Доставка siRNA на основе катионных мицелл для эффективной генной терапии рака толстой кишки

Введение

Рак - серьезная проблема общественного здравоохранения в мире. Рак толстой кишки - распространенная злокачественная опухоль, ежегодно поражающая более миллиона человек во всем мире [1]. Генная терапия применяется как метод лечения солидных опухолей и опухолей крови [2, 3]. Ключ к генной терапии рака зависит от безопасной и эффективной системы доставки генов [4, 5]. Невирусные векторы, включая катионные липиды, липидные наноэмульсии, твердые липидные наночастицы и векторы на основе полимеров, привлекли больше внимания, чем вирусные векторы, из-за их потенциальных преимуществ в доставке генов:их легко приготовить, вызвать меньший иммунный ответ, обладать меньшей токсичностью и лучшая биосовместимость [6, 7]. Нанотехнология предоставляет новые средства для изучения невирусных векторов с такими преимуществами, как биосовместимость, биоразлагаемость, безопасность и способность нацеливания и так далее [2, 8]. В нем большое количество носителей наночастиц, которые имеют высокий положительный заряд, могут объединяться с лекарственным средством анионной нуклеиновой кислоты за счет эффекта электрического заряда, показывая широкую и яркую перспективу применения в генной терапии [9, 10].

Как тип полимерного сополимера, обладающего биоразлагаемостью и биосовместимостью, сополимеры PEG / PCL находят многообещающие применения в системах доставки лекарств [11,12,13]. На основе мицелл MPEG-PCL мы использовали амфифильный DOTAP для модификации сополимера MPEG-PCL за одну стадию, создав катионные самоорганизующиеся гибридные мицеллы DOTAP и MPEG-PCL (DMP) [14,15,16,17]. Эти мицеллы открывают многообещающие перспективы для доставки химических и генных лекарств с превосходной стабильностью и безопасностью. Например, DMP использовался для доставки суицидного гена сурвивина T34A и куркумина для терапии рака толстой кишки [14, 18]. Однако предыдущие исследования были ограничены передачей плазмидной ДНК, и до сих пор не было сообщений о доставке мицелл DMP для других форм генной терапии, что ограничивало применение мицелл DMP в генной терапии.

Генетическая интерференция, основанная на siRNA, также является важной частью генной терапии, помимо терапевтических генов плазмидной ДНК. Как важный член гена-лекарства, миРНК представляет собой небольшую молекулу двухцепочечной РНК. Противораковые препараты миРНК используют механизмы эндогенной РНКи, чтобы подавить экспрессию онкогенов. Благодаря значительным преимуществам, таким как улучшенная стабильность и эффективность подавления звука, siRNA имеет потенциал для применения в терапии рака [19]. По сравнению с большой молекулярной массой плазмидной ДНК миРНК имеет более высокую эффективность трансфекции, что особенно подходит для конкретной точки нацеливания на ген в генной терапии. Таким образом, это может быть хорошим выбором для генной терапии. В настоящее время в клинических испытаниях были протестированы лекарственные средства для лечения множественных siRNA на основе невирусных векторов, такие как CALAA-01 на основе наночастиц катионного полиполимера циклодекстрина и ALN-TTR02 на основе липидов [2]. Однако генная терапия на основе миРНК по-прежнему необходима для разработки новой точки нацеливания на миРНК и поиска безопасных, эффективных и высокоспецифичных носителей для доставки миРНК.

В этом исследовании мы попытались использовать мицеллы DMP для доставки миРНК, чтобы изучить эффективность и безопасность мицелл DMP для доставки миРНК. Мы использовали миРНК Bcl-xl и миРНК Mcl1 в качестве терапевтической мишени, исследуя их противоопухолевый эффект для лечения рака толстой кишки in vitro и in vivo. Ген Bcl-xl и ген Mcl1 являются членами семейства Bcl-2 антиапоптотического гена и играют жизненно важную роль в ингибировании апоптоза [20, 21]. Мы предполагаем, что синтетические мицеллы DMP могут эффективно и безопасно доставлять миРНК Bcl-xl и миРНК Mcl1. МиРНК Bcl-xl и миРНК Mcl1 могут подавлять экспрессию гена Bcl-xl и гена Mcl1, вызывая апоптоз клеток C26 и затем достигая терапевтического эффекта ингибирования роста клеток C26.

