Оценка безопасности липосомных наноносцев, доставляемых внутрибарабанно в внутреннее ухо крыс

Аннотация

Липосомные наноносцы (ЛНН) обеспечивают высокую загрузку лекарства и эффективное поглощение во внутреннем ухе после минимально инвазивной внутрибарабанной доставки. Однако их биосовместимость в этом чувствительном органе не была систематически оценена. В этом исследовании ЛНН — с или без гадолиниевой тетраазациклододекантетрауксусной кислоты (Gd-DOTA) — были транстимпанически введены в крыс линий Sprague-Dawley. Gd-усиленная МРТ (Gd-МРТ) отслеживала распределение ЛНН и оценивала целостность барьеров, а слушковые стволовые ответы (ABR) измеряли слуховую функцию. Воспалительные маркеры (гlicosаминогликаны, гиалуроновая кислота, CD44, TLR2) и апоптоз (TUNEL) количественно определяли в тканях улитки. Результаты показали эффективное проникновение ЛНН во внутреннее ухо без нарушения среднеушных или внутреннеушных барьеров, отсутствие потери слуха и повышения воспалительных или апоптотических маркеров. Таким образом, транстимпаническая доставка ЛНН безопасна для улитки крысы и перспективна для лечения сенсориневральной потери слуха.

Введение

ЛНН — старейшая нанотерапевтическая платформа в клинике, успешно используемая для онкологии, инфекционных заболеваний, воспалений и боли. Их высокая грузоподъемность и доказанное поглощение во внутреннем ухе делают их привлекательными для ототерпии. Внутрибарабанное введение — рациональный целевой подход, ограничивающий системное воздействие, уже применяемый клинически при болезни Меньера и внезапной сенсориневральной потере слуха. Хотя предыдущие работы демонстрировали пептидо-функционализированные ЛНН, достигающие улитки, профиль безопасности ЛНН во внутреннем ухе — особенно касательно барьерной функции, воспаления и жизнеспособности клеток — оставался неизвестным. Это исследование заполняет этот пробел, оценивая биосовместимость ЛНН в внутреннем ухе крысы с помощью Gd-МРТ, ABR и комплексной гистологической аналитики.

Гиалуроновая кислота (ГК) — основной компонент внеклеточного матрикса, связывающий CD44 и TLR2/4, инициирующий воспалительные пути. Накопление ГК связано с повышением проницаемости и воспалением в различных тканях, включая улитку, где серебряные наночастицы (AgNP) ранее вызывали накопление ГК. Поэтому ГК, CD44 и TLR2 рассматривались как критические воспалительные маркеры в этом исследовании.

Целью было определить, нарушают ли внутрибарабанные ЛНН целостность барьеров внутреннего уха, индуцируют воспаление или вызывают потерю слуха. Gd-МРТ оценивала барьерную функцию, ABR измеряла слуховые пороги, и иммуноистохимия количественно определяла ГК, CD44, TLR2 и апоптотические фрагменты ДНК.

Результаты

ЛНН не вызвали функциональных изменений в улитке крысы

Gd-МРТ продемонстрировала, что ЛНН эффективно проникали в улитку, с сильным сигналом в вестинбулярной и барабанной лестницах в течение 3 ч после инъекции (рис. 2c-f). К 6 ч распределение сигнала стало однородным по всей улитке, указывая на полное уравновешивание (рис. 2e-f). Целостность гемато-перилимфатического и гемато-эндолимфатического барьеров оставалась нетронутой, что отражалось в сопоставимых интенсивностях сигнала между обработанными и необработанными ушами (таблица 1). ABR пороги для кликов и тоновых взрывов (2–32 кГц) не показывали значимого смещения на 2, 4 или 7 дней после инъекции, подтверждая сохраненную слуховую функцию (рис. 3).

ЛНН не индуцировали накопление гlicosаминогликанов в улитке крысы

Периодическая кислота-Шифф окраска не выявила увеличения гlicosаминогликанов по улиточным структурам (спиральный лимбус, костная стенка, полосатая сосудистая область) после лечения ЛНН или ЛНН-Gd по сравнению с контрольными деионизированной водой (рис. 5, 6). Количественный анализ подтвердил отсутствие статистически значимых различий (p > 0,05).

Незначительное влияние на секрецию гиалуроновой кислоты ЛНН

Иммунофлуоресценция обнаружила ГК преимущественно в спиральных ганглионных клетках, базальных клетках полосатой области, клетках наружной бороздки и эндотелиальных клетках капилляров (рис. 7). Хотя интенсивность ГК в фибробластах спиральной связки слегка снизилась после введения ЛНН или ЛНН-Gd, это изменение не привело к изменению барьерной проницаемости или потере слуха (рис. 8).

Экспрессия CD44 осталась неизменной после воздействия ЛНН

CD44-позитивные клетки были обильны в базальном слое полосатой области, спиральной связке, клетках Дейтерса и капиллярном эндотелии во всех группах, без значимых различий в интенсивности окраски или количестве клеток между обработанными и контрольными ушами (рис. 9, 10).

