Костные морфогенные белки-2 (rhBMP2) - загруженные каркасы из фиброина шелка для повышения остеоиндуктивности в инженерии костной ткани

Фон

Регенеративная способность кости позволяет самостоятельно восстанавливать небольшие переломы костей. Формируется кость с последующим сращением и, наконец, восстановлением первоначальной формы и формы кости. Однако эта способность ограничена, и это создает потребность в аутотрансплантатах или аллотрансплантатах для лечения [1]. Аллотрансплантация предполагает получение кости от отдельного донора, что может вызвать иммунологическую реакцию. Аутотрансплантация, при которой кость берется из собственного тела пациента, не создает иммунологических проблем, но ограничивается достаточным количеством доступных костей [2,3,4].

Тканевая инженерия рассматривается как потенциальная технология для преодоления иммунологических ограничений аллотрансплантации и аутотрансплантации. С помощью тканевой инженерии специализированные клетки, такие как мезенхимальные стволовые клетки человека или клетки остеосаркомы (MG63), культивируются в подходящей среде на предварительно изготовленном каркасе, и эта система клеток и каркаса затем используется в качестве трансплантата [5, 6]. / P>

Каркас используется для закрепления клеток и обеспечения биохимической ниши для выживания и размножения. Несколько свойств, а именно. При выборе материала для изготовления каркаса необходимо учитывать механическую прочность, остеоиндукцию, биорезорбцию, градуированную пористость и биосовместимость. Остеоиндукция (индукция образования кости) - одно из необходимых свойств материала, который будет использоваться при изготовлении каркаса инженерии костной ткани (BTE) [7]. Каркасы с остеогенными факторами могут имитировать процесс регенерации костной ткани, который сочетает ангиогенез и остеогенез, который может привлекать клетки-предшественники и их дифференциацию. Костные морфогенные белки (BMP) представляют собой класс факторов роста, которые индуцируют образование кости и предлагаются для применения заушных нервных клеток вместе с деминерализованным костным матриксом (DBM) и фосфатом кальция [8,9,10].

Несколько групп сообщили об использовании металлов, керамики, синтетических полимеров и композитов, а также фиброина шелка в качестве потенциальных материалов для изготовления каркасов в BTE. Сообщается, что фиброин шелка (SF) является подходящим материалом для изготовления каркасов для применения в тканевой инженерии благодаря его замечательным механическим и биосовместимым свойствам [5]. До настоящего времени не было опубликовано ни одного отчета, в котором оценивались бы ассоциативные преимущества BMP с нанопряденными нано-пластинами SF.

Здесь мы сообщаем о создании новых рекомбинантных человеческих морфогенных белков кости-2 (rhBMP2) -конъюгированных SF электроспрядных нановолоконных каркасов. Каркасы сравнивали с каркасами из чистого SF, чтобы выяснить влияние конъюгации rhBMP2 на остеоиндукцию. Также были измерены жизнеспособность клеток и свойства пролиферации клеток, чтобы установить эффективность каркаса для новых и более эффективных приложений инженерии костной ткани.

Методы

Приготовление водных растворов SF / BMP2

Сначала SF был выделен из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori . , в виде водного раствора. Установленный протокол был соблюден с небольшими изменениями [11]. Коконы кипятили в 100 мл 0,02 М Na ₂ . CO ₃ в течение 20 минут, а затем тщательно промойте дистиллированной водой, чтобы удалить излишки водорастворимого серицина и воска. Затем экстрагированный фиброин растворяли в 9 М растворе бромида лития при 60 ° C в течение 4 часов и дополнительно подвергали диализу против воды в течение 4 дней. Конечная концентрация была определена путем взвешивания сухого вещества после сушки и составила 7% w / v . Этот раствор затем использовали после концентрирования до различных уровней диализом против 1 л 25% полиэтиленгликоля (ПЭГ, 10 000 г моль ^-1 ) раствор при комнатной температуре. Разбавленные водные растворы SF готовили разбавлением дистиллированной водой, и все растворы хранили при 10 ° C до дальнейшей обработки. Лиофилизированный порошок рекомбинантного морфогенного белка-2 человеческой кости (rhBMP2) растворяли в PBS (pH 3,8). Белковый раствор стерилизовали шприцевыми фильтрами 0,22 мкм и добавляли в виде водного раствора к каждому раствору фиброина при непрерывном перемешивании. Опосредованное глутаральдегидом сшивание использовали для связывания BMP с фиброином. Вкратце, для 10 мл реакционной смеси по 5 мл каждого из 6% фиброина шелка и 1% rhBMP2 были сшиты с использованием 200 мкл глутаральдегида и 40 мкл 12 н. HCl в качестве агента, активирующего группу. С помощью этой процедуры были приготовлены три раствора:(i) 3% фиброина шелка без rhBMP2 (SF), (ii) 3% фиброина шелка с 0,5% rhBMP2 (SF + rhBMP2) и (iii) 12% фиброина шелка с 0,125% rhBMP2, как в (ii) (4SF + rhBMP2). Эти растворы использовались в процедурах электроспиннинга для изготовления каркасов.

Изготовление каркаса методом электропрядения

Для изготовления каркасов каждый раствор загружали в стеклянный шприц объемом 5 мл с иглой из нержавеющей стали (25G, внутренний диаметр 0,26 мм, Sigma Aldrich), которая была подключена к источнику постоянного тока 5,5 кВ. Для подготовки волокон скорость потока на выходе поддерживалась на уровне 0,4 мл / ч ^-1 . с использованием шприцевого насоса, и электроспряденные волокна собирали на алюминиевой фольге на расстоянии 15 см от кончика капилляра. Образцы собирали по 4 часа каждый.

Сканирующая электронная микроскопия

Для морфологического исследования подготовленных матриксов проводили СЭМ с использованием Zeiss EVO40SEM. Образцы были покрыты золотом напылением перед дальнейшей обработкой изображений сканирования. Диаметр волокна определяется путем усреднения диаметров 10 случайных волокон в кадре изображения.

Механические свойства строительных лесов

Эксперименты на сжатие были проведены для оценки механических свойств разработанных каркасов с использованием настольного электромеханического тестера Instron с одной колонкой (модель 3345, Instron, Canton, MA). Волокна диаметром 0,2 мм, полученные путем электроспиннинга в течение более длительного периода, были использованы для определения прочности на разрыв и удлинения при разрыве по кривым напряжения-деформации при 25 ° C и влажности 50%.

Исследование набухания

Для измерения степени набухания каждый состав растворяли в PBS (pH 7,4) при 37 ° C. Образцы отбирали через заранее определенные промежутки времени, и сухой вес измеряли с помощью электронных весов. Испытание продолжали до достижения равновесного веса. Коэффициент набухания был выражен следующим образом:

где, W _о =исходная сухая масса нановолоконных матриц и W _s =вес набухших нановолоконных матриц в каждый момент времени.

Культура клеток

Мезенхимальные стволовые клетки человека (hMSC) были использованы в настоящем исследовании для оценки остеоиндуктивного потенциала изготовленных нано-каркасов. hMSC культивировали и поддерживали в среде DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой и 1% пенициллина при 37 ° C в 5% CO ₂ достигнута увлажненная атмосфера до 90% слияния. Затем клетки трипсинизировали, центрифугировали и повторно суспендировали в среде для количественного определения.

Каркасы стерилизовали промыванием этанолом и облучением УФ-светом в течение 30 мин, а затем промывали PBS (pH 7,4). Перед посевом клеток каркасы обрабатывают DMEM. К каждому каркасу и пластиковой пленке, служащим контролем, по каплям добавляли 20 мкл клеточной суспензии. Каркасы хранили в состоянии покоя во влажной атмосфере (37 ° C, 5% CO ₂ ) в течение 30 мин. Затем каркасы инкубировали в среде DMEM в течение 21 дня с регулярным пополнением среды через день.

Анализ клеточной адгезии

Чтобы оценить способность клеток к адгезии с каркасом, количество неадгезированных клеток подсчитывали через 1, 3 и 6 часов первоначального посева в соответствии с методом, описанным в литературе с небольшими изменениями [6]. Клеточную среду собирали, и подсчет клеток производили с помощью гемоцитометра. Разницу между начальным количеством посевов и количеством неприлипших клеток считали количеством прикрепившихся клеток. Результаты были выражены в процентах адгезии согласно следующему уравнению:

Анализ цитотоксичности

Для измерения токсического действия нановолоконных матриц был проведен анализ МТТ. По истечении соответствующего периода времени конструкции инкубировали в растворе МТТ (1 мг / мл ^-1 маточный раствор разбавляют PBS (pH 7,4) в соотношении 1:10) и инкубируют в течение 4 ч. Жизнеспособные клетки превращают МТТ в соль формазана в течение этого инкубационного периода. Соль формазана растворяли добавлением ДМСО и оставляли на 20 мин. Оптическую плотность, обусловленную солью формазана, количественно измеряли путем регистрации изменений оптической плотности при 570 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