Материалы и метод

Материалы

N- [1- (2,3-диолеилокси) пропил] -N, N, N-триметиламмонийметилсульфат (DOTAP) был приобретен у Avanti Polar Lipids (Алабастер, Алабастр, США). Диблок-сополимер MPEG-PCL с расчетной молекулярной массой 4000 был синтезирован согласно нашим предыдущим сообщениям [22]. Mn сополимера MPEG-PCL составлял 4050. Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), и 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ) были получены от Sigma-Aldrich (США). ) и использовали без дополнительной очистки. Дихлорметан и другие органические растворители были приобретены у ChengDu Kelang Chemical Co., Ltd. (Чэнду, П. Р. Китай). Клетки C26 (аденокарцинома толстой кишки мыши) и клетки 293 T (HEK 293 T / 17) были приобретены из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США). Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, инкубируя при 37 ° C с 5% CO ₂ -увлажненная воздушная атмосфера.

Приготовление мицелл DMP

Чтобы выбрать лучший способ получения DMP, мицеллы DMP были приготовлены в трех органических растворителях, каждый из которых содержал три различных дозировки DOTAP. Что касается растворителя, для исследования были выбраны дихлорметан, хлороформ и этилацетат, а дозы DOTAP включали 5 мг, 10 мг и 20 мг. DOTAP и MPEG-PCL совместно растворяли в органическом растворителе, а затем выпаривали с помощью вакуумного насоса с образованием высушенной пленки. Затем высушенную пленку регидратировали в дистиллированной воде. Наконец, приготовленные мицеллы DMP хранили при 4 ° C.

Характеристика мицелл DMP

Размер частиц и дзета-потенциал мицелл DMP определяли с помощью Zeta sizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) и выдерживали при 25 ° C во время процесса измерения. Все результаты были средним значением трех прогонов. Стабильность мицелл ДМП оценена качественно. Агрегаты мицелл ДМП исследовали невооруженным глазом. Наличие осадков указывает на нестабильность мицелл ДМП, в то время как однородно прозрачный раствор указывает на стабильность.

Замедление гелеобразования

Доставленную DMP siRNA Scramble (DMP / Scramble siRNA) смешивали с 2 мкл загрузочного буфера, загружали в 1% агарозный гель и разделяли электрофорезом при 140 В в течение 10 мин. 0,2 мкг миРНК Scramble объединяли с 1, 2, 3, 4, 5 и 6 мкг мицелл DMP. Гель окрашивали с помощью программы просмотра Gold Viewer, а полосы, соответствующие миРНК Scramble, визуализировали в УФ-свете.

Цитотоксичность мицелл DMP

Цитотоксичность мицелл DMP на Т-клетках 293 и C26 оценивали методом МТТ. Вкратце, клетки 293T и клетки C26 высевали при плотности 1,2 × 10 ³ . клеток на лунку в 100 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS (фетальная бычья сыворотка), в 96-луночном планшете и выращивали в течение 24 часов. Затем клетки подвергали воздействию серии мицелл DMP или PEI25K при различных концентрациях в течение 72 часов. Жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа МТТ. Результаты представляли собой среднее значение шести тестовых прогонов.

Трансфекция in vitro

За 24 часа до трансфекции клетки C26 высевали в 24-луночный планшет при плотности 5 × 10 ⁴ клеток на лунку в 0,5 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS (фетальная бычья сыворотка). Во время трансфекции среду в каждой лунке заменяли 0,5 мл среды, содержащей 0%, 10%, 20% и 30% FBS, и доставляемую DMP миРНК FAM (карбоксифлуоресцеин) (DMP / FAM siRNA) и PEI- доставленную миРНК FAM (PEI / FAM миРНК), содержащую 1 мкг миРНК в бессывороточной среде, пипеткой вносили в каждую лунку, и массовое соотношение миРНК DMP / FAM и миРНК PEI25K / FAM составляло 30:1 и 2:1. Через 24 часа перенесенные клетки наблюдали под микроскопом, и активность люциферазы измеряли с помощью проточной цитометрии (Epics Elite ESP, США)

In vivo подавление гена

Нацеленные на миРНК мышиные Bcl-xl, Mcl1-1, Scramble siRNA и FAM-меченные миРНК отрицательного контроля были приобретены у GenePharma Co., Ltd (Шанхай, Китай) в незащищенной, обессоленной, отожженной форме.

Для определения уровня мРНК Bcl-xl общую РНК экстрагировали из клеток C26 с использованием реагента TRIzol ™ (Thermo Fisher Scientific, США), а отдельные кДНК синтезировали с помощью анализа обратной транскриптазы SuperScript II (Invitrogen). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с помощью набора SYBR GreenER Quantitative PCR SuperMix Universal (Invitrogen). Праймеры для ПЦР были синтезированы TSINGKE Biological Technology (Чэнду, П. Р. Китай).

Исследование по борьбе с распространением

Способность DMP / siBcl-x1 и DMP / siMcl1 к клеткам C26 противодействовать пролиферации оценивали методом МТТ. Вкратце, клетки C26 высевали с плотностью 1,2 × 10 ³ . клеток на лунку в 100 мкл DMEM, содержащей 10% FBS, в 96-луночных планшетах и ​​выращивали в течение 24 часов. Затем клетки подвергали воздействию серий DMP / siBcl-xl и DMP / siMcl1 в различных концентрациях в течение 72 часов. Жизнеспособность клеток измеряли методом МТТ. Результаты представляли собой среднее значение шести тестовых прогонов.

Исследование формирования клонов

Клетки C26 высевали в 6-луночный планшет с плотностью 10 ³ . клеток на лунку в 2 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS. Через 24 часа клетки подвергали воздействию серии мицелл DMP или siRNA DMP / Scramble и DMP / siBcl-xl и DMP / siMcl1 в различных концентрациях. Когда клетки вырастают до видимого невооруженным глазом клона, культивирование прекращали, после чего следовали промывка, фиксация и окрашивание. Непосредственно подсчитывали количество клонов и рассчитывали степень ингибирования.

In vitro исследование апоптоза

Клеточный апоптоз наблюдали с помощью окрашивания аннексином V-флуоресцеина изотиоцианатом (FITC) и пропидия иодидом. Вкратце, клетки C26 высевали в шестилуночные планшеты и подвергали действию серии мицелл DMP, siRNA DMP / Scramble, DMP / siBcl-xl и DMP / siMcl1 в течение 72 часов. Затем клетки подвергали окрашиванию аннексином V-FITC и йодидом пропидия.

Исследование ксенотрансплантата опухоли in vivo

Мышам BALB / c в возрасте 6–8 недель прививали 5 × 10 ⁶ Клетки C26 на правом фланге. Комплексы ДМП / миРНК, эквивалентные 10 мкг миРНК, вводили внутриопухолево через день в течение 5 процедур, поскольку объем опухоли достигал 100 мм ³ . Мышей, получавших эквивалентное количество физиологического раствора или DMP, считали контрольной группой. Размер опухоли измеряли, и каждые 2 дня контролировали вес животных, пока всех животных не умерщвляли. Объем опухоли рассчитывали как (1/2 × длина × ширина [2]).

Гистологический анализ

Иссеченные ткани фиксировали в 4% растворе формалина с нейтральным буфером более 24 часов и заливали парафином. Срезы тканей (3–5 мкм) окрашивали гематоксилином и эозином. Этот анализ был выполнен в соответствии с протоколом производителя, а образцы были исследованы с помощью флуоресцентного микроскопа (× 400).

Коммерчески доступный набор TUNEL (Promega, Madison, WI) использовали для анализа апоптотических эффектов в тканях опухоли ксенотрансплантата меланомы мыши C26. Этот анализ был выполнен в соответствии с протоколом производителя.