Экспрессия TLR2 не изменилась под воздействием ЛНН

TLR2 иммунореактивность была высока в базальных клетках полосатой области, фибробластах спиральной связки и эндотелии, но не отличалась между ушами, обработанными ЛНН, ЛНН-Gd и водой (рис. 11, 12).

Нет увеличения апоптоза улитки после введения ЛНН

TUNEL окраска выявила редкие апоптотические ядра, распределенные по всей улитке во всех группах, без повышения в когортах ЛНН или ЛНН-Gd по сравнению с контрольными (рис. 13). Случайная апоптоза, наблюдаемая в подковке стремени и нише овального окна, считается частью нормального клеточного обмена.

Обсуждение

Наши данные демонстрируют, что внутрибарабанные ЛНН эффективно достигают внутреннего уха, проходя через оба овального и круглого оконных пути, и делают это без ущерба для гемато-перилимфатического или гемато-эндолимфатического барьеров. Отсутствие смещения слуховых порогов и отсутствие воспалительных или апоптотических маркеров подтверждают, что ЛНН хорошо переносятся в улитке крысы. Незначительное снижение секреции ГК из фибробластов спиральной связки кажется клинически незначимым, вероятно отражая сдвиг к высокомолекулярной, антивоспалительной ГК без индукции изменений проницаемости. Эти выводы согласуются с предыдущими отчетами, что 95-нм ЛНН наиболее эффективны для доставки во внутреннее ухо, и что более крупные (110–115 нм) ЛНН все еще сохраняют безопасность.

Важно, что исследование подтверждает, что ЛНН не активируют воспалительную ось TLR2/CD44, ключевой путь, вовлеченный в повреждение улитки реактивными видами кислорода и митохондриальными токсинами. Следовательно, ЛНН представляют безопасный вес для целевой доставки лекарств во внутреннее ухо, поддерживая их потенциальное клиническое применение при сенсориневральной потере слуха и других отических состояниях.

Заключение

Внутрибарабанная доставка липосомных наноносцев безопасна для внутреннего уха крысы, сохраняя целостность барьеров, слуховую функцию и клеточную гомеостаз. ЛНН перспективны как платформа доставки лекарств для будущих терапий внутреннего уха.

Методы

Материалы

Липиды (сфингозин, SOPC, DSPE-PEG-2000), флуоресцентные красители (DiI, TRITC-DHPE), Gd-DOTA (DOTAREM) и серебряные наночастицы (AgNP) приобретали у коммерческих поставщиков. Чистота липидов проверяли тонкослойной хроматографией; концентрации определяли гравиметрически.

Подготовка и характеристика ЛНН

Однослойные ЛНН (~110 нм) инкапсулирующие 500 мМ Gd-DOTA (ЛНН-Gd) и пустые ЛНН (~115 нм) готовили ранее описанным методом гидратации тонкой пленки. Распределение размера и дзета-потенциал измеряли динамическим рассеянием света.

Введение ЛНН

Под изофлурановой анестезией 50 мкл ЛНН или ЛНН-Gd вводили транстимпанически в левое среднее ухо через операционный микроскоп. Противостоящее ухо получало деионизированную воду в качестве негативного контроля. Животные позиционировали с введенным ухом вверх на 15 мин после инъекции.

Оценка биологической барьерной функции с помощью Gd-МРТ

Gd-МРТ выполняли на сканере Bruker 4,7 Т с протоколом RARE. Контраст вводили внутривенно за 2 ч до визуализации. Временные точки визуализации варьировали от 5 ч до 8 дней после инъекции для улавливания острых и субакутных изменений.

Слуховые стволовые ответы (ABR)

ABR пороги для кликов и тоновых взрывов (2–32 кГц) регистрировали на базелайне, 2, 4 и 7 дней после инъекции с использованием стандартной электродной монтажной схемы и звукоизолированной камеры.

Гистологический и иммунофлуоресцентный анализ

После финального ABR улитки извлекали, декальцинировали и разрезали. Гемтоксилин-эозин и периодическая кислота-Шифф окраски оценивали воспаление и содержание гlicosаминогликанов. Иммунофлуоресценция для ГК, CD44 и TLR2 выполняли на криосекциях, и конфокальная визуализация количественно оценивала интенсивности сигналов. Апоптоз детектировали TUNEL маркировкой.

Статистический анализ

Данные анализировали с SPSS 20. Однофакторный ANOVA и тесты Краскелла-Уоллиса сравнивали смещения ABR и интенсивности окраски; пост-хок LSD тесты следовали за значимыми находками. p < 0,05 считалось значимым.

Аббревиатуры

ABR

Слуховые стволовые ответы

AgNP

Серебряные наночастицы

dH2O

Деионизированная вода

Gd-DOTA

Гадолиниева тетраазациклододекантетрауксусная кислота (DOTAREM)

Gd-MRI

Gd-усиленная магнитно-резонансная томография

ЛНН

Липосомный наноносец

ЛНН-Gd

Gd-DOTA-содержащий ЛНН

ROI

Область интереса

TLR

Толл-подобный рецептор