Новый магнитоэластичный иммуносенсор для сверхчувствительного обнаружения карциноэмбрионального антигена

Фон

Рак - одно из самых смертельных заболеваний в мире [1]. Рак у пациентов может быть обнаружен клинически, когда концентрация биомаркеров опухоли достигает определенного уровня в сыворотке [2]. Следовательно, совершенно необходимо достичь чувствительных, быстрых и точных анализов на онкомаркеры, которые обеспечивают эффективную стратегию диагностики рака [3]. Карциноэмбриональный антиген (CEA) относится к семейству гликопротеинов клеточной поверхности с молекулярной массой 180 ~ 200 кДа. Впервые он был обнаружен в ткани рака толстой кишки человека в 1965 г. [4, 5]. РЭА обычно присутствует в очень низких концентрациях (0 ~ 5 нг / мл) в крови здоровых взрослых [6]. Как правило, аномальный уровень СЕА может рассматриваться как признак рака, такого как карцинома желудка [7], карцинома поджелудочной железы [8], колоректальная карцинома [9], карцинома легкого [10] и карцинома груди [11]. Это означает, что CEA можно использовать в качестве биомаркера опухоли. Мониторинг уровня CEA в крови можно использовать для предварительного предупреждения, скрининга и диагностики рака. Между тем, CEA также может использоваться для последующих исследований тех, кто лечился клинически. Чувствительность РЭА к рецидиву опухоли составляет более 80%, что раньше, чем клиническое и патологическое обследование. Таким образом, постоянное наблюдение CEA обеспечивает важную основу для диагностики и прогноза лечебных эффектов [12].

Биосенсоры реагируют на определенное распознавание измеряемых сигналов биологического молекулярного выхода некоторыми дисциплинами, обеспечивая быстрый отклик, высокую чувствительность и низкую стоимость. В последнее время интенсивно изучаются иммунологические биосенсоры, такие как иммуноферментный анализ [13], флюоро-иммуноанализ [14] и электрохимический иммуноанализ [15,16,17]. Благодаря своей превосходной специфичности и чувствительности иммуносенсоры оказались многообещающими средствами для анализа биомаркеров опухолей, даже когда целевые соединения находятся в очень низких концентрациях [18,19,20,21].

Нанотехнология предоставляет новые методы применения наночастиц (НЧ) в технологии биочувствительности. Металлические НЧ обладают многими особыми характеристиками, которые обеспечивают замечательные платформы для взаимодействия с элементами биораспознавания [22, 23]. Иммуноанализы на основе НЧ привлекли большое внимание исследователей [24,25,26]. Магнитоупругие биосенсоры не подвержены влиянию температуры и pH окружающей среды с высокой чувствительностью. Поэтому в данной работе мы предложили метод магнитоупругого иммуноанализа на основе наночастиц золота (AuNP) и магнитоупругих микрочипов. Иммуносенсор был успешно разработан для обнаружения биомаркеров СЕА.

Результаты и обсуждение

Ввиду ленточной формы магнитоупругого (МЭ) микрочипа магнитная проницаемость максимальна по его длине [27]. Предварительные результаты показали, что оптимальная ширина и толщина МЭ-чипа составляли 1 мм и 28 мкм соответственно [28]. Моделирование было использовано для оптимизации длины чипа, как показано на рис. 1b.

Оптимальная длина микросхемы ME. а Относительное смещение зависит от длины. б Моделирование было использовано для оптимизации длины чипа

Относительное смещение отличается от длины на рис. 1а. Максимальное относительное смещение получается при длине 6 мм при модальном анализе первого порядка. Это означает теоретически высочайшую чувствительность. Таким образом, оптимальные размеры чипа в этой статье составляли 6 мм × 1 мм × 28 мкм.

Схематическая диаграмма биосенсора Nano-ME проиллюстрирована на рис. 2. Во-первых, чип Nano-ME был химически обработан цистеином для изготовления самособирающихся молекулярных (SAM) пленок на поверхности в качестве функционального слоя для иммобилизации CEAAb. Затем бычий сывороточный альбумин (BSA) способствует действию CEAAb за счет уменьшения неспецифического связывания и стерических затруднений. Изображения, полученные с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ), были получены для наблюдения за морфологией поверхности чипа. Как показано на рис. 3а, толщина слоя SAM составляла 120 нм. Изображение на рис. 3b показывает, что CEAAb был ковалентно прикреплен к слою SAM с увеличением шероховатости. На рис. 3с четко показано, что CEA был специально распознан и эффективно скомбинирован с приблизительной высотой 200 нм и более.

Схема сконструированного биосенсора Nano-ME

АСМ-изображения слоя SAM ( a ). Уровень CEAAb-SAM ( b ). Комплекс CEA-CEAAb ( c )

В определенном размере чипа концентрация антитела является важным фактором, связанным с чувствительностью иммуносенсора. Следовательно, это было необходимо для оценки сигналов ответа различных концентраций CEAAb (20, 50, 70 и 100 мкг / мл, как показано на рис. 4a). Результаты показывают, что оптимальный ответ был получен приблизительно при 448 Гц (фиг. 4b), когда концентрация CEAAb составляет 50 мкг / мл. Если концентрация CEAAb увеличивалась до 70 мкг / мл, реакция начинала снижаться из-за стерических затруднений и электростатического отталкивания [29].

а Кривая АЧХ в зависимости от CEAAb. б Гистограмма частот

В принципе, CEA специфически распознается антителами, что приводит к снижению частоты ответа. На рис. 5а показана кривая ответа иммуносенсора на СЕА в реальном времени. Между тем, мы получаем линейную аппроксимирующую кривую на рис. 5b.

Ответ в режиме реального времени ( a ) и аппроксимирующих кривых ( b ) биосенсора по сравнению с РЭА

Обычно стабильный отклик датчика достигается через 40 мин (рис. 5а). Изменение резонансной частоты регистрировали с соответствующими концентрациями CEA. Изменение Hz линейно зависит от логарифма концентраций CEA в диапазоне от 0,1 до 100 нг / мл ( R ² =0,9688) с пределом обнаружения 2,5 пг / мл (рис. 5б). Насколько нам известно, линейный диапазон и предел обнаружения явно ниже, чем у предыдущих методов [28]. Результаты показали, что беспроводной и высокочувствительный метод CEA был успешно внедрен.

Выводы

В этой статье на основе ME-чипа был успешно разработан иммуносенсор Nano-ME для высокочувствительного обнаружения CEA. AuNP и BSA эффективно улучшили чувствительность и стабильность. Предлагаемый иммуносенсор Nano-ME демонстрирует широкий диапазон определения CEA от 0,1 до 100 нг / мл с низким пределом обнаружения 2,5 пг / мл. Таким образом, точное определение СЕА с помощью иммуносенсора в исходном состоянии было достигнуто с удовлетворительными результатами. Предлагаемая платформа, благодаря своей специфичности, простоте и воспроизводимости, демонстрирует многообещающее применение в разработке неинвазивной диагностики рака.

Методы

Под действием изменяющегося во времени магнитного поля МЭ микрочип колеблется по длине. В модулированном магнитном поле, заставляющем микрочип ME вибрировать, энергия магнитного поля преобразуется в упругую потенциальную энергию для достижения максимального значения. Из-за формы ленточного сенсорного чипа магнитная проницаемость максимальна по всей его длине; следовательно, падающее магнитное поле вызывает продольные колебания в датчике практически из любой ориентации, кроме перпендикулярной базовой плоскости датчика. Дается формулой. (1):

где E обозначает модуль упругости, v коэффициент Пуассона, ρ - плотность материала сенсора, а L - продольный размер микросхемы. Когда температура испытания, влажность и другие параметры окружающей среды постоянны, изменение резонансной частоты магнитоупругого датчика чувствительно зависит только от изменения массы (△ m ) на его поверхности, как указано в формуле. (2)

На основании уравнения. (2) изменение резонансной частоты пропорционально количеству CEA. Следовательно, концентрации CEA могут быть достигнуты путем изменения частоты, где f ₀ начальная резонансная частота, M начальная масса, △ м - изменение массы, а △ f - сдвиг резонансной частоты датчика. Уравнение 2 показывает, что чувствительность датчика (△ f / △ м ) обратно пропорционален начальной магнитоупругой массе (M) датчика. Датчики с меньшими физическими размерами имеют меньшую начальную массу, что приводит к более высокой чувствительности. Отрицательный знак в уравнении означает уменьшение частоты (△ f ) к добавке немагнитоупругой массы (△ m ) на датчике. Следовательно, связывание организмов-мишеней с поверхностью биосенсора вызывает увеличение массы с соответствующим уменьшением основной резонансной частоты.

Магнитоупругие основы из сплава Metglas 2826MB (Fe40Ni38Mo4B18) были обработаны Honeywell Corporation (Морристаун, Нью-Джерси, США). CEA, антитело CEA, бычий сывороточный альбумин (BSA, 99%) и фосфатно-солевой буфер (PBS, pH =7,4) были приобретены в Sangon (Шанхай, Китай). Ацетон, изопропанол, этанол, 1-этил-3-карбодиимид (EDC) и N -гидроксисульфосукцинимид (NHS) был приобретен у Sigma-Aldrich Corporation (Сент-Луис, Миссури, США). Все остальные реагенты были аналитической чистоты. Сверхчистая вода была получена из системы Mill-Q (Milli-pore, США). Система парковки AFM (ND-100, Корея), плазма (P3C, Шанхай, Китай), омметр Гаусса (GM500), векторный анализатор цепей ZNB (R&S, Германия), лазерный резак (AV3620A, Циндао, Китай) и гаусс-метр HT20 (Хэнтун, Шанхай).

Основа сплава ME была вырезана лазером на микрочипы размером 6 мм × 1 мм × 28 мкм, затем очищена ультразвуком с использованием ацетона, изопропанола, этанола и деионизированной воды в течение 5 мин и высушена азотом. Активация модификации поверхности очищенных микрочипов производится плазменным методом. На обе стороны микрочипа был нанесен слой хрома (100 нм) с последующим покрытием слоем AuNP (40 нм) для изготовления чипов Nano-ME. Чип Nano-ME обрабатывает плазму с кислородом высокой чистоты (0,9999), затем погружается в 40 мМ раствор цистеамина и выдерживается в течение 12 часов при комнатной температуре. После этого чипы Nano-ME были биологически модифицированы и инкубированы с различными концентрациями CEAAb в течение 1 часа при 37 ° C в присутствии 1-этил-3-карбодиимида (EDC) и N -гидроксисульфосукцинимид (NHS). CEAAb сначала активировали EDC 10 мг / мл и NHS 10 мг / мл. Наконец, чип Nano-ME, модифицированный CEAAb, был дополнительно исследован с 0,1% BSA в течение 30 минут.

Биосенсор Nano-ME был сконструирован следующим образом:стеклянная трубка была обернута катушкой и подключена к векторному анализатору цепей. Между тем, добавление магнитного поля давало переменный ток, чтобы катушка создавала переменное магнитное поле. Резонансную частоту биосенсора Nano-ME можно получить с помощью векторного анализатора цепей. В пробирку добавляли различные концентрации CEA (0–100 нг / мл), и сдвиг частоты регистрировали каждые 5 минут до 40 минут. После этого чип Nano-ME был промыт PBS для определения характеристик AFM.

Сокращения

AFM:

Атомно-силовой микроскоп

AuNP:

Наночастицы золота

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

CEA:

Карциноэмбриональный антиген

CEAAb:

CEA антитело

EDC:

1-этил-3-карбодиимид

Гц:

Частота

ME:

Магнитоупругий

NHS:

N -Гидроксисульфосукцинимид

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

SAM:

Самостоятельная сборка молекул