Влияние Nano-SiO2 на экспрессию и отклоняющееся метилирование импринтированных генов в легких и семенниках

Фон

Диоксид кремния - это оксид кремния с химической формулой SiO ₂ . , чаще всего встречается в природе в виде кварца и в различных органических средах [1]. Созданные наночастицы получили широкое распространение в условиях быстрого роста и применения нанотехнологий в высокотехнологичных отраслях. Эта конкретная наночастица широко используется в ряде потребительских товаров, включая электронику, пластмассовые изделия, медицинские, косметические и покрывающие материалы благодаря своим физико-научным свойствам, таким как большая удельная площадь поверхности, большое количество реактивных центров, высокая поверхностная энергия, ненасыщенные химические связи, сильная адсорбционная способность и сильная тенденция к взаимодействию с металлами и органическими веществами, тем самым изменяя загрязнители и их перенос в окружающей среде [2]. Наличие SiO ₂ Наночастицы (НЧ) в широком спектре расходных материалов повышают их вероятность попадания в окружающую среду и вступают в контакт с населением.

Предыдущие экспериментальные исследования показали, что однократная интратрахеальная инстилляция или множественные внутрибрюшинные инъекции металлов и наночастиц оксидов металлов вызывают токсические эффекты от клеточного до системного и организменного уровней [3]. Обработка SiO ₂ НЧ подавляют рост клеточных линий рака груди за счет увеличения апоптоза и снижения подвижности клеток. Кроме того, воздействие SiO ₂ НЧ значительно нарушают рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) [4]. Когда модели крыс обрабатывали TiO ₂ трех разных размеров НЧ и, по сравнению с контролем, обработка жидкостью бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) большими агломератными (> 100 нм) аэрозолями вызвала острый воспалительный ответ, в то время как небольшие агломератные (<100 нм) аэрозоли вызвали значительное повреждение окислительного стресса и цитотоксичность [5]. P>

Изучение токсичности наночастиц для размножения - это растущая область. Одно исследование продемонстрировало, что при той же дозе обработки НЧ Ni вызывают более высокую репродуктивную токсичность у C. elegans чем Ni МП (микрочастицы). Эта репродуктивная токсичность наблюдалась у C. elegans включали уменьшение размера расплода, оплодотворенную яйцеклетку и активацию сперматида [6]. Появляется все больше доказательств того, что определенные эффекты окружающей среды могут передаваться потомству через отцовские пути без изменений в геноме сперматозоидов [7, 8]. Отцовская информация существует не только в геноме, но и в связанных специфических эпигенетических маркерах, содержании мРНК и некодирующей РНК.

Окислительный стресс является важным механизмом токсичности наночастиц, который может вызвать повреждение ДНК, воспаление, денатурацию белка и перекисное окисление липидов [9]. На эти биологические эффекты влияют физико-химические свойства наночастиц, включая их размер, площадь поверхности, форму, химию поверхности, функционализацию и растворимость [10, 11]. Появляется все больше свидетельств того, что воздействие наночастиц может вызывать эпигенетические изменения в тканях и клетках даже при низких, нецитотоксических дозах [12, 13]. Эпигенетика - это исследование наследственных изменений функции генов, которые не связаны с изменениями последовательности ДНК, включая метилирование ДНК, импринтинг генов, модификации гистонов и регуляцию некодирующими РНК [14]. Такие эпигенетические изменения связаны с развитием и прогрессированием множества патологических состояний и заболеваний [15]. Следовательно, эпигенетические эффекты являются важной частью скрининга для оценки риска пациентов на клеточном уровне.

Импринтируемый домен Dlk1 / Dio3 содержит три известных дифференциально метилированных области (DMR), которые метилированы отцовски:межгенный DMR (IG-DMR), материнский экспрессируемый 3-DMR (Gtl2-DMR) и Dlk1-DMR [16]. Предыдущие исследования предполагают, что IG-DMR определяет статус аллельного метилирования Gtl2 промотор DMR, который затем контролирует экспрессию гена во всем кластере [17]. Геном мыши имеет большое количество импринтированных генов в домене Dlk1 / Dio3 в дистальной области хромосомы 12. IG-DMR расположен между импринтированным геном Dlk1 и Gtl2 специфически метилирован в мужской зародышевой линии и регулирует родительскую аллель-специфическую экспрессию импринтированной области гена [18]. Статус метилирования IG-DMR устанавливается до рождения и, таким образом, сохраняется на протяжении всей жизни мужчины в мужской зародышевой линии во время дифференцировки мужских половых клеток, что означает, что метилирование IG-DMR сохраняется в сперматогониях и сперматоцитах зрелых семенников.

Наша цель состояла в том, чтобы найти изменения в экспрессии генов мужской зародышевой линии во время сперматогенеза до подавления транскрипции и трансляции, чтобы объяснить влияние отца на потомство через изменения окружающей среды. Факторы окружающей среды могут изменять модификации транскрипции сперматозоидов, что может приводить к изменениям в развитии потомства. Для проведения этого исследования в нашей работе мы использовали клеточные линии и мышей в качестве моделей для скрининга токсических эффектов SiO ₂ НП. Насколько нам известно, это первое исследование, демонстрирующее эпигенетические механизмы импринтированных областей Dlk1 / Dio3, при которых наночастицы вызывают повреждение как в легких, так и в ткани семенников.

Методы

Экспериментальное животное

Обращение с животными выполняли в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных согласно соответствующему протоколу использования животных в Нанкинском медицинском университете. Мышей получали от Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Все животные содержались при 23 ° C с 12-часовым световым циклом. Стерилизованная вода и корм для грызунов употреблялись мышами по своему желанию. Активность и поведение мышей контролировали ежедневно. Через 2 недели мышам вводили SiO ₂ наноразмеров. 12,5 мг / кг.

Химические вещества

Наноразмерный SiO ₂ (99,5% металлических следов, размер частиц 10–20 нм) были получены от Sigma-Aldrich Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США). Наночастицы суспендировали в среде RPMI 1640 для создания исходного раствора, диспергировали с помощью ультразвуковой вибрации в течение 20 минут, разбавляли до соответствующих концентраций и диспергировали еще в течение 20 минут.

Характеристики SiO ₂ НП

Размер и дзета-потенциал регистрировали с помощью Malvern Zetasizer Nano ZSP.

Извлечение РНК и qRT-PCR

Образцы легких и семенников мгновенно замораживали в жидком азоте, а затем примерно через 4 часа хранили при 80 ° C. Мы разморозили образцы перед их извлечением.

Суммарную РНК выделяли из образцов, используя 1 мл TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies Co, США). Смесь обрабатывали ультразвуком при мощности 80% в течение 5 минут, добавляли 0,2 мл хлороформа и затем центрифугировали при 12000 g . / мин при 4 ° C в течение 15 мин. Затем были добавлены три стадии очистки фенола / хлороформа, чтобы избавиться от белков. Затем мы использовали УФ-поглощение для измерения содержания РНК и качества каждого образца при 260 и 280 нм. Последовательности праймеров мРНК показаны в Дополнительном файле 1:Таблица S1 и S2. qRT-PCR проводили в соответствии с инструкциями производителя, как описано ранее [19]. ПЦР в реальном времени проводили с использованием SYBR Green (Vazyme). Цикл ПЦР был следующим:начальная денатурация при 95 ° C в течение 30 секунд, затем 40 циклов денатурации при 95 ° C в течение 15 секунд, отжиг при 60 ° C в течение 15 секунд и удлинение при 72 ° C в течение 30 секунд. Количество генов-мишеней было проанализировано с использованием метода 2 ^ -ΔCt после нормализации с помощью β-актина.

Экстракция ДНК, обработка бисульфитом и ПЦР с бисульфитным секвенированием

ДНК выделяли из тканей яичек и легких с использованием набора для ДНК (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. № 51304; США) в соответствии с рекомендациями производителя. Конверсия бисульфита 500 нг всей геномной ДНК была достигнута с использованием набора (EpiTect® Bisulfite kit; Qiagen. № 59104; США) в соответствии с рекомендациями производителя. Различные олигонуклеотиды CpG-метилирования были сконструированы с использованием программного обеспечения Methyl Primer Express v1.0, и последовательности представляют собой P1-F 5'-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3 ', P1-R 5'-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3'; P2-F 5'-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3 ', P2-R 5'-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3'; P3-F 5'- TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3 ', P3-R 5'- ACCCATAACAAACCACAACA-3'; P4-F 5′-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3 ′, P4-R 5′-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3 ′.

Каждый образец ДНК амплифицировали с помощью ПЦР следующим образом:2,5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР, реакционная смесь для ПЦР с 500 нг ДНК, обработанной бисульфитом, по 0,5 мкл каждого из прямых и обратных праймеров, 0,5 мкл смеси dNTP, 0,5 мкл rTaq (500 ед., DNTP , Mg ²⁺ ) (Takara Bio, Tokyo, Japan), добавление ddH ₂ O до объема 25 мкл. После активации полимеразы при 94 ° C в течение 10 минут за ней следовали 40 циклов в следующей последовательности:30 с при 94 ° C, 30 с при 58 ° C, 1 мин при 72 ° C и окончательное удлинение при 72 ° C. C в течение 10 мин.

Культура клеток и лечение

Клетки A549 были приобретены в ATCC (Манассас, Вирджиния, США) и культивированы в 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 37 ° C и 5% CO ₂ в увлажненном инкубаторе. Клетки высевали на 96-луночные планшеты, инкубировали с различными концентрациями SiO ₂ . НЧ:62,5, 125, 250, 500, 1000 и 2000 мкг / мл в течение 24 ч.

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа пролиферации CCK8. Клетки высевали с плотностью 1,5 × 10 ⁴ . на лунку в 96-луночном планшете и инкубировали в течение ночи. После воздействия SiO ₂ НЧ в различных концентрациях, 100 мкл CCK8 добавляли в каждую лунку, и клетки инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C, чтобы обеспечить метаболизм CCK8. Наконец, было определено поглощение при 450 нм. Были рассчитаны уровни ингибирования клеток и преобразованы в IC ₅₀ с использованием SPSS 15.0.

Статистический анализ

Все расчеты проводились с использованием программы SPSS 15.0. Сравнения между группами проводились с использованием несвязанных t тесты и критерий хи-квадрат Пирсона для BSP. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Во всех случаях значение p <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Характеристика SiO ₂ НП

Мы охарактеризовали SiO ₂ НЧ в условиях эксперимента. Средний гидродинамический радиус и дзета-потенциал SiO ₂ НЧ в культуральной среде были 371,77 ± 18,46 нм и 18,83 ± 2,12 мВ соответственно (рис. 1).

Характеристика SiO ₂ НП во взвешенном состоянии. Частицы суспендировали в среде для культивирования клеток с 10% FBS. а, б Размер и дзета-потенциал SiO ₂ НЧ оценивали с помощью Zetasizer Nano ZSP. c Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа CCK8 после воздействия различных концентраций SiO ₂ НП на 24 ч. Средние значения ± стандартное отклонение повторяющихся экспериментов, каждый из которых состоит из трех технических повторений. *** p <0,001

Эффект SiO ₂ НЧ в клеточной линии A549

Для определения токсичности SiO ₂ НЧ мы провели тест пролиферации с клетками A549, чтобы определить IC ₅₀ SiO ₂ НП на ячейках А549. Как показано на рис. 1c, SiO ₂ НЧ снижают жизнеспособность клеток A549 в зависимости от концентрации. Снижение жизнеспособности клеток значительно при SiO ₂ . Концентрация НП выше 62,5 мкг / мл ( p <0,001). IC ₅₀ 24 часа химического вещества определяется как концентрация, которая влияет на 50% клеток после 24 часов воздействия. IC ₅₀ 24 ч определено для SiO ₂ НЧ было 4942 мкг / мл.

Эффекты SiO ₂ НЧ на легких и семенниках мышей

Мы определили, было ли воздействие SiO ₂ НЧ в дозе 12,5 мг / кг массы тела могут привести к повреждению мембраны легких и даже повреждению семенников в нашей модели на мышах. Как показано на рисунках, SiO ₂ Воздействие NP привело к разрушению ламеллярного тела в гистологических срезах легкого (рис. 2a, b) и повреждению митохондриальных крист по сравнению с контрольной группой в семенниках (рис. 2c, d). Затем мы исследовали влияние SiO ₂ на легкие и яички. НЧ при активации импринтинга в импринтированной области Dlk1 / Dio3.

ПЭМ-изображения тканей легких и семенников крыс, подвергшихся воздействию SiO ₂ НП. а Морфологию тканей легких в контроле оценивали с помощью SEM. б Морфологию тканей легких в обработанной группе оценивали с помощью SEM. c Морфологию тканей семенников оценивали с помощью SEM в контроле. г Морфологию тканей семенников оценивали с помощью SEM в обработанной группе. Масштабные линейки соответствуют 2,0 мкм

Экспрессия отпечатанных генов в легких и семенниках мышей

Чтобы проиллюстрировать изменения в легких и семенниках, мы обнаружили импринтированные гены в этих тканях. Мы выбираем 24 импринтированных гена; они были Dio3 , Ddc , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , H19 , Igf2, Igf2as , Igf2r , Inpp5f , Magel2 , Magi2 , Mest , Мир296 , Мир298 , Ndn , Ннат , Peg10 , Plagl1 , Pwcr1 , Rasgrf1 , Rtl1 , Snrpn и Snurf. Тринадцать из этих генов экспрессируются как в легких, так и в яичках: Dio3 , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , Igf2r , Igf2 , Inpp5f , Peg10, Ndn , Ннат , Rasgrf1 , Rtl1 и Snrpn (Рис. 3а, б). Дифференциально экспрессируемые гены первичного фокуса находились в импринтированной области Dlk1 / Dio3, которая содержит Dlk1 , Gtl2 , Rtl1 и Dio3 .

Экспрессия импринтированных генов в легких и семенниках. а Экспрессия импринтированных генов в легких. б Экспрессия импринтированных генов в семенниках. * P <0,05. ** P <0,01. Студенческий t тест

Выражение отпечатанной области Dlk1 / Dio3

Импринтированная область Dlk1 / Dio3 содержит три гена, кодирующих белок ( Dlk1 , Gtl2 , Rtl1 и Dio3 ) по наследуемому аллелю [20] (рис. 4в). Чтобы выяснить роль области Dlk1 / Dio3 в реакции тканей легких и семенников на SiO ₂ Обработка NP, мы проанализировали паттерн метилирования DMR по сравнению с контролем. Различные гены нацелены на метилирование в легких и яичках. Выражение Dlk1 и Dio3 были активированы как в легких, так и в яичках, в то время как Rtl1 активируется только в семенниках (рис. 4a, b).

Экспрессия импринтированной области Dlk1 / Dio3. а Гены области Dlk1 / Dio3 экспрессируются в легких. б Гены области Dlk1 / Dio3 экспрессируются в яичках. c Схема области Dlk1 / Dio3. * P <0,05. ** P <0,01. Студенческий t тест

Метилирование областей DMR Dlk1 / Dio3

Чтобы дополнительно исследовать, изменяется ли экспрессия генов в ответ на метилирование ДНК, мы обратились к статусу метилирования этой области в легких и семенниках мышей. При анализе метилирования ДНК мы определили последовательности трех участков CpG-островков. В семенниках они гипометилированы; однако в CpG island 1 они значительно гиперметилированы (Fig. 5). В легких полное метилирование такое же, как и в семенниках, в то время как CpG-остров 2 показал гиперметилирование (рис. 6).

Метилирование участков DMR Dlk1 / Dio3 в семенниках. а Метилирование CpG-острова 1 в контрольной и обработанной тканях. б Метилирование CpG-острова 2 в контрольной и обработанной тканях. c Метилирование CpG-острова 3 в контрольной и обработанной тканях

Метилирование DMR-регионов Dlk1 / Dio3 в легких. а Метилирование CpG-острова 1 в контрольной и обработанной тканях. б Метилирование CpG-острова 2 в контрольной и обработанной тканях. c Метилирование CpG-острова 3 в контрольной и обработанной тканях

Обсуждение

Растущее использование наноматериалов вызвало обеспокоенность по поводу потенциального воздействия на здоровье человека и окружающую среду. Предыдущие исследования показали, что SiO ₂ НЧ могут вызывать повреждение легких и сердечно-сосудистой системы, например воспаление легких и ишемическое повреждение миокарда у старых крыс [21]. Кроме того, наночастицы могут оказывать влияние на зародышевые линии, поскольку такие клетки оказались более чувствительными к токсическому действию НЧ Ag и продемонстрировали побочные эффекты после воздействия более низких доз. Воздействие НЧ Ag увеличивало количество аномалий, наблюдаемых в семенных клетках крыс, и снижало целостность как акросомы, так и плазматической мембраны в дополнение к снижению митохондриальной активности [22]. Наше исследование является частью серии исследований с использованием экспериментальной платформы для оценки способности наночастиц нацеливаться на мужские организмы и даже на их необработанное потомство.

В нашем предыдущем исследовании in vitro мы сообщили, что кратковременное воздействие некоторых наночастиц приводит к апоптозу клеток и аберрантной экспрессии импринтированных генов в клетках Сертоли TM-4. Эти данные демонстрируют, что аномальная экспрессия импринтированных генов может быть основным механизмом для наночастиц, вызывающих репродуктивную токсичность [23]. Кроме того, в нашем предыдущем исследовании in vivo некоторые факторы окружающей среды, такие как эндокринные разрушители, также способствуют фенотипу или болезненному состоянию не только у индивидуума, подвергшегося воздействию, но и у последующих поколений потомства. Эпимутации в зародышевой линии, которые становятся постоянно запрограммированными, могут позволить передачу эпигенетических фенотипов трансгенерации [19]. Целью этого исследования было изучить изменения, вносимые SiO ₂ в эпигенетическое состояние. Обработка NP на мышиной модели, чтобы заложить механистическую основу трансгенерационных эффектов у мужчин.

Эпигенетическое состояние - это термин, используемый для определения химических модификаций, которые происходят в геноме без изменения последовательности ДНК [24]. Эпигенетические механизмы, включая метилирование ДНК, импринтированные гены, модификации гистонов и экспрессию некодирующей РНК, могут влиять на геномную функцию в экзогенной среде [25]. Насколько нам известно, наше исследование является первым исследованием SiO ₂ НЧ вызывают токсичность для легких и семенников на эпигенетическом уровне.

Сначала мы исследовали острую токсичность SiO ₂ НЧ в клетках A549, линии эпителиальных клеток легких человека. Однако наши результаты на экспериментальных мышах выявили повреждение ламинарных эпителиальных клеток легких типа II и повреждение митохондриального гребня яичек после контакта с SiO ₂ НЧ в концентрациях в окружающей среде [26]. Чтобы лучше понять механизм патологии легких и яичек, мы экспрессировали импринтированные гены. Геномный импринтинг относится к подавлению одного родительского аллеля в зиготах гамет в зависимости от родителя происхождения; это молчание происходит посредством эпигенетических процессов, таких как метилирование ДНК и / или модификация гистонов [27]. Предыдущие исследования показали, что экспрессия импринтированного гена в домене Dlk1 / Dio3 важна для роста плода [28], времени полового созревания человека [29] и предрасположенности к метаболическим заболеваниям [30]. Исследования показали, что IG-DMR диктует статус аллельного метилирования DMR промотора Gtl2, который затем контролирует экспрессию генов во всей области Dlk1 / Dio3 [17]. Основная функция этой импринтированной контрольной области состоит в наследовании метилирования ДНК, управляемого зародышевыми клетками, в качестве гаметического сигнала, а затем в поддержании последующих паттернов аллель-специфичного метилирования ДНК в соматических клетках [31]. Наше исследование показало, что SiO ₂ НЧ вызывают изменения экспрессии области Dlk1 / Dio3 как в тканях легких, так и в тканях семенников. В области Dlk1 / Dio3 отцовские экспрессируемые гены ( Dlk1 , Rtl1 и Dio3 ) особенно ненормальны по сравнению с контролем после лечения NP. Результаты секвенирования бисульфита показывают разные уровни гипометилирования в легких и яичках. Состояние метилирования IG-DMR обычно ниже в обработанных тканях, и это гипометилирование может представлять механизм дифференциальной экспрессии импринтированных генов.

Выводы

В заключение, наши результаты показывают, что SiO ₂ Воздействие NP может вызывать важные изменения метилирования ДНК, которые запускают клеточное повреждение, и эти изменения очень важны для экспрессии импринтированного кластера генов Dlk1 / Dio3. Важно отметить, что изменения в метилировании ДНК влияют как на ткани легких, так и на ткани семенников. Эти результаты сыграют важную роль в наших будущих исследованиях, посвященных изучению эпигеномных эффектов наночастиц, унаследованных потомками экспонированных моделей, и выяснению молекулярных механизмов, которые опосредуют такие эпигенетические изменения.

Сокращения

BALF:

Жидкости для бронхоальвеолярного лаважа

CCK-8:

Набор для подсчета клеток-8

DMR:

Дифференциально метилированные области

EGFR:

Рецептор эпидермального фактора роста

IG-DMR:

Межгенный DMR

депутаты:

Микрочастицы

НП:

Наночастицы