Статистический анализ

Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводился с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения SPSS. Для всех результатов P ≤ 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Изучение процесса подготовки

Чтобы получить эффективную трансфекцию и низкую цитотоксичность для доставки миРНК, мы изучили различные процессы получения мицелл DMP, как показано в таблице 1. В нашем исследовании в отношении растворителей мицеллы DMP, полученные с помощью этилацетата, были очень нестабильными, а время стабильности мицелл DMP было не более 10 мин. И мицеллы DMP, полученные с помощью дихлорметана и хлороформа, обладали превосходной стабильностью, и они могли оставаться стабильными в течение 96 часов, за исключением DMP, полученного с помощью хлороформа с дозировкой DOTAP 20 мг. Что еще более важно, они также имели правильный размер, дзета-потенциал и PDI. Однако при сравнении исходной эффективности трансфекции эффективность трансфекции мицелл DMP, полученных с помощью дихлорметана, была выше, чем у мицелл DMP, полученных с помощью хлороформа. Итак, мы выбрали дихлорметан для приготовления мицелл ДМП.

Мицеллы DMP, полученные с помощью трех дозировок DOTAP, не имели явных различий в размере, дзета-потенциале и PDI, но мицеллы DMP, полученные с дозировкой DOTAP 20 мг, имели наивысшую эффективность трансфекции при трех дозах DOTAP. Путем приведенных выше сравнений мы выбрали процесс подготовки, основанный на DOTAP и MPEG-PCL (рис. 1a), чтобы получить мицеллы DMP с превосходной стабильностью и высокой эффективностью трансфекции. Схема получения мицелл ДМП представлена ​​на рис. 1б.

а Молекулярная структура DOTAP и MPEG-PCL. б Схема получения мицелл ДМП. c Спектр распределения мицелл ДМП по размерам. г спектр дзета-потенциала мицелл ДМП. е siRNA retarding assay. е Цитотоксичность мицелл ДМП на клетках 293Т. г цитотоксичность мицелл DMP на клетках C26

Характеристика мицелл DMP

Как представлено на фиг. 1c, спектр распределения частиц по размерам показывает, что мицеллы DMP были наноразмерными (PDI =0,315) со средним размером частиц 144,8 нм, что свидетельствует о очень узком распределении частиц по размерам. Спектр дзета-потенциала DMP был представлен на рис. 1d с дзета-потенциалом 46,4 мВ. Проведена качественная оценка стабильности мицелл ДМП.

Для оценки связывающей способности DMP с миРНК был проведен анализ задержки геля, результаты показаны на фиг. 1e. Когда массовое отношение DMP к siRNA было ≥ 30, достигалось полное замедление siRNA Scramble. Анионная миРНК Scramble абсорбировалась на поверхности DMP за счет электростатического взаимодействия, образуя комплекс DMP / siRNA.

Цитотоксичность мицелл DMP на клетках C26 и 293T оценивали методом МТТ. Как показано на рис. 1f и g, PEI25K показал высокую токсичность на клетках 293T с IC ₅₀ 0,83 мкг / мл. Однако мицеллы DMP были гораздо менее токсичными, а IC ₅₀ ДМП составлял 3,7 мкг / мл. IC ₅₀ Мицелл ДМП составляла 0,497 мг / мл на клетках С26. Однако PEI25K показал огромную токсичность с IC ₅₀ . <0,1 мкг. Таким образом, мицеллы DMP обладают более низкой цитотоксичностью, чем PEI25K, и могут использоваться для безопасной доставки миРНК в клетки C26.

In vitro трансфекция

Помимо биофизических характеристик, мы сравнили эффективность трансфекции мицелл DMP с эффективностью PEI25K («золотой стандарт» трансфекционного агента) in vitro . Как показано на рис. 2, в среде, содержащей 0%, 10%, 20% и 30% трансфекции FBS, мицеллы DMP имели эффективность трансфекции 85,47 ± 1,01%, 81,57 ± 2,04%, 75,29 ± 1,20% и 71,64 ± 1,59%, а эффективность трансфекции PEI составила 86,38 ± 2,92%. Было небольшое различие в эффективности трансфекции между сывороточной и несывороточной группой. И эффективность трансфекции сывороточной группы и несывороточной группы была аналогична эффективности трансфекции PEI. Кроме того, изображения на рис. 2а представляют прямое наблюдение способности мицелл DMP к трансфекции репортерным геном на основе FAM. Судя по изображению, морфология подвала в группе PEI изменилась по сравнению с группами DMP, что доказало, что PEI обладает высокой цитотоксичностью, в то время как мицеллы DMP имеют низкую цитотоксичность.

