Нанодетектирование рака головы и шеи на поверхности, чувствительной к оксиду титана

Аннотация

Рак головы и шеи - это гетерогенное заболевание, берущее свое начало в плоскоклеточных клетках, выстилающих гортань (голосовой ящик), ротовую полость, глотку (горло), носовую полость и слюнные железы. Диагностика рака головы и шеи на более поздней стадии сильно влияет на выживаемость пациента. Это делает обязательной идентификацию этого рака на более ранних стадиях развития с помощью подходящего биомаркера. Антиген плоскоклеточной карциномы (SCC-Ag) - это циркулирующий сывороточный биомаркер опухоли, повышенный уровень которого был обнаружен у пациентов с раком головы и шеи и сильно коррелировал с объемом опухоли. Настоящее исследование было проведено для обнаружения и количественной оценки уровня SCC-Ag на оксиде титана (TiO ₂ ) -модифицированный датчик с встречно-штыревым электродом (IDE) антителом SCC-Ag. Обнаружение SCC-Ag было обнаружено на уровне 100 фМ, в то время как оно было улучшено до 10 фМ, когда антитело было конъюгировано с золотой нанозвездой, что представляет собой 10-кратное улучшение. Интересно, что это повышение чувствительности в 1000 раз выше, чем у других субстратов. Кроме того, был проведен анализ специфичности с использованием двух разных контрольных белков и было обнаружено, что антитело распознает только SCC-Ag, что указывает на специфическое обнаружение на IDE-TiO ₂ чувствительная поверхность.

Введение

Рак головы и шеи показывает аномальный рост клеток в области головы и шеи, о чем широко сообщается. Он происходит из глотки, рта, слизистой оболочки, эпителия ротовой полости, слюнных желез и полости носа [1]; является шестым по распространенности онкологическим заболеванием во всем мире; и поражает более 644 000 человек ежегодно [2]. Большинство пораженных пациентов диагностируются на поздних стадиях и сильно влияют на их выживаемость. Выявление рака головы и шеи на ранней стадии обязательно для улучшения выживаемости и улучшения образа жизни. Серологические опухолевые маркеры использовались для диагностики и лечения рака головы и шеи. Плоскоклеточная клетка выделяет преобладающий антиген плоскоклеточной карциномы (SCC-Ag), его присутствие повышено у онкологических больных, а SCC-Ag оказался многообещающим опухолевым маркером при плоскоклеточном раке, таком как гинекологический рак, рак легких, пищевода и анального канала. [3, 4]. Что касается рака головы и шеи, более высокие уровни SCC-Ag были связаны с метастазированием заболевания, рецидивом и смертностью, как было подтверждено в различных исследованиях с онкологическими пациентами [5,6,7]. Исследователи обнаружили, что SCC-Ag в сыворотке находится на значительном уровне риска рака гортани, ротовой полости и гортани [8, 9]. Кроме того, была обнаружена корреляция между уровнем SCC-Ag и объемом опухоли у пациентов с раком головы и шеи [10]. Целесообразно количественно определить уровень SCC-Ag, чтобы определить состояние рака головы и шеи, чтобы обеспечить более раннее лечение. Текущее исследование было сосредоточено на обнаружении SCC-Ag на его более низком уровне с использованием наночастиц на датчике встречно-штыревого электрода (IDE) с помощью антитела SCC-Ag.

