Биосовместимость липосомных наноносителей во внутреннем ухе крысы после интратимпанического введения

Фон

Липосомные наноносители (LPN) потенциально являются будущим терапии внутреннего уха из-за их высокой лекарственной нагрузки и эффективного поглощения во внутреннем ухе после минимально инвазивного интратимпанального введения [1,2,3,4]. Интратимпанальный подход хорошо воспринимается отологами как рациональный подход к целевой доставке лекарств, поскольку он позволяет избежать ненужного накопления терапевтических агентов в нецелевых областях, что было предыдущей стратегией в клинике для лечения болезни Меньера и внезапной нейросенсорной тугоухости. с использованием гентамицина и кортикостероидов. Молекулярное нацеливание модельных терапевтических средств на улитку было продемонстрировано интратимпанальным введением специфических пептидно-функционализированных LPN [5]. Кроме того, автоматическая устойчивая доставка LPN во внутреннее ухо через среднее ухо была достигнута с помощью нового устройства, состоящего из осмотического насоса и высокоэффективной полиимидной трубки [6]. Как старейшая нанотерапевтическая платформа в клинике, LPN безопасны при лечении рака, инфекционных заболеваний, воспалений, боли и т. Д. [7,8,9]. Однако биосовместимость LPN в среднем и внутреннем ухе остается неизвестной, и ее необходимо уточнить, прежде чем их можно будет применять в клинической отологии.

Ухо состоит из наружного, среднего и внутреннего ушей (рис. 1), которые могут подвергаться воздействию LPN после интратимпанальных родов. Среднее ухо - это первичный участок, который подвергается воздействию LPN в их самой высокой концентрации, внутреннее ухо является терапевтическим участком и наиболее чувствительным органом к опасным агентам, а наружный слуховой проход может быть раздражен агентами, истекающими из него. полость среднего уха. Биологические барьеры являются первой защитной системой, ограничивающей биодоступность агентов, и существуют в коже, слизистой оболочке и периневральных структурах. Барьерная система во внутреннем ухе играет решающую роль в поддержании ионного гомеостаза, который необходим для физиологической активности внутреннего уха. Функциональное изменение этих барьеров можно точно оценить с помощью магнитно-резонансной томографии с усилением гадолиния (Gd-MRI). Нарушение слуховой функции можно точно измерить по слуховой реакции ствола мозга (ABR). Таким образом, ухо (включая внешнее, среднее и внутреннее уши) само по себе служит отличной моделью для нанотоксикологии [10, 11].

Иллюстрация уха млекопитающих. Ухо млекопитающих (включая людей и крыс) состоит из наружного, среднего и внутреннего ушей. Наружное ухо ( OE ) состоит из ушной раковины и наружного слухового прохода ( EAC ). Среднее ухо ( ME ) состоит из барабанной перепонки ( TM ) и полость, в которой находится цепочка слуховых косточек, включая молоток ( Ma ), наковальня ( Inc ) и стремени. Полость среднего уха является продолжением носоглотки через евстахиеву трубу ( ET ) и связывается с внутренним ухом через овальное окно ( OW ) и круглой оконной мембраной ( RWM ). Внутреннее ухо состоит из улитки и вестибулярной системы. Улитка является сенсорным органом слуха и состоит из трех камер, то есть перилимфатических отделов барабанной лестницы ( ST ) и вестибульной лестницы ( SV ) и эндолимфатический отсек средней лестницы ( SM ). На боковой стенке СМ располагаются сосудистые полоски ( StrV ) и спиральной связки ( SLig ). Внизу SM находится орган кортиса, содержащий внутренние волосковые клетки ( IHCs ) и внешние волосковые клетки ( OHC ), текториальная мембрана ( TM ) и спиральный лимб ( Slim ). Клетки спирального ганглия ( SGCs ) запускают потенциал действия, соответствующий механо-электрической трансдукции волосковых клеток, и обеспечивают весь слуховой сигнал мозга. Вестибулярная система отвечает за баланс и состоит из трех полукружных каналов ( SCC ) и тамбур. Ампулярная купула внутри SCC определяет вращательные ускорения, а макула внутри мешочка и утрикулы преддверия определяет линейные ускорения. CN кохлеарный нерв, SP спиральный выступ, VN вестибулярный нерв, VS vas spiralis. (адаптировано из Цзоу Дж. Фокусная доставка лекарств в терапии внутреннего уха:в фокальной контролируемой доставке лекарств. Редакторы:Домб А.Дж. и Хан В. Спрингер, Лондон, Великобритания. ISBN:978-1-4614-9433-1, 2014; p215- 224)

