ROS-чувствительный пиперлонгумин-элюирующий GI стент: новая нановолоконная стратегия для подавления холангиокарциномы

Аннотация

Предыстория

Мы спроектировали лекарственно-элюирующий желудочно-кишечный (GI) стент, высвобождающий пиперлонгумин (PL) через чувствительные к реактивным кислородным видам (ROS) нановолоконные маты. PL-нагруженные маты разработаны для обеспечения локализованного, ROS-триггерного антиракового эффекта против клеток холангиокарциномы (CCA).

Методы

Мы синтезировали диселенид-связанный блок-кополимер (LEse) конъюгацией селеноцистамина к метокси-поли(этиленгликоль) (MePEG) и затем к поли(лактиду) (PLA). Электропрядением смесей поли(ε-капролактона) (PCL) и LEse в различных соотношениях мы произвели PL-содержащие нановолоконные маты. Эти маты покрыли силиконовой мембраной покрытый билиарный стент. Оценивали in vitro высвобождение лекарства, ROS-чувствительность и антираковиту активность, за которым следовало in vivo исследование ксенографта HuCC-T1.

Результаты

Нановолокна с более высоким содержанием LEse демонстрировали ROS-триггерное ускорение высвобождения PL, в то время как PCL-только маты показывали минимальную чувствительность. PL, высвобожденный из матов, сохранял мощную цитотоксичность против нескольких линий CCA клеток, индуцировал генерацию ROS и способствовал апоптозу. В мышах с ксенографтом HuCC-T1, PL-элюирующий стент значительно ингибировал рост опухоли и увеличил экспрессию каспазы-3/9 по сравнению с контролями.

Заключение

LEse-чувствительные нановолоконные маты успешно превратили обычный GI стент в ROS-чувствительную локально действующую антираковиту платформу. Эта стратегия предлагает перспективный таргетированный подход для лечения неоперабельной холангиокарциномы.

Предыстория

Холангиокарцинома (CCA) возникает из эпителия желчного протока и относится к наиболее агрессивным злокачественностям, с растущей инцидентностью во всем мире. Поскольку большинство пациентов обращаются на поздних стадиях, хирургическая ресекция редко выполнима, а конвенциональные терапии — лучевая терапия, системная химиотерапия и металлическое стентирование — дают ограниченную пользу. Установка стента необходима для облегчения желчной обструкции, однако металлические стенты лишены куративных свойств и склонны к нарастанию опухоли, побуждая исследования лекарственно-элюирующих стентов (DES). Ранние испытания DES с паклитакселем, сорафенибом ивориностатом показали скромные улучшения проходимости стента и ингибиции опухоли, однако куративный эффект остается недостижимым.

Стимуло-чувствительные наноматериалы, особенно ROS-чувствительные системы, стали мощными платформами доставки лекарств для раковой терапии. Диселенидные связи в полимерах деградируют в оксидативной микросреде опухоли, запуская быстрое высвобождение лекарства. Пиперлонгумин (PL), натуральный алкалоид из Piper longum, селективно повышает ROS в раковых клетках, индуцируя ДНК-повреждение и апоптоз, щадя нормальные ткани. Однако быстрый системный клиренс и почечная токсичность PL требуют локализованной доставки.

Мы поэтому изготовили редокс-чувствительное PL-нагруженное нановолоконное покрытие для GI стента, используя ROS милйе опухоли для достижения по запросу высвобождения лекарства и мощной антираковитой активности.

Материалы и методы

Материалы

PL (LKT Labs, MN, США), PLA (Mw ≈ 5 кДа, Wako), MePEG-NHS (Mw ≈ 5 кДа, Sunbio), селеноцистамин (Sigma-Aldrich), PCL (Mw ≈ 80 кДа, Sigma-Aldrich) и другие реактивы были аналитического чистоты. Силиконово-мембранно покрытый билиарный стент (1 см × 10 см) получен от M.I. Tech (Пхентак, Корея).

Синтез LEse блок-кополимера

MePEG-NHS реагировали с избытком селеноцистамина в DMSO, за чем следовала диализ (MWCO 1 кДа) и лиофилизация. Полученный MePEG-селеноцистамин затем связывали с PLA через EDAC/NHS химию, давая LEse блок-кополимер (выход > 94%). ¹H-NMR подтвердил характерные пики при 1,7 ppm и 2,9 ppm (селеноцистамин) и 3,5–3,7 ppm (MePEG). GPC анализ дал Mn ≈ 8,2 кДа и Mw ≈ 9,5 кДа.

Подготовка PL-нагруженных нановолоконных матов и покрытия стента

PL растворяли в ацетоне (10 мг/мл). LEse (100–400 мг) и PCL (600–900 мг) добавляли, перемешивали 2 ч и электропрядили на стент (15 кВ, 100 мкл/мин, 500 об/мин). Покрытый стент вакуумно сушили 24 ч и хранили при 4 °C.

Исследования загрузки и высвобождения лекарства

Содержание лекарства квантифицировали УФ-Виз при 325 нм после растворения 5 мг матов в DMSO. Высвобождение мониторили в ФСБ (0,01 М, pH 7,4) при 37 °C с и без 10 мМ H₂O₂. Образцы забирали в заданных интервалах и анализировали УФ-Виз.

Клеточное культивирование и антираковиты тесты

Человеческие линии CCA (SNU-478, SNU-245, SNU-1196, HuCC-T1) культивировали в RPMI-1640 с 10% ФКС. Клетки обрабатывали PL, высвобожденным PL (день 5 или 15) или средой для 48 ч, и жизнеспособность оценивали MTT. IC₅₀ значения рассчитывали.

Измерение ROS

DCFH-DA флуоресценция (485 нм/535 нм) квантифицировала внутриклеточный ROS после 6–12 ч экспозиции PL или высвобожденному PL.

Вестерн-блоттинг

Клетки лизировали 24 ч пост-обработки, белковые экстракты (50 мкг) разделяли SDS-PAGE, переносили на PVDF и пробировали для BAX, каспазы-3/7/9 и клеавд PARP. Бенды визуализировали хемилюминесценцией и квантифицировали ImageJ.

In vivo ксенографтовая модель опухоли

BALB/c голые мыши получали субкутанно клетки HuCC-T1 (1 × 10⁶ клеток). Когда опухоли достигали 4–5 мм, PL-нагруженные или пустые нановолоконные диски (10 мг PL кг⁻¹) имплантировали под опухоль. Объемы опухоли измеряли каждые 5 дней, рассчитывали как V = (a × b²)/2. Все процедуры одобрены PNUIACUC (Approval No. PNU-2017-1608).

Иммуногистохимия

Опухолевые срезы окрашивали для каспазы-3 и каспазы-9 стандартными протоколами. Интенсивность окраски оценивали качественно.

Статистический анализ

Данные анализировали Стьюдентовским t-тестом; p < 0,05 считалось значимым.

Результаты

Характеристика полимера

LEse блок-кополимер успешно синтезирован, как подтверждено ¹H-NMR и GPC. Соотношения смеси PCL к LEse варировали для оптимизации волоконной морфологии и высвобождения лекарства.

Морфология нановолокон и загрузка лекарства

FE-SEM изображения раскрыли, что чистый PCL давал тонкие равномерные волокна, тогда как добавление LEse индуцировало гранулы и неправильности при более высоких загрузках (≥ 50% LEse). Оптимальные маты (60% LEse) сохраняли приемлемую волоконную морфологию и включали PL при теоретических загрузках (~10% масс.).

ROS-чувствительное высвобождение лекарства

Высвобождение PL было устойчивым в течение 25 дней, с взрывной фазой до 4 дней. Составы матов с более высоким LEse ускоряли высвобождение, особенно в присутствии H₂O₂, подтверждая ROS-чувствительность. PCL-только маты демонстрировали пренебрежимую чувствительность.

In vitro антираковита активность

Высвобожденный PL с дня 5 и дня 15 сохранял цитотоксичность, сравнимую со свежерастворенным PL по всем линиям CCA, со значениями IC₅₀ лишь незначительно выше. ROS тесты показали, что и PL, и высвобожденный PL индуцировали значительный внутриклеточный ROS. Вестерн-блоттинг продемонстрировал повышенную экспрессию BAX, каспазы-3/7/9 и клеавд PARP, указывая на индукцию апоптоза.

In vivo эффективность

В ксенографтовой модели HuCC-T1, PL-нагруженные стенты снизили объем опухоли до трети от контроля и усилили экспрессию каспазы-3/9, тогда как пустые стенты или средство не имели эффекта.

Обсуждение

Повышенные ROS в микросреде опухоли как триггерят PL-индуцированную апоптоз, так и ускоряют высвобождение из диселенид-связанных нановолокон, создавая синергетический локализованный терапевтический эффект. Это двойное действие смягчает системное воздействие и решает проблемы конвенциональных DES, лишенных опухоль-таргетированного высвобождения.

Заключение

Мы продемонстрировали, что ROS-чувствительное PL-нагруженное нановолоконное покрытие на GI стенте эффективно доставляет антираковиту терапию к холангиокарциноматозным опухолям in vitro и in vivo. Эта платформа предлагает перспективную стратегию для локального контролируемого лечения неоперабельной CCA.