IDE - это электрохимический биосенсор, обладающий такими многообещающими характеристиками, как дешевизна, портативность и чувствительность, который находит широкое применение, в частности, для мониторинга окружающей среды и медицинской диагностики [11, 12]. Повышение электрических свойств чувствительной поверхности улучшает обнаружение биомолекул. Наноматериалы широко используются в биосенсорах для улучшения обнаружения биомолекул на чувствительных поверхностях. Наноматериалы меньше по размеру, имеют большую площадь поверхности, хорошую теплопроводность и электрическую проводимость, совместимы с биомолекулами и демонстрируют огромную возможность применения в области биосенсоров [13, 14]. Наноматериал применялся двумя разными способами:первый - функционализация поверхности, а другой - конъюгирование аналита или мишени с целью улучшения обнаружения [15]. Золото является одним из хорошо зарекомендовавших себя наноматериалов и применяется в различных сенсорах, включая поверхностный плазмонный резонанс, сенсор волноводного режима, электрохимический сенсор и колориметрию [16,17,18]. Помимо этого, наноматериалы серебра, графена, меди и титана также нашли применение в различных биомедицинских приложениях. Как экологически чистый и недорогой полупроводник оксид титана (TiO ₂ ) имеет широкую запрещенную зону, используемую здесь для модификации поверхности на IDE для обнаружения SCC-Ag. Благодаря высоким электрическим и оптическим свойствам TiO ₂ , он широко используется для сверхмощных, фотокаталитических и фотоэлектрических преобразований [19,20,21,22,23]. Более того, его природа гидрофильности и большая площадь поверхности подходят для модификации поверхности и помогают обнаруживать биомолекулы на более низком уровне. В этом исследовании TiO ₂ был нанесен на чувствительную поверхность IDE для усиления электрического потока, когда происходит взаимодействие биомолекул. Чтобы улучшить обнаружение SCC-Ag, антитело конъюгировали с золотой нанозвездой (антитело против GNS) и иммобилизовали на TiO ₂ покрытая поверхность. Поскольку было доказано, что биомолекулы, конъюгированные с золотым наноматериалом, демонстрируют более высокую стабильность и обеспечивают должным образом ориентированные биомолекулы с иммобилизованной поверхностью, это позволяет улучшить предел обнаружения [24, 25]. Кроме того, большее количество биомолекул может быть иммобилизовано на одной золотой частице, что приводит к привлечению повышенных уровней целевой молекулы. В этой работе два разных наноматериала, а именно TiO ₂ (для модификации поверхности) и GNS (для конъюгации антител) были использованы для улучшения обнаружения SCC-Ag на чувствительной поверхности IDE. Ожидается, что применение GNS улучшит характеристики датчика тока за счет большей поверхности, позволяющей улавливать большее количество антител.

Материалы и методы

Реагенты и биомолекулы

Антиген SCC (гликопротеин с изоформами от 45 до 55 кДа) был приобретен в Randox Life Sciences (Малайзия). Антитело против SCC было закуплено у Next Gene (Малайзия). (3-аминопропил) триэтоксисилан (APTES), этаноламин, альбумин (основной белок крови при 45 мг / мл; 50–70% белка крови с молекулярной массой 66,5 кДа), физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS; pH 7,4) и изопропоксид титана IV были от Sigma Aldrich (США). Серпин (широко распространенное ингибирование сериновой протеазы с молекулярной массой от 40 до 50 кДа) был от Sino Biological (Китай). Золотая нанозвезда была синтезирована, как описано Shan et al. [26]. Все полученные реагенты и химикаты хранились в соответствии с рекомендациями производителя.

Изготовление встречно-штыревых электродов

Базовая конструкция и изготовление IDE были соблюдены, как сообщалось ранее [27]. Первоначально кремниевая пластина была очищена стандартными чистящими растворами, а алюминиевый IDE-электрод был нанесен традиционным методом влажного травления на кремниевую пластину. Затем положительный фоторезист наносился на поверхность кремниевой пластины с последующим термическим окислением. Нанесение алюминия производилось методом фотолитографии. Были задействованы три этапа:на этапе 1 было 1200 об / мин в течение 10 с, затем на этапе 2 было 3500 об / мин в течение 20 с, затем следовало 500 об / мин в течение 10 с. Затем на чувствительную поверхность воздействовал ультрафиолетовый (УФ) свет, чтобы перенести рисунок IDE на поверхность образца. После этого проявитель РД-6 использовался в течение 15 с для проведения процесса разработки. Фоторезистент сделан для устранения неэкспонированных участков. Проявленный образец прокалили при 100 ° C для удаления ненужной влаги и улучшения адгезии между SiO ₂ слой и алюминий. Наконец, с помощью 23-секундного травителя алюминия неэкспонированная область была удалена и очищена ацетоном. Окончательная поверхность была модифицирована TiO ₂ для обнаружения SCC-Ag. Изготовленная поверхность ИДЭ наблюдалась с помощью мощной микроскопии и трехмерного нанопрофиля. Изображения были получены с использованием соответствующей системы при увеличении × 50.