Анализ пролиферации клеток

Анализ восстановления красителя аламаровым синим (AB) проводили для определения пролиферации клеток внутри каркаса. Каркасы инкубировали в красителе, разбавленном DMEM, в течение 4 ч, и восстановление красителя измеряли спектрофотометрически. Процент снижения АБ рассчитывался как:

где, ελ ₁ =молярный коэффициент экстинкции аламарового синего при 570 нм и ελ ₂ =молярный коэффициент экстинкции аламарового синего при 600 нм в окисленном ( ε _бык ) и приведенное ( ε _{красный} ) формы. А λ ₁ и A λ ₂ обозначает оптическую плотность тестовых лунок.

A ’ λ ₁ =поглощение лунки отрицательного контроля при 570 нм.

A ’ λ ₂ =поглощение лунки отрицательного контроля при 600 нм.

Анализ ALP

Продукция щелочной фосфатазы (ЩФ) культивированным hMSC внутри каркаса измерялась в соответствии с протоколом производителя в наборе [12]. Вкратце, стерильный PBS (pH 7,4) использовали для промывки и инкубации каркасов с последующей гомогенизацией с 1 мл Трис-буфера (1 M, pH 8,0) и обработкой ультразвуком в течение 3 минут на льду. Затем 25 мкл лизата инкубировали с 1 мл раствора п-нитрофенилфосфата (16 мМ) при 30 ° C в течение 5 мин. Спектрофотометрические измерения выполняли при 405 нм, чтобы контролировать производство п-нитрофенола в присутствии ALP.

Активность ЩФ in vivo

Были взяты девять самцов бестимусных голых крыс, весом 100–120 г каждая, и разрезаны с двух сторон брюшные мышцы для создания мешочков. Модель голых мышей использовали для демонстрации остеоиндуктивного потенциала каркаса in vivo. По одному из трех типов каркасов (5 мм × 5 мм) вырезали и упаковывали в мышечные карманы отдельно. Затем пакет закрывали нерассасывающейся нитью. После 14 дней операции имплантаты были извлечены путем иссечения прямых мышц живота и сохранены в PBS. Лоскуты мышц вырезали и получали ткань эксплантата, которую гомогенизировали в буфере для экстракции для высвобождения щелочной фосфатазы. 50 мкл аликвоты раствора использовали для измерения активности ЩФ.

Статистический анализ

Все эксперименты были выполнены в трех экземплярах, и представленные данные форматированы как среднее ± стандартное отклонение (SD) образцов, если не указано иное. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) был выполнен с использованием статистического программного обеспечения Origin 6.0, чтобы оценить неопределенные различия и значимые различия. P значение 0,05 или меньше означает значительные различия между исследуемыми группами.

Результаты

Морфология каркаса

СЭМ-изображения (рис. 1) изготовленного каркаса выявили мелкопряденную нановолоконную структуру. Средние диаметры волокон в каркасах SF и SF + BMP2, по-видимому, схожи и находятся в диапазоне от 100 до 900 нм при всех концентрациях, поскольку установлено, что диаметр зависит от времени, в течение которого проводилось электроспиннинг [13], в то время как SF нановолокна оказались однородными, а конъюгация BMP2 приводила к неоднородности диаметра волокна. Размер пор каркасов оказывается однородным в изготовленных каркасах и не зависит от концентрации фиброина. Концентрация SF существенно не влияет на размер пор [11].

СЭМ-микрофотографии подготовленных матриц. а SF. б SF + rhBMP2. c 4SF + rhBMP2

Механические свойства строительных лесов

Кривые напряжение-деформация нановолоконных каркасов представлены на рис. 2. Было замечено, что добавление BMP не изменяет механические свойства каркасов SF, но с увеличением концентрации производственного материала (SF) свойства матриц при растяжении улучшаются. . Это может быть связано с образованием межволоконных связей во время сшивания. Таким образом, волокна SF с низкой концентрацией не обладают лучшей механической прочностью по сравнению с волокнами с более высокой концентрацией.

