердотельные нанопоры одновременно. В настоящее время самая тонкая нанопора нитрида кремния составляет 3 нм, что все еще не позволяет различить четыре типа оснований [17].

Интересно, что толщина одного слоя двумерного (2D) материала составляет примерно 3,0–11,0 Å, что сопоставимо с расстоянием между двумя соседними нуклеотидами вдоль оцДНК (3,2–5,2 Å) [18]. Двумерные мембраны, такие как графен (3,4 Å [19]), MoS ₂ (6,5 Å [18]), WS ₂ (7 Å [20]) и h-BN (11 Å [21]), как было продемонстрировано, обнаруживают транслокации ДНК [21,22,23] из-за их высокого отношения сигнал / шум и пространственного разрешения. Судя по их пространственному разрешению, эти материалы могут быть использованы для обнаружения ДНК. Кроме того, воспроизводимые методы роста и крупномасштабные процедуры переноса позволяют создавать субнанометровые поры в двумерных мембранах в больших масштабах.

Графен представляет собой атомарно тонкий слой атомов углерода, образующий двумерную сотовую решетку [24]. Исследователи продемонстрировали, что одиночные молекулы ДНК в растворе могут быть обнаружены и охарактеризованы с помощью нанопор графена [22, 25]. Однако существуют сильные гидрофобные взаимодействия между нуклеотидами ДНК и графеном, и ДНК будет сильно закупориваться и прилипать к нанопорам графена, что заметно влияет на скорость транслокации [26]. Модифицированный гидрофильными группами [26] или покрытый, гидрофильный материал [25] на графене может улучшить гидрофильность графена и избежать прилипания ДНК к его поверхности. К сожалению, либо модификация гидрофильными группами, либо покрытие гидрофильными материалами приведет к увеличению толщины суспендированной пленки, что приведет к увеличению толщины нанопор, что снизит пространственное разрешение графена.

Слоистый дихалькогенид переходного металла - еще один 2D-материал, который включает MoS ₂ [18, 27] и WS ₂ [20]. Высокое отношение сигнал / шум (SNR> 10) и пятикратное усиление сигнала ионного тока были обнаружены при транслокации ДНК через MoS ₂ нанопористая мембрана [18]. Между тем, MoS ₂ является гидрофильным, поэтому не требуется специальной обработки поверхности, чтобы избежать гидрофобного взаимодействия между ДНК и ее поверхностью. Другой материал, WS ₂ имеет прямую запрещенную зону 2,1 эВ [28], а его излучение фотолюминесценции (ФЛ) сильнее, чем у хорошо изученного MoS ₂ [29]. Danda et al. [20] изготовил WS ₂ нанопоры и продемонстрировали достижение атомно-контролируемого размера нанопор с помощью коротких световых импульсов, которые могут иметь положительное влияние на твердотельные нанопоры для обнаружения ДНК.

Кроме того, Лю и др. [21] сообщили о первом эксперименте по транслокации ДНК через нанопоры h-BN. Подобно графену, h-BN имеет плохую гидрофильность, что заставляет ДНК блокировать нанопоры. Впоследствии Чжоу и др. [23] успешно улучшили гидрофильность нанопор h-BN, используя преимущества антиокисления и целостности материала h-BN после обработки УФ-озоном. Изолирующая природа h-BN может проявлять более замечательную долговечность и изолирующие свойства в растворе с высокой ионной силой, чем в графене. Это конкурентный кандидат для достижения разрешения с одной базой на сверхтонких нанопористых структурах.

Использование двумерных материалов может потенциально увеличить пространственное разрешение устройства для достижения разрешения одного нуклеотида. Хотя сообщалось об экспериментах по обнаружению ДНК для нескольких двумерных материалов, никто не сообщил о достижении секвенирования твердотельной ДНК с нанопорами. Временное разрешение секвенирования нанопор также является проблемой.

Временное разрешение

Скорость транслокации ДНК через твердотельные нанопоры очень высока, до 0,01–1 мкс / основание [30], что приводит к очень мало эффективных данных, собираемых коммерческими зажимами для заплат. Таким образом, невозможно различить каждую базу на основе сигнала тока блокады. Скорость транслокации ДНК в твердотельных нанопорах 2D-материалов, таких как графен, MoS ₂ , WS ₂ , и h-BN, показаны на рис. 1. В идеале скорость транслокации ДНК в нанопоре должна составлять 1–100 п.н. / мс, чтобы обеспечить удовлетворительную регистрацию сигнала от каждого нуклеотида [32].