Покрытие TiO ₂ на сенсорной поверхности IDE

На изготовленной поверхности IDE TiO ₂ раствор был покрыт, и изопропоксид титана IV был использован в качестве прекурсора для приготовления раствора TiO ₂ . Для этого этанол смешивали с изопропоксидом титана IV и интенсивно перемешивали в течение 5 мин. Затем при перемешивании по каплям добавляли стабилизатор (100 мкл уксусной кислоты), а затем нагревали на горячей плите при температуре 85 ° C. Молярное соотношение смеси было фиксированным как 9:1:0,1 (от этанола до TIP и до уксусной кислоты). После 3 ч перемешивания получали прозрачный раствор. После 24 часов процесса старения раствор капали на диоксид кремния (SiO ₂ ) подложек с помощью центрифуги для нанесения покрытий со скоростью 2000 об / мин. После нанесения покрытия поверхность сушили 15 мин при температуре 175 ° C и отжигали 1 ч при 450 ° C. TiO ₂ тонкая пленка приобретает достаточную толщину после нанесения трех слоев.

Приготовление конъюгированного с GNS анти-SCC-Ag

Антитело SCC-Ag иммобилизовали на GNS с использованием линкера 16-меркаптоундекановой кислоты (16-MDA). Первоначально 5 мМ разбавленного 16-MDA смешивали со 100 мкл GNS и выдерживали при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут. Связанный 16-MDA с GNS удаляли центрифугированием при 13000 × g , 5 минут. Затем собранный золотой осадок активировали EDC (400 мМ) и NHS (50 мМ) в соотношении 1:1 путем инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре. Несвязанные EDC и NHS из смеси растворов удаляли центрифугированием при 13000 × g . , 5 минут. Осадок, содержащий активированный GNS, собирали для конъюгирования антитела. Затем 200 нМ антитела SCC-Ag смешивали с EDC-NHS-активированным GNS и выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа. Наконец, несвязанные антитела удаляли центрифугированием при 13000 × g , 5 минут. Конъюгированные антитела с GNS хранили при 4 ° C для дальнейшего использования, и конъюгацию подтверждали сканированием УФ-видимой спектроскопии. Сканирование проводилось в диапазоне от 480 до 560 нМ, и были обнаружены максимумы пиков.

Иммобилизация на антителе GNS на TiO ₂ -IDE Поверхность

TiO ₂ -покрытая поверхность IDE была дополнительно модифицирована APTES в амин для иммобилизации антител против GNS. APTES с 3% (разбавленным 30% этанолом) добавляли по каплям на TiO ₂ поверхности и выдерживали 3 ч при комнатной температуре. Поверхность трижды промывали 30% этанолом для удаления несвязавшихся APTES. Чтобы иммобилизовать антитело, выполняли стадию активации, как указано выше. Антитело или антитело против GNS наносили по каплям на поверхности и выждали 1 час для завершения процесса иммобилизации. Наконец, поверхность пять раз промывали буфером PBS для полного удаления несвязавшихся антител. Эти модифицированные антителом или GNS-антителом поверхности использовали для обнаружения SCC-Ag и сравнивали. TiO ₂ с иммобилизованным антителом GNS Поверхность анализировалась с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), автоэмиссионной просвечивающей электронной микроскопии (FETEM) и энергодисперсионного рентгеновского анализатора (EDX), как описано ранее [15]. Наблюдения АСМ проводились в масштабе 5 мкм, тогда как СЭМ проводились в масштабе 100 нМ при напряжении 15 кВ. Наличие элементов было обнаружено EDX.

Обнаружение антигена SCC на поверхности антитела / антитела Gold Nanostar

Для обнаружения SCC-Ag, TiO, модифицированного антителами или золотыми нанозвездами, ₂ Поверхности -IDE блокировали 1 М этаноламином, чтобы замаскировать участки поверхности, свободные от антител, и выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре. На поверхности, блокированной этаноламином, взаимодействовал 1 нМ SCC-Ag, и текущие ответы были замечены до и после добавления SCC-Ag. Для оценки предела обнаружения SCC-Ag титровали от 10 фМ до 1 нМ и наносили индивидуально на поверхности, модифицированные антителом или антителом GNS, и отмечали ответы с током. Эксперименты проводили в трех экземплярах и рассчитывали статистику. При измерениях следили за линейным напряжением развертки от 0 до 2 В с шагом 0,01 В. Предел обнаружения (LOD) считался самой низкой концентрацией аналита (от калибровочной линии при низких концентрациях) на фоне фонового сигнала ( S / N =3:1), другими словами, LOD =стандартное отклонение от базовой линии + 3 σ .

Выборочное обнаружение SCC-Ag

Чтобы проверить избирательное взаимодействие SCC-Ag с его антителом, были проведены контрольные эксперименты с двумя разными белками, а именно серпином и альбумином. Концентрацию этих контрольных белков в 1 нМ наносили на поверхности, модифицированные антителом или антителом GNS, и изменения тока наблюдали до и после взаимодействия. Эти текущие уровни сравнивали со специфическим обнаружением SCC-Ag его антителом и антителом против GNS. Другие контрольные экспериментальные установки включают взаимодействие SCC-Ag только с GNS и SCC-Ag с TiO ₂ -IDE поверхность, покрытая неиммунным антителом, меченным GNS. Эксперименты проводили в трех экземплярах и рассчитывали статистику. Для измерений использовалось напряжение линейной развертки от 0 до 2 В с шагом 0,01 В.

Результаты и обсуждение

Рак головы и шеи был описан как развитие различных опухолей в носу, рту, гортани и пазухах или вокруг них [28]. Ранняя диагностика и лечение подходящим биомаркером являются обязательными для повышения выживаемости пациентов. SCC-Ag был обнаружен в качестве подходящего сывороточного биомаркера для рака головы и шеи; здесь были проведены эксперименты по обнаружению и количественной оценке уровня SCC-Ag на TiO ₂ -модифицированный датчик встречно-штыревого электрода (IDE) своим антителом. TiO ₂ здесь используется для улучшения текущего отклика при взаимодействии биомолекул. По сравнению с другими наноматериалами TiO ₂ считается привлекательным в электрохимическом датчике из-за его активного поведения на поверхности вдоль электродов и улучшения электрокаталитической активности. Более того, это придает большую стабильность поверхности, что обеспечивает повторяемость отклика электрода и повышение предела обнаружения за счет увеличения пикового тока [29,30,31]. Чтобы использовать эту положительную особенность, в данном исследовании TiO ₂ с покрытием на поверхности IDE (IDE-TiO ₂ ) улучшает ток. Другой наноматериал GNS был использован для иммобилизации антител против SCC-Ag на IDE-TiO ₂ поверхность и увеличить предел удаления. Поскольку было доказано, что конъюгированная с золотом иммобилизованная биомолекула поверхность улучшает обнаружение мишени [32, 33], здесь был обнаружен SCC-Ag и сравнивался с антителом и модифицированным антителом GNS IDE-TiO ₂ поверхности. Как обобщено в другом месте, с увеличением площади поверхности наночастицы будет усиление биомолекулярного прикрепления. В этом контексте GNS имеет большую поверхность по сравнению со сферической наночастицей золота. Чтобы реализовать эту идею, текущий эксперимент был проведен с использованием GNS для повышения чувствительности.

Характеристика поверхности и иммобилизация антител против GNS

На рисунке 1 показано схематическое изображение обнаружения SCC-Ag на IDE-TiO ₂. чувствительная поверхность. Как показано на рис. 1a, первоначально чувствительная поверхность IDE была покрыта TiO ₂ и затем антитело иммобилизовали с конъюгацией GNS или без нее. Эти модифицированные антителами поверхности использовали для определения уровня SCC-Ag. Перед проведением обнаружения конъюгация GNS с антителом была подтверждена с помощью спектроскопии UV-Vis. Определяли профили сканирования GNS с желаемым диапазоном длин волн до и после конъюгации с антителом. Было ясно видно, что после иммобилизации сдвиг сдвинулся с 535 до 545 нМ (рис. 1б). Этот результат подтверждает конъюгацию антител на поверхности GNS. С другой стороны, изготовленная сенсорная поверхность наблюдалась морфологически. На рис. 2а показано изображение, полученное с помощью микроскопа с большим увеличением, а на рис. 2б показано изображение, полученное с помощью трехмерного изображения нанопрофиля. Оба профиля изображения четко показаны с областями зазора и электродов, которые образуют пальцы. Расположение промежутков и пальцев оказалось однородным и неповрежденным.

а Схематическое изображение для обнаружения SCC-Ag. IDE-TiO ₂ поверхность была модифицирована в амин с помощью APTES с последующей иммобилизацией антитела или антитела GNS. Аминогруппа APTES реагирует на карбоксильную группу антитела. SCC-Ag обнаруживали взаимодействием в антигенной области и сравнивали. б Измерения УФ-видимой спектроскопии с помощью GNS. Сканирование находилось в диапазоне от 480 до 560 нМ, а максимумы пиков составляли ~ 530 нМ. GNS с антителами и без них обозначены стрелками

а Изображение, полученное с помощью микроскопа высокого разрешения на поверхности IDE. Изображения были сняты при × 50. b Трехмерное изображение нанопрофиля на поверхности IDE. Изображения были получены с увеличением × 50. Показаны области электродов и зазоров. Промежутки обозначены звездами. Единообразные договоренности указывают на успешное изготовление. c Изображение атомно-силовой микроскопии. AFM показывает четкое различие между TiO ₂ и ГНС темными и светлыми пятнами соответственно. г Изображение, полученное с помощью автоэмиссионного просвечивающего электронного микроскопа. е Энергодисперсионный рентгеновский анализ. Обозначены элементы, обнаруженные на поверхности

Сравнение антител и иммобилизации антител против GNS TiO ₂ -IDE Сенсорные поверхности

SCC-Ag был обнаружен на TiO ₂ Поверхность -IDE с помощью поверхностей, иммобилизованных антителами или антителами GNS. Приставка ГНС на TiO ₂ поверхность была подтверждена наблюдениями AFM, SEM и EDX анализом (рис. 2c). Под наблюдением АСМ было замечено четкое различение между TiO ₂ и ГНС темными и светлыми пятнами соответственно. Это было подтверждено анализами SEM и EDX, в которых наблюдались заметные пики золота и умеренного титана. Эти результаты свидетельствуют о наличии GNS на TiO ₂ поверхность. На Фигуре 3 показаны процессы иммобилизации антитела и антитела GNS на модифицированном амином IDE-TiO ₂. чувствительные поверхности. TiO ₂ -модифицированная чувствительная поверхность IDE показывает текущий уровень как 4.65E − 12 (рис. 3a). После добавления APTES текущий уровень был увеличен до 5,37E-11; это увеличение тока указывает на то, что поверхность была преобразована в амин с помощью APTES. Когда антитело иммобилизовали, текущий уровень изменился с 5,375E-11 на 1,05E-9. Разница в токе составила 1.04E-9 (рис. 3а). Эта иммобилизация произошла из-за химического взаимодействия аминогруппы из APTES и группы COOH в антителе [18]. Изменения силы тока подтвердили связывание антител с модифицированной поверхностью APTES. После этого оставшуюся поверхность покрывали 1 М этаноламином, чтобы уменьшить эффект биообрастания из-за неспецифического связывания биомолекул на чувствительной поверхности. Аналогичным образом антитела против GNS были иммобилизованы на TiO ₂. -IDE, а когда антитело GNS было иммобилизовано на APTES-модифицированной поверхности, текущий уровень увеличился с 4,41E-12 до 1,23E-9 (рис. 3b). Было ясно обнаружено, что когда антитело иммобилизовано на поверхности GNS, оно показывает более высокий ответ на поверхности, модифицированной амином. Это может быть связано с большим количеством антител, связывающихся на поверхности одиночного GNS, и сильным связыванием этого комплекса на поверхности, модифицированной амином. Это связывание происходит из-за того, что амино-концевые группы в APTES замещают цитратные группы на GNS и химически фиксируются на поверхности IDE, модифицированной APTES [34]. Хорошо известно, что обнаружение биомолекул на чувствительных поверхностях в основном зависит от двух факторов, а именно, аффинности связывания взаимодействующих молекул и надлежащей иммобилизации молекул на чувствительной поверхности. Более высокая биомолекулярная иммобилизация на чувствительной поверхности резко улучшила обнаружение цели на ее более низком уровне. В этом исследовании GNS использовали для иммобилизации антител против SCC-Ag на IDE-TiO ₂ поверхность, чтобы увеличить вероятность более высокого связывания антител, что приводит к эффективному обнаружению SCC-Ag.

Процессы иммобилизации на IDE-TiO ₂ поверхности. а С антителом. б С антителом против GNS. Модификации поверхности начинали с 3% APTES с последующей активацией EDC и NHS для иммобилизации антитела; 1 М этаноламина использовали для блокирования неприсоединенной области антитела. При измерениях следили за линейным напряжением развертки от 0 до 2 В с шагом 0,01 В. Правильные изменения тока после каждой иммобилизации подтверждали связывание антитела и антитела GNS на чувствительных поверхностях

Сравнительное обнаружение SCC-Ag на IDE-TiO ₂ Поверхность антителом или антителом GNS

Поскольку антитело GNS демонстрирует эффективную иммобилизацию на IDE-TiO ₂ на поверхности, аналогичная концентрация SCC-Ag 1 нМ была обнаружена на поверхностях как антител, так и антител GNS, и сравнивались изменения текущего уровня. На рис. 4а показано обнаружение 1 нМ SCC-Ag на поверхности, модифицированной антителами. Перед проведением обнаружения поверхность, модифицированная антителом, была покрыта блокирующим агентом этаноламином, чтобы избежать неспецифического связывания биомолекул. Этаноламин показывает текущее изменение как 4,65E-12. После добавления 1 нМ SCC-Ag текущий уровень повысился до 1,33E-09. Эти текущие изменения четко указывают на связывание SCC-Ag с его антителом. В случае поверхности антитела GNS текущий уровень этаноламина равен 1,33E-11; после добавления 1 нМ SCC-Ag оно увеличивалось до 1,62E-09 (фиг. 4b). Текущие изменения с антителом GNS были выше по сравнению с только модифицированной антителом поверхностью для аналогичной концентрации SCC-Ag. Это может быть связано с большим количеством антител, связанных с IDE-TiO ₂ поверхность через ГНС.

Обнаружение SCC-Ag с помощью a антитело и b Антитело GNS. Проверено на IDE-TiO ₂ поверхности с вышеуказанными шагами до блокирования 1 M этаноламина. При измерениях следили за линейным напряжением развертки от 0 до 2 В с шагом 0,01 В. После взаимодействия 1 нМ SCC-Ag текущие уровни увеличивались в обоих случаях; в то же время он показывает более сильное изменение тока с антителом против GNS