Зависимость напряжения от деформации в электропряденых нановолокнах. Взаимосвязь напряжение-деформация сравнивалась между (а) SF, (b) SF + rhBMP2 и (c) каркасом 4SF + rhBMP2

Исследование набухания

Коэффициенты набухания как функция времени для каркасов были представлены на рис. 3. Каркасы хорошо набухали с течением времени равномерно вначале и достигали равновесия примерно через 380 мин. Связанные с rhBMP2 волокна поглощали больше воды по сравнению с каркасами, состоящими только из SF, что указывает на увеличение гидрофильных карманов из-за ассоциации BMP2. Волокна SF уравновешивались примерно на 70%, тогда как волокна, содержащие BMP2, уравновешивались примерно 81% воды.

Набухание изготовленных каркасов. Изменения набухания каркаса SF наблюдались после модификации SF + rhBMP2 и 4SF + rhBMP2

Анализ клеточной адгезии

Прикрепление клеток к каркасу необходимо для роста клеток и индукции для дифференцировки. В этом исследовании мы наблюдали, что hMSC хорошо прилипали к каркасу, а прилипание hMSC к каркасу 4SF-BMP2, SF-BMP2 и SF было представлено на рис. 4.

Гистограмма, представляющая процент прилипания в зависимости от времени для трех временных точек. Изменения уровня адгезии в (а) SF, (b) SF + rhBMP2 и (c) каркасе 4SF + rhBMP2

Существовала проблема потери сцепления смешанного каркаса, которая была исключена из наблюдаемых результатов. Смешивание с BMP2 не снижает адгезионную способность каркаса. Как видно из фиг. 3, было хорошо понятно, что с увеличением размера пор (уменьшением концентрации SF) адгезия клетки к каркасу увеличивается. ANOVA среди трех составов значительно различает вариации на 3-м и 6-м часах. Однако в течение первого часа существенной разницы не наблюдалось.

Анализ цитотоксичности и анализ пролиферации клеток

Жизнеспособность клеток была значительно увеличена в каркасах, конъюгированных с rhBMP2, и сконструированные каркасы не вызывают каких-либо цитотоксических эффектов по отношению к рассматриваемым клеткам-гостям (рис. 4), и клетки хорошо пролиферировали во всех каркасах, сравнительно с рис. тенденция к увеличению жизнеспособности с увеличением количества дней, и каркас SF + BMP2 проявлял наименьшую токсичность в каждый момент времени. ANOVA выявил значительную разницу между значениями жизнеспособности клеток трех рассматриваемых препаратов.

Анализ жизнеспособности клеток в виде гистограммы для четырех временных точек. Анализ жизнеспособности клеток был выполнен с помощью анализа МТТ, и результаты представлены в процентах относительно контроля

На рис. 6 можно исследовать пролиферацию клеток. Клетки хорошо пролиферировали во всех трех препаратах каркаса с наилучшими показателями SF + BMP2 в каждый момент времени. Более крупные поры в каркасе SF + BMP2 обеспечивали максимальное пространство для роста клеток. Значимость различий между группами была хорошо установлена ​​с помощью дисперсионного анализа.

Представление пролиферации клеток в виде процента уменьшения содержания красителя аламарова синего в четырех временных точках для SF, SF + BMP2 и 4SF + BMP2

Анализ ЩФ

Активность ЩФ является стандартным маркером остеоиндуктивного свойства среды вокруг клетки [13]. В нашем эксперименте мы наблюдали более высокую активность ALP в конструкциях SF + BMP2 по сравнению с конструкциями, содержащими только SF (фиг. 7). Наноструктурированные каркасы SF также были способны проявлять только остеоиндукцию, но, как видно из рис. 7 и ANOVA, каркас SF + BMP2 оказался лучшим среди рассматриваемых каркасов. Концентрация ЩФ была увеличена с течением времени эксперимента, и конструкции с более высокой концентрацией СФ, однако, проявляли более низкую активность ЩФ по сравнению с конструкциями с более низкой концентрацией СФ.

Представление активности ЩФ среди трех различных стратегий изготовления каркаса в разные моменты времени. (a) SF (b) SF + rhBMP2 (c) каркас 4SF + rhBMP2

Активность ЩФ in vivo

Фиг. 8 изображает активность ALP эксплантов в отношении (а) SF, (b) SF + rhBMP2 и (c) 4SF + rhBMP2. Как и ожидалось, эксплантаты после обработки, содержащие rhBMP2, индуцировали более высокую активность ЩФ, в то время как мыши, обработанные каркасом без rhBMP2, вырабатывали более низкую активность ЩФ.

Активность ЩФ in vivo эксплантов, полученных после обработки. Модель голой мыши использовалась для демонстрации остеоиндуктивного потенциала каркаса in vivo

Обсуждения

Тканевая инженерия на основе каркасов доказала свой потенциал в регенеративной медицине и стала свидетелем впечатляющих успехов в качестве инструмента для BTE. Предыдущие исследования установили решающую роль микроархитектуры и физических свойств структур в трансляции созданных in vitro конструкций клеточного каркаса в костную ткань [14,15,16].

Оптимальные механические свойства (размер пор, прочность на разрыв и т. Д.) И биосовместимость конструкций являются потенциальными характеристиками, которые следует учитывать при колонизации и организации клеток [17]. Представленная работа описывает изготовление и характеризацию каркаса для инженерии костной ткани с использованием комбинации полезных свойств материалов, предложенных для этого. В то время как SF обеспечивает достаточно прочную и биосовместимую платформу, встроенный rhBMP2 индуцирует образование новых остеоцитов. SF интенсивно изучается несколькими группами в различных препаратах для пролиферации остеобластических клеток [18] и регенерации тканей, включая связки, сухожилия, хрящи, кости, печень, кожу, трахею, роговицу, нервы, барабанную перепонку и мочевой пузырь [19, 20].

Мы использовали водные растворы SF и SF + rBMP2 для нашего исследования, поскольку водные растворы предпочтительнее органических растворителей для приготовления растворов SF, поскольку разложение SF в органических растворах неблагоприятно [18]. Ранее сообщалось, что волокна SF Electrospun имеют однородную структуру волокон с одинаковым диаметром, а сетка является высокопористой с взаимосвязанными и перекрестно связанными порами, что также находится в хорошем соответствии с нашим исследованием [21, 22]. Не было наблюдений образования бусообразных структур в волокнах SF в наших каркасах и ранее описанных [21]. Ранее сообщалось, что диаметр чистого SF-волокна уменьшается с увеличением смеси [11, 21]; однако мы не наблюдали потери диаметра из-за смешения. Но однородность волокна была нарушена в смешанных волокнах, возможно, из-за неравномерного связывания rBMP2 с волокнами SF.

Достаточная механическая прочность - это свойство, необходимое для тканевого каркаса. Смешивание чистого SF увеличило гибкость нановолокна в нашем эксперименте, и предыдущие отчеты также показали аналогичную тенденцию в улучшении механических свойств при смешивании SF с другими материалами для получения пригодных для использования смешанных биоматериалов [21, 23]. Таким образом, наши изготовленные каркасы обладают необходимой механической прочностью и гибкостью, которые требуются в тканевой инженерии.

Каркасы для тканевой инженерии должны иметь возможность прикреплять клетки поверх них, должны способствовать пролиферации и остеоиндукции клеток и должны быть наименее цитотоксичными для лучшей переносимости. Более ранние отчеты о каркасах SF показали его нецитотоксическую и клеточно-пролиферативную активность [21, 24], и наши исследования полностью согласуются с ранее опубликованными результатами.

Благодаря своим остеоиндуктивным свойствам, rhBMP2 используется в инженерии костной ткани несколькими группами [25,26,27]. Эти исследования показали, что клетки, культивируемые на BMP2-содержащих каркасах, обладают более высокой активностью ЩФ, биомаркером остеоиндукции. Эффект ассоциации BMP2 лучше различался по мере того, как время инкубации прогрессировало. Kim et al. использовали пористые микросферы, связанные с BMP2, и наблюдали аналогичное усиление остеоиндукции [25].

Выводы

Мы успешно изготовили волокнистые каркасы на основе SF, содержащие rhBMP2. Эти каркасы были гомогенными и, как было обнаружено, обладали адекватными механическими свойствами и биосовместимостью. Дальнейшая ассоциация rhBMP2 связана с остеоиндуктивным потенциалом изготовленных каркасов. Каркасы были дополнительно оценены для применения in vivo и признаны подходящими для применения с использованием инженерии костной ткани.

Сокращения

ALP:

Щелочная фосфатаза

BTE:

Инженерия костной ткани

hMSC:

Мезенхимальные стволовые клетки человека

rhBMP2:

Рекомбинантный костный морфогенный белок-2 человека

SF:

Фиброин шелка