Скорость транслокации ДНК 2D твердотельной нанопоры [18, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 31]. Пунктирная красная линия указывает на скорость транслокации ДНК 100 п.н. / мс

На этом фоне замедление скорости транслокации ДНК является важной задачей, которую преследуют многие исследователи. Были разработаны различные методы замедления транслокации ДНК для улучшения временного разрешения обнаружения нанопор в твердом состоянии. Обычный метод заключается в изменении влияния экспериментальных факторов, таких как температура [33], вязкость электролита [27], управляющее напряжение [34], концентрация ионов [35] и плотность поверхностного заряда нанопоры [36], путем изменения ДНК перемещение через него. Вануну и др. [33] сосредоточились на замедлении транслокации дцДНК через твердотельные нанопоры за счет изменения температуры, напряжения и длины ДНК. Более того, Feng et al. [27] показали, что систему градиента вязкости, основанную на ионных жидкостях при комнатной температуре, можно использовать для управления динамикой транслокации ДНК через MoS ₂ нанопор и продемонстрировали, что высокая вязкость ионных жидкостей при комнатной температуре обеспечивает оптимальную скорость однонуклеотидной транслокации 373 п.н. / мс.

Хотя многие подходы могут снизить скорость транслокации ДНК и облегчить обнаружение ионного тока, они по-прежнему не удовлетворяют требованиям для секвенирования ДНК. Следовательно, необходима разработка более радикальных методов контроля прохождения ДНК через нанопоры. Здесь мы обсуждаем методы контроля структуры нанопор и количественного движения ДНК для улучшения временного разрешения.

Система двух нанопор

Исследователи использовали системы с двумя нанопорами для управления транслокациями молекул ДНК, которые могут контролируемым образом обнаруживать одну и ту же молекулу много раз. Две уложенные друг на друга нанопоры, разделенные полостью микрометрового размера [37] (рис. 2а), могут задерживать молекулы ДНК на определенное время и контролируемым образом высвобождать их. Динамику молекул ДНК можно вывести из сигналов двух пор с помощью корреляционного анализа, который обеспечивает прямое электрическое доказательство транслокации. Кроме того, из-за энтропийных барьеров двухслойной системы нанопор броуновское движение молекул ДНК может быть ограничено, что может повысить точность секвенирования ДНК с помощью нанопор. По сравнению с методами измерения одной молекулы, молекулы ДНК можно измерять несколько раз в двухслойных системах нанопор путем последовательного расположения нескольких пор вместо того, чтобы пропускать их вперед и назад через одну пору [39].

а Схема двухслойной системы нанопор, используемой для обнаружения нанопор ДНК [37]. б Схема системы двойных нанопор, используемой для обнаружения нанопор ДНК [38]

Системы с двойными нанопорами представляют собой еще один метод контроля молекулярного транспорта и эффективного связывания молекул между двумя порами; они представляют собой механистический подход без меток для манипуляции с ДНК [40]. В системе с двумя нанопорами есть две независимо адресуемых и смежных нанопоры внутри одной твердотельной мембраны. Во время прохождения молекулы ДНК через одну из нанопор, управляемую электрофоретикой, одна молекула ДНК может быть захвачена обеими порами, что приводит к «перетягиванию каната» между двумя нанопорами [38] (рис. 2b). Таким образом, силы прилагаются к разным концам молекулы ДНК, которая замедляет и даже полностью останавливает ее движение. Система двойных нанопор открывает новый путь к механическому захвату ДНК в твердотельных нанопорах, и это многообещающий метод измерения широкого диапазона биомолекул с преимуществами отсутствия меток и высокого уровня сигнала. шумоизоляция и невысокая стоимость. Он может эффективно удерживать и улавливать молекулы ДНК для замедления транслокации ДНК, а также может использоваться для изучения физики этого наноразмерного перетягивания каната с ДНК [41].

Оптическая ловушка, нанопора

Оптические ловушки с нанопорами позволяют оптическому пинцету задерживать частицы размером менее десятков нанометров. Это делает возможным оптический захват белков [42], фрагментов ДНК [43] и других биомолекул [44], а также небольших вирусов [45]. Основная теория нанопор оптической ловушки - это самоиндуцированная оптическая ловушка с обратным действием [46]. Лазерный луч, сфокусированный на области массива нанопор, будет формировать локальное световое поле высокой плотности мощности на краю металлического слоя в отверстии. Когда частица перемещается между локальным световым полем, это может вызвать большое изменение в локальном оптическом пропускании, что, в свою очередь, создаст на частицу большую оптическую и диэлектрическую силу. Структура с двойными наноотверстиями используется для устранения узкого места захваченных частиц по размеру. Мухаммад и др. [47] продемонстрировали потенциальную возможность использования нанопор оптических ловушек с 20-нм диоксидом кремния и наночастицами Au. Двойное наноотверстие в форме гантели было врезано в пленку Au, а нанопора диаметром 25 нм была просверлена во взвешенном Si _x N _y мембрана в середине двойного наноотверстия, как показано на рис. 3а. Электрофоретическая сила, движущая наночастицы через нанопору, при прохождении через край отверстия, плазмонная сила самоиндуцированного обратного действия, существующая между кончиками двойного нанотверстия, противодействовала электрофоретической силе, снижая скорость наночастиц. Результаты показали, что оптический захват увеличивает время электрофоретической транслокации на четыре порядка. Kim et al. [43] реализовали оптический захват плазмидной ДНК и лямбда-ДНК с помощью наноплазмонных структур одиночных нанопор. У технологии есть потенциальные приложения для обнаружения ДНК, и для реализации параллельного обнаружения можно настроить несколько локальных световых полей. Однако высокочастотные колебания ионного тока могут повлиять на текущие результаты обнаружения ДНК. Это может быть связано с конкуренцией между электрофоретическими и самоиндуцированными силами обратного действия, заставляющими наночастицы всплывать вверх и вниз через устье нанопоры.

а Схема микросхемы нанопор с оптической ловушкой [47]. б Схема системы самоиндукции обратного действия

Оптический пинцет

Оптический пинцет может использоваться для управления перемещением молекул через нанопоры и широко используется в последние годы. В 2006 году Keyser et al. [48] ​​впервые продемонстрировали молекулярное перетягивание каната между электрофоретическими и механическими силами, применив оптический пинцет для контроля транслокации ДНК через SiN _x нанопоры. Эта система действует как простая пружина Гука, и сила натяжения валика может быть рассчитана на основе закона Гука: F _от =-k _{ловушка} Я , где F _от оптическая сила, k _{ловушка} - жесткость ловушки в направлении смещения, а Z - линейная деформация валика [48]. Метод оптического пинцета, который захватывает связанный с ДНК шарик из полистирола на пересечении сфокусированного лазерного луча, может манипулировать связанной с ДНК шариком из полистирола в трех измерениях и имеет пиконьютонный диапазон чувствительности к силе, как показано на рис. 4a. . Чтобы уловить перемещающуюся ДНК внутри нанопоры, сила натяжения была настроена так, чтобы уравновесить силу электрического поля ( F _эль ) на ДНК. Следовательно, натяжение можно использовать как для уменьшения скорости транслокации ДНК, так и для вытягивания молекулы ДНК из нанопоры [52]. Эта система позволяет одновременно проводить пространственный отбор проб и измерять силу с высоким разрешением нуклеиновых кислот и белков, что позволило добиться значительного прогресса в секвенировании ДНК. Однако техника оптического пинцета страдает несколькими фундаментальными трудностями. Во-первых, трудно масштабировать до большого количества нанопор. Во-вторых, нагрев, вызываемый лазером в оптическом пинцете, сильно влияет на ионный ток через нанопору и уровень шума, поэтому оптически захваченный шарик должен находиться на расстоянии нескольких микрометров от нанопоры [53].