Эффективность трансфекции мицелл ДМП. а Изображение трансфицированных клеток C26 ( b , c ) эффективность трансфекции мицелл DMP в среде, содержащей 0%, 10%, 20% и 30% FBS и PEI25K, подсчитанная методом проточной цитометрии

Противораковая активность in vitro

В процессе генной терапии миРНК играет жизненно важную роль. Поэтому мы разработали миРНК, нацеленную на Bcl-xl, и миРНК, нацеленную на Mcl1, для изучения их противоопухолевой активности. Чтобы оценить интерференционную способность миРНК Bcl-xl и миРНК Mcl1, мы подтвердили интерференционную способность миРНК Bcl-xl и миРНК Mcl1 с помощью кПЦР. Согласно нашим результатам (рис. 3), уровень мРНК группы DMP / siMcl1 был ниже, чем у контрольных групп (рис. 3а). И уровень мРНК групп DMP / siBcl-xl был ниже, чем у контрольных групп (рис. 3b). Было хорошо продемонстрировано, что DMP / siBcl-xl и DMP / siMCL1 эффективно снижают соответствующий уровень мРНК.

а Уровень мРНК Bcl-xl, очевидно, снижается DMP / siMcl1. б Уровень мРНК Mcl1, очевидно, снижается DMP / siBcl-xl. c Фотографии образования клонов после обработки DMP / siBcl-xl или DMP / siMcl1 при различных концентрациях. г Число клонов после обработки DMP / siBcl-xl с различной концентрацией siRNA. е Противораковая способность DMP / siBcl-xl и DMP / siMcl1 с концентрацией миРНК 50 и 100 нМ на клетках C26 in vitro. е Скорость ингибирования образования клонов после обработки DMP / siMcl1 с различной концентрацией siMcl1. г скорость ингибирования образования клонов после обработки DMP / siBcl-xl с различной концентрацией siBcl-xl

Более того, мицеллы DMP использовали для доставки siRNA в клетки C26 для изучения того, что DMP / siBcl-xl и DMP / siMcl1 могут ингибировать рост клеток C26. Жизнеспособность клеток C26 определяли методом МТТ. Результаты показали, что выживаемость клеток DMP / siBcl-xl (50 нМ и 100 нМ) составляла 69,6% ± 3,3% и 56,3% ± 1,9%, а выживаемость клеток DMP / siMcl1 (50 нМ и 100 нМ) составляла 82,8 % ± 3,1% и 56,3% ± 3,2% (рис. 3e).

Для дальнейшего изучения противоопухолевой активности DMP / siBcl-xl и DMP / siMcl1 проводили анализ образования клонов. Было очевидно, что на фиг. 3c и d, по сравнению с контрольной группой, количество клонов в DMP / siBcl-xl и DMP / siMcl1 (50 нМ и 100 нМ) было меньше. Эти результаты предполагают, что DMP / siBcl-xl и DMP / siMcl1 обладают очевидным антипролиферативным действием на клетки C26. Таким образом, объединив результаты анализа МТТ, результаты продемонстрировали, что DMP / siBcl-xl и DMP / siMcl1 могут ингибировать пролиферацию клеток C26 и обладают заметной противораковой активностью в отношении клеток C26.

Чтобы определить, связаны ли DMP / siBcl-xl- и DMP / siMcl1 потеря способности к пролиферации и жизнеспособность клеток мицелл DMP с индукцией апоптоза, количество апоптотических клеток оценивали с помощью проточной цитометрии. Как показано на фиг. 3f, частота апоптоза группы DMP / siMcl1 составляла 37,9% ± 4,7%, что было выше, чем у контрольной группы, группы DMP и группы siRNA DMP / Scramble. Как показано на фиг. 3g, скорость апоптоза группы DMP / siBcl-xl составляла 33,0% ± 3,8%, что также было выше, чем у других контрольных групп. Эти данные об апоптозе показали, что DMP / siMcl1 и DMP / siBcl-xl обладают сильной способностью индуцировать апоптоз. Результаты анализа апоптоза согласуются с результатами МТТ и результатами образования клонов, описанными ранее, что позволяет предположить, что индукция апоптоза является возможным механизмом ингибирования пролиферации и жизнеспособности клеток C26.

Комплекс DMP / siRNA подавляет рост опухоли C26 in vivo

Модель ксенотрансплантата C26 на животных также использовали для тестирования противоопухолевой эффективности комплекса DMP / siRNA in vivo. Кривые роста опухоли и изображения опухолей ксенотрансплантата С26 каждой группы представлены на рис. 4а и б. Согласно нашим результатам, внутриопухолевое введение DMP / siMcl1 и DMP / siBcl-xl привело к значительному ингибированию роста опухоли ксенотрансплантата по сравнению с контрольными группами. Вес опухолей в каждой группе представлен на рис. 4b. По сравнению с группой лечения NS (0,85 ± 0,09 г) и группой DMP (0,76 ± 0,11 г) комплекс DMP / siMcl1 вызывал статистически значимое снижение веса опухоли (0,34 ± 0,06 г, P <0,01), а комплекс DMP / siBcl-xl вызывал статистически значимое снижение веса опухоли (0,42 ± 0,08 г, P <0,01). Эти результаты предполагают, что внутриопухолевая инъекция комплекса DMP / siRNA может эффективно ингибировать рост подкожного ксенотрансплантата модели рака толстой кишки C26. Побочные эффекты in vivo комплекса DMP / siRNA на другие органы исследовали с помощью анализа HE. Как показано на рис. 4, значительных патологических изменений в сердце, печени, селезенке, легких или почках не наблюдалось.

Противораковые эффекты и безопасность DMP / siRNA на модели ксенотрансплантата мыши C26. а Кривая развития опухоли, рассчитанная по объему опухоли. б Средний вес опухолей в каждой группе. По сравнению с другими группами лечения, группа DMP / siMcl1 и группа DMP / siBcl-xl достигли статистически значимого снижения веса опухоли (*** P , 0,001). c Репрезентативные изображения опухолей карциномы толстой кишки C26. г Апоптоз в опухолевых тканях, обнаруженный с помощью анализа TUNEL. е Анализ HE основных органов из каждой группы лечения в обеих моделях. Существенных патологических изменений в сердце, печени, селезенке, легких или почках не наблюдалось

Обсуждение

В этом исследовании были приготовлены катионные самоорганизующиеся гибридные мицеллы DOTAP и MPEG-PCL для доставки миРНК Bcl-xl и миРНК Mcl1 для лечения рака толстой кишки C26. Эти мицеллы DMP обладали превосходной стабильностью и были способны эффективно комбинировать и передавать миРНК Bcl-xl и миРНК Mcl1 в клетки C26. Что еще более важно, мицеллы DMP беспрецедентно доставляют миРНК (миРНК Bcl-xl и миРНК Mcl1) и могут эффективно индуцировать апоптоз клеток C26, что приводит к ингибированию роста клеток C26 как in vitro, так и in vivo с высокой безопасностью. В совокупности наше исследование показало, что DMP является потенциальным носителем для доставки генов siRNA.

Имеются сообщения о том, что катионный липид DOTAP широко применялся для доставки миРНК, но он порождает сильные положительные заряды, запускающие гемолиз, и обладает высокой цитотоксичностью. Основываясь на катионных липосомах DOTAP с высокой эффективностью трансфекции, но их положительные заряды будут вызывать токсичность, причина может заключаться в том, что головка четвертичной аммониевой соли DMP с положительными зарядами экспонировалась на поверхности липосомного фосфолипидного бислоя. Однако мицеллы ДМП на основе липида ДОТАП обладали высокой трансфекцией и низкой цитотоксичностью. Мы предположили, что в процессе самоорганизации мицелл DOTAP был встроен внутрь полимерных наночастиц, из которых головка соли четвертичного аммония не была полностью обнажена на поверхности. Таким образом были замаскированы частичные положительные заряды; Между тем, наши результаты также показывают, что эффективность трансфекции мицелл DMP не была низкой по сравнению с эффективностью трансфекции PEI25K. Было высказано предположение, что положительные заряды DOTAP после того, как были покрыты, все еще были частично экспонированы, показывая надлежащий потенциал, и этот уровень потенциала оказался достаточным для объединения и передачи siRNA. Кроме того, наши результаты показали, что мицеллы DMP на основе MPEG-PCL являются эффективным и безопасным носителем для доставки генов, который был оптимизирован для цитотоксичности DOTAP и сохраняет способность DOTAP к передаче генов. В аналогичном исследовании сообщалось, что цитотоксичность DOTAP снижалась после объединения с другими материалами [23]. Недавно новый вектор, состоящий из DOTAP и SWNT, имел более низкую цитотоксичность при доставке siRNA по сравнению с липофектамином [8]. LPN, которые получают мицеллы DOTAP-PLGA с использованием метода испарения растворителя с двойной эмульсией (DESE), привели к наноразмерным носителям [24,25,26]. Эти исследования хорошо согласуются с тем, что описано в нашем исследовании, и в определенной степени сделали нашу гипотезу более убедительной.

На эффективность доставки вектора переноса гена сильно влияет сыворотка. Белки сыворотки в сыворотке могут нейтрализовать положительные заряды на поверхности комплексов наноноситель / миРНК, на которые влияют электростатические эффекты на поверхности клеток с отрицательными зарядами [27,28,29].

В нашем исследовании, когда мы изучали эффективность трансфекции мицелл DMP, мы создали серию среды DMEM, содержащей 0%, 10%, 20% и 30% FBS для трансфекции, исследуя влияние сыворотки на эффективность трансфекции загруженных Наночастицы миРНК FAM. Наши результаты показали, что присутствие FBS мало влияло на эффективность трансфекции. В этой статье мы использовали MPEG-PCL для покрытия DOTAP, и DOTAP был встроен в MP с некоторыми частями, оставленными на поверхности в надлежащих пропорциях. Основываясь на этой структуре, мы предположили, что положительные заряды DOTAP были частично скрыты из-за покрытия MPEG-PCL, которое уменьшало уровень воздействия белков сыворотки, поэтому влияние сыворотки на трансфекцию было предотвращено. Это означало, что помимо снижения поверхностных зарядов катионных носителей после модификации, присутствие трансфекции сыворотки мало влияло на эффективность катионного полимерного носителя. Из-за превосходной трансфекционной способности в среде сыворотки, продемонстрированной мицеллами DMP in vitro, можно предположить, что сыворотка мало влияет на DMP-опосредованную доставку siRNA в эксперименте с клетками in vitro.

Заключение

В этом исследовании приготовленные мицеллы DMP обладали способностью доставлять миРНК. И мицеллы DMP использовали для доставки миРНК Bcl-xl и миРНК Mcl1 в клетки C26 для исследования противораковой активности in vitro. Мы исследовали процесс получения мицелл DMP и выбрали отличный способ получения мицелл DMP с узким размером, хорошим дзета-потенциалом и превосходной стабильностью. Кроме того, на приготовленные мицеллы DMP не повлияло присутствие сыворотки в эксперименте по трансфекции in vitro. Что еще более важно, DMP / siBcl-xl и DMP / siMcl1 могут ингибировать экспрессию гена Bcl-xl и гена Mcl1, вызывая апоптоз клеток C26 и затем достигая терапевтического эффекта ингибирования роста клеток C26. Внутриопухолевое введение комплекса DMP / siRNA может эффективно ингибировать рост подкожного ксенотрансплантата модели рака толстой кишки C26. Никаких существенных патологических изменений в сердце, печени, селезенке, легких или почках не наблюдалось. Считается, что мицеллы DMP можно рассматривать как эффективный носитель для доставки миРНК для лечения рака толстой кишки.

Сокращения

DOTAP:

N- [1- (2,3-диолеоилокси) пропил] -N, N, N-триметиламмонийметилсульфат

mPEG-PCL:

Метоксиполи (этиленгликоль) Поли (капролактон)

MTT:

3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид

siRNA:

Малая интерферирующая РНК