Предел обнаружения SCC-Ag на IDE-TiO ₂ Поверхность антителом или антителом GNS

Поверхности, модифицированные антителами или GNS-антителами, демонстрируют четкое обнаружение SCC-Ag, и предел обнаружения был оценен на обеих поверхностях для сравнения (рис. 5a, b). Для этого SCC-Ag в концентрациях от 10 фМ до 1 нМ разбавляли и капали на эти поверхности индивидуально и отмечали изменения в силе тока. На рис. 5а показаны различные концентрации связывания SCC-Ag на модифицированной антителом поверхности. После этаноламина взаимодействовало 10 фМ SCC-Ag, и никаких изменений тока не наблюдалось. При увеличении концентрации до 100 фМ ток незначительно изменился с 4,65E-12 до 6,54E-11. Кроме того, концентрации были увеличены до 1 пМ, 10 пМ, 100 пМ и 1 нМ, а текущие уровни были увеличены до 4,69E-10, 7,91E-10, 8,78E-10 и 1,33E-09 соответственно. Эти результаты ясно указывают на то, что с увеличением концентраций связывание также увеличивается. Предел обнаружения был рассчитан на основе 3 σ , и это было при 100 фМ (рис. 6а).

Дозозависимые взаимодействия с a антитело и b Антитело GNS к IDE-TiO ₂ поверхности. Поверхность находится в соответствии с вышеуказанными шагами до тех пор, пока не будет блокироваться 1 М этаноламина. При измерениях следили за линейным напряжением развертки от 0 до 2 В с шагом 0,01 В. Концентрации SCC-Ag от 10 фМ до 10 нМ взаимодействовали на обеих поверхностях, и наблюдались текущие изменения. Промывку проводили пятью реакционными объемами на каждой стадии, используя 10 мМ PBS (pH 7,4). С увеличением концентрации SCC-Ag текущие уровни постепенно повышались в обоих случаях. Антитело GNS показывает текущие изменения от 10 фМ, тогда как изменения от 100 фМ были замечены только с антителом. В обоих случаях (антитело и антитело против GNS) 1 нМ SCC-Ag показал насыщение. При дальнейшем увеличении концентрации каких-либо значительных изменений силы тока не наблюдалось

Сравнение текущих изменений с различными концентрациями SCC-Ag на поверхностях, модифицированных антителами и GNS-антителами. а График линейной регрессии для предела обнаружения SCC-Ag. Отображаются с антителом (красная линия) и с антителом GNS (синяя линия). Предел обнаружения был определен как 10 фМ с антителом против GNS и 100 фМ с одним антителом. б Текущие изменения, связанные с взаимодействием SCC-Ag и антител. При всех концентрациях был обнаружен более высокий уровень текущих изменений на поверхности антитела GNS. При измерениях следили за линейным напряжением развертки от 0 до 2 В с шагом 0,01 В. Полоса ошибок показывает усредненные значения из трех повторов ( n =3) со стандартными отклонениями в диапазоне от ± 0,1 до 0,15 × 10 ⁻⁹ A. Предел обнаружения (LOD) считался самой низкой концентрацией аналита (из калибровочной линии при низких концентрациях) на фоне фонового сигнала ( S / N =3:1), другими словами, LOD =стандартное отклонение от базовой линии + 3 σ

Такие же концентрации SCC-Ag независимо взаимодействовали на поверхностях, модифицированных антителами GNS. Когда на поверхность было сброшено 10 фМ SCC-Ag, ток явно изменился с 1,33E-11 до 3,74E-11. Этот результат показывает, что даже 10 фМ SCC-Ag могут четко взаимодействовать с поверхностью, иммобилизованной антителами GNS, что не может быть обнаружено в случае с одним антителом. Более того, когда концентрации были увеличены до 100 фМ, 1 пМ, 10 пМ, 100 пМ и 1 нМ, текущие уровни были увеличены до 4,69E-10, 9,23E-10, 1,41E-09, 1,48E-09 и 1.62E − 09 соответственно (рис. 5б). Статистические расчеты со стандартными отклонениями находятся в диапазоне от ± 0,1 до 0,15 × 10 ⁻⁹ . A. По сравнению с ощущением на двух вышеупомянутых поверхностях, поверхность, модифицированная антителами GNS, показывает более высокие изменения тока при всех протестированных концентрациях SCC-Ag (рис. 6b). На основе 3 σ , он может найти предел обнаружения как 10 фМ (рис. 6a), это в 10 раз лучше (ниже) обнаружение по сравнению только с поверхностью, модифицированной антителами. Статистический расчет со стандартными отклонениями находится в диапазоне от ± 0,1 до 0,15 × 10 ⁻⁹ . A. Ранее SCC-Ag оценивался на различных наноматериалах, таких как наночастицы стронция и графен; однако эти поверхности показали в ~ 1000 раз меньшую чувствительность по сравнению с текущим исследованием [35].

Селективное обнаружение SCC-Ag на поверхностях, модифицированных антителами / антителами GNS

Селективное обнаружение SCC-Ag сравнивали с двумя контрольными белками, а именно серпином и альбумином, которых много в кровотоке. Серпин - ингибитор протеазы, выполняющий различные физиологические функции и биологические процессы человека, тогда как на альбумин приходится 45 мг / мл ^-1 и составляет 50–70% в сыворотке крови. Как показано на фигуре, 1 нМ концентрации этих двух контрольных белков и SCC-Ag наносили индивидуально на поверхности антитела или антитела GNS (фиг. 7a); было ясно видно, что текущие изменения были замечены только с SCC-Ag в обоих случаях, что указывает на то, что антитело способно распознавать только SCC-Ag. Существенных изменений тока при взаимодействии контрольных белков не наблюдается. Этот эксперимент подтверждает, что текущая экспериментальная установка может конкретно обнаруживать / диагностировать SCC-Ag. Дальнейшие подтверждения были оказаны другими контрольными экспериментами за счет взаимодействия SCC-Ag только с GNS и SCC-Ag с TiO ₂ -IDE поверхность покрыта GNS, меченным неиммунными антителами. Не было замечено значительных изменений силы тока по сравнению с конкретным взаимодействием (рис. 7b).

а Селективное обнаружение SCC-Ag на поверхностях, модифицированных антителами и антителами GNS. Было выполнено взаимодействие с С1-серпином и С-2-альбумином. Поверхность находится в соответствии с вышеуказанными шагами до тех пор, пока не будет блокироваться 1 М этаноламина. Значения усредняли в трех повторностях. В обоих случаях антитело распознало только SCC-Ag, что указывает на специфическое обнаружение. б Контрольные измерения. Специфичность взаимодействий сравнивается с неспецифическими взаимодействиями. Были замечены явные различия. При измерениях следили за линейным напряжением развертки от 0 до 2 В с шагом 0,01 В. Полоса ошибок показывает усредненные значения из трех повторов ( n =3) со стандартными отклонениями в диапазоне от ± 0,1 до 0,15 × 10 ⁻⁹ А

Заключение

Head and neck cancer is a common cancer that affects the areas of the mouth, throat and salivary glands. Diagnosing head and neck cancer with a suitable biomarker is mandatory to give the necessary treatment to the patients and improve their lifestyle. SCC-Ag has been found to be one of the important biomarkers for cancers; herein, SCC-Ag was detected on the titanium oxide-coated interdigitated electrode sensing surface (IDE-TiO₂ ). Antibody for SCC-Ag was immobilized on IDE-TiO₂ surface and detected the SCC-Ag. The detection limit was found as 100 fM, and further increment in the limit of detection was attained by conjugating the antibody with gold nanostar (GNS antibody). The limit of detection was improved by 10-folds (to 10 fM), this might be due to the larger number of antibody bound on the amine-modified TiO₂ surface through GNS. Moreover, control experiments were carried out with two different proteins and not able to recognize by the anti-SCC-Ag, indicating the selective detection of SCC-Ag. The demonstrated IDE-TiO₂ sensing surface helps to diagnose the head and neck cancer, a strategy can be followed for the earlier detection.