а Схема оптического пинцета, используемого для обнаружения нанопор ДНК [48]. Когда система оптического пинцета находится в равновесии, оптическая сила (F _ot ) равна силе электрического поля (F _el ). б Схема магнитного пинцета, используемого для обнаружения нанопор ДНК [49]. Когда система магнитного пинцета находится в равновесии, магнитная сила (F _Mt ) равна силе электрического поля (F _el ). c Схема АСМ, используемого для обнаружения нанопор ДНК [50]. г Схема TFFS, используемого для обнаружения нанопор ДНК [51]

Магнитный пинцет

Магнитный пинцет обеспечивает еще один способ управления транслокацией ДНК с помощью силы натяжения, и было продемонстрировано, что метод магнитного пинцета эффективен в замедлении транслокации ДНК [49]. В этой системе, как показано на рис. 4b, молекулы ДНК могут быть прикреплены к магнитной бусине микрометрового размера с помощью сильного взаимодействия золото-тиол [54] или стрептавидин-биотин [49]. Затем свободный конец ДНК может быть захвачен в нанопоре приложенным электрическим полем. Впоследствии два магнита с небольшим зазором можно использовать для создания градиента магнитного поля. Этот метод может сбалансировать электрическую силу на захваченную ДНК, чтобы снизить скорость транслокации и даже обратный электрофорез. По сравнению с оптическим пинцетом, магнитный пинцет является многообещающим кандидатом для спектроскопии массивно параллельных сил. В этой системе можно одновременно контролировать сотни гранул и, следовательно, молекул ДНК в пределах сотен нанопор, что легко масштабируется до множества адресуемых нанопор. Это может на порядки ускорить аналитический процесс. Однако по сравнению с оптическим пинцетом одним очевидным недостатком подхода с использованием магнитного пинцета является отсутствие трехмерного управления молекулами [55].

Датчик силы

Хотя значительный прогресс был достигнут в управлении скоростью транслокации ДНК с помощью оптического и магнитного пинцетов, у методов захвата шариков есть проблема с броуновским движением, что затрудняет управление движением шарика с разрешением менее 10 нм [51] . Чтобы преодолеть это, AFM был использован для контроля скорости транслокации ДНК [50], и он также может одновременно измерять силу и ток блокады. В исследовании с использованием этой системы, как показано на рис. 4c, ДНК была привязана к кончику зонда AFM, а затем зажата в держателе зонда. Управляя движением зонда, можно контролировать транслокацию ДНК, чтобы уменьшить ее скорость и даже проводить обратный электрофорез. Кроме того, отводя наконечник на высоту над поверхностью, соответствующую длине молекулы, измерения можно повторить. С помощью АСМ обнаружение ДНК продвинулось на практике и в теории, потому что разрешение обнаружения может быть значительно улучшено за счет комбинированных сигналов тока блокады и измерений силы АСМ [56]. Однако все еще существует препятствие в применении методов нанопор для обнаружения ДНК, а именно периодическое возникновение регулярных флуктуаций силы (и тока) каждые 0,35–0,72 нм, когда молекула ДНК скользит относительно без трения через нанопора. Эти колебания объясняются тем, что отдельные нуклеотиды перемещаются через нанопору в виде турникетного движения [50].

Исследования показали, что камертон, который можно использовать в качестве датчика обнаружения силы, может контролировать прохождение ДНК через нанопору с субнанометровой скоростью [51, 57]. В исследовании с использованием этого интегрированного устройства, как показано на рис. 4d, молекула ДНК была прикреплена к наконечнику зонда, который был приклеен к одному зубцу камертона. Для удержания камертона использовалась система нанопозиционирования с субнанометровой точностью [51]. Положение наконечника зонда может определяться датчиком силы обратной связи на основе камертона и контролироваться путем манипулирования системой нанометрового позиционирования. Эта скорость движения в 10 раз медленнее, чем у ДНК, обрабатываемой оптическим пинцетом, и в 1000 раз медленнее, чем у ДНК, свободно проходящей через твердотельные нанопоры [57]. По сравнению с обычным АСМ камертон может обеспечить более быстрое сканирование и обладать высокой чувствительностью к усилию при погружении в жидкость. За счет объединения TFFS с нанопорой можно одновременно измерять ионный ток через нанопору, положение наконечника и амплитуду колебаний наконечника во время прохождения молекулы ДНК через нанопору.

Si Probe

Все вышеперечисленные методы, а именно магнитный пинцет, оптический пинцет, AFM и TFFS, должны сканировать положение нанопор. Они должны расположить нанопору в пределах эффективной длины ДНК, чтобы убедиться, что ДНК может пройти через нанопору. Адресация нанопор является важной частью этих методов, но с ней трудно [32] связать ДНК с большой поверхностью кремниевого зонда (рис. 5), большей, чем площадь чипа, что означало, что они могли легко вставить иммобилизованную ДНК в нанопора без сканирования расположения нанопоры в мембране. Была продемонстрирована возможность использования Si-зонда с иммобилизованной ДНК и контроллера положения для управления перемещением ДНК в нанопоры и из них. Сложность этого метода заключается в том, что Si-зонд погружается в раствор и соединяется с ДНК посредством пептидного связывания. Плотность ДНК на поверхности зонда трудно контролировать, поэтому вероятно одновременное прохождение нескольких ДНК через нанопору, что повлияет на ток обнаружения.

Схема системы зондов Si с иммобилизованным ДНК, используемой для обнаружения нанопор ДНК [32]

Оптический пинцет, магнитный пинцет, атомно-силовая микроскопия (AFM) и датчик силы на основе камертона (TFFS) могут обнаруживать действительные силы и положение молекулы в нанопоре, что обещает контролировать прохождение ДНК через нанопоры с соответствующей скоростью. Трудности обращения с нанопорами можно избежать, используя Si-зонд. Кроме того, использование системы с двумя нанопорами является возможным методом контроля и замедления прохождения ДНК через нанопоры. Кроме того, нанопоры с оптической ловушкой потенциально могут быть использованы для обнаружения ДНК в будущем. Здесь мы суммировали скорость транслокации ДНК твердотельной нанопоры, интегрированной с некоторыми методами контроля ДНК, такими как система с двумя нанопорами, нанопора с оптической ловушкой, оптический пинцет, магнитный пинцет, AFM, TFFS и Si-зонд (Таблица 1) .

Заключение

Однослойные 2D-материалы, такие как графен, MoS ₂ , WS ₂ , и h-BN, возможно, являются наиболее тонкими из доступных материалов, поскольку их толщина равна расстоянию между нуклеотидами. По сравнению с традиционными твердотельными мембранами с нанопорами, однослойные двумерные мембраны идеальны для устройств с нанопорами, поскольку они демонстрируют высокое отношение сигнал / шум ионного тока и относительно большие области чувствительности. Они потенциально подходят для реализации секвенирования ДНК, комбинируя их с оптическим пинцетом, магнитным пинцетом, AFM, TFFS, Si-зондом, системой с двумя нанопорами или нанопорой с оптической ловушкой. Однако с этими методами возникло несколько проблем, которые необходимо решить до коммерциализации секвенирования нанопор ДНК. Первый из них возникает, когда шарики или наконечники зонда находятся близко к нанопоре, когда труднее различать нуклеотиды ДНК с помощью сигналов ионного тока. Молекулярные ручки или другие более длинные молекулы следует использовать для добавления длины нити ДНК, которая может компенсировать влияние на сигнал тока, вызванное шариками или наконечниками. Во-вторых, для реализации высокопроизводительного и параллельного обнаружения следует использовать массивы нанопор, но технология параллельного обнаружения в настоящее время недостаточно развита. В-третьих, согласно существующим способам изготовления трудно изготовить систему с двумя нанопорами и систему нанопор с оптической ловушкой с высокой точностью и воспроизводимостью, что очень важно для обнаружения нанопор ДНК. Пучок ионов гелия может быть ключевой технологией для решения этой проблемы [11, 58]. Таким образом, мы ожидаем, что секвенирование нанопор ДНК продолжит оставаться в центре внимания исследований и может быть интегрировано с новыми идеями и инновационными подходами для реализации низкого уровня ошибок, быстрой и высокой параллельной записи и больших длин чтения до 100 килобаз.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью.

Сокращения

2D:

Двухмерный

3D:

Трехмерные материалы

TMD:

Слоистый дихалькогенид переходного металла

SNR:

Соотношение сигнал / шум

PL:

Фотолюминесценция

SIBA:

Самоиндуцированное обратное действие

AFM:

Атомно-силовая микроскопия

TFFS:

Определение силы на основе камертона