Гиалуроновая кислота (гиалуронан) представляет собой полианионный биополимер природного происхождения и является основным компонентом внеклеточного матрикса базальной мембраны. Гиалуроновая кислота состоит из D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина, которые связаны чередующимися гликозидными связями β-1, 4 и β-1,3. Накопление гиалуроновой кислоты может способствовать увеличению проницаемости и воспалению микроциркуляции при ишемическом реперфузионном повреждении почек [12]. В нашем предыдущем отчете было показано, что ототоксический эффект наночастиц серебра коррелирует с накоплением гиалуроновой кислоты в улитке крыс [11]. Гиалуроновая кислота связывается с CD44 и толл-подобным рецептором 2/4 (TLR2 / 4) в ткани и запускает биологические реакции [13, 14]. Биологические активности, опосредованные CD44 при связывании с гиалуроновой кислотой, в основном проявляются через взаимодействие с регуляторными и адапторными молекулами, такими как киназы SRC, Rho GTPases, VAV2, связанный с рецептором фактора роста белок 2, связывающий белок 1 (GAB1), анкирин, и Эзрин [15,16,17]. CD44 также опосредует метаболизм гиалуроновой кислоты посредством подходов клеточного поглощения и деградации в дополнение к привлечению Т-клеток к участкам воспаления и регулированию опосредованного Т-клетками повреждения эндотелия [18]. Сообщалось, что цитотоксичность по отношению к эндотелиальным клеткам внутреннего уха антителами к эндотелиальным клеткам может играть роль в повреждении сосудистой полоски при иммуноопосредованной внезапной нейросенсорной глухоте [19]. TLR2-зависимая активация ядерного фактора-κB, как сообщается, вовлечена в нетипируемую индуцированную Haemophilus influenzae активацию хемотаксического белка 1 моноцитов в фиброцитах спиральной связки внутреннего уха, что может быть ключевым этапом дисфункции внутреннего уха, вторичной по отношению к хроническому среднему отиту [ 20]. Если LPN вызывают нарушение внутреннего уха после введения в среднее ухо, важным механизмом должен быть TLR2-опосредованный сигнальный путь.

Мы стремились оценить биосовместимость LPN во внутреннем ухе после транстимпанической инъекции. Функции биологических барьеров в коже (наружный слуховой проход), слизистой оболочке (полость среднего уха) и отделах внутреннего уха измерялись с помощью Gd-MRI в различные моменты времени. Слуховая функция оценивалась с помощью измерения ABR. Наконец, потенциальные гистопатологические изменения были проанализированы путем измерения накопления гликозаминогликанов и гиалуроновой кислоты, экспрессии CD44 и TLR2 и фрагментации ДНК в улитке.

Результаты

LPN не вызывали функциональных изменений в улитке крыс

В группе положительного контроля яркий сигнал в перилимфе улитки (Coch) и вестибулярном отделе (Vest) с обеих сторон (L, R) (рис. 2a, b) указывает на поглощение Gd-DOTA. После транстимпанических инъекций наночастиц серебра (AgNP) интенсивность сигналов в перилимфатических компартментах значительно увеличилась, в то время как чрезвычайно интенсивный сигнал также был обнаружен в коже наружного слухового прохода и слизистой оболочке среднего уха, что указывает на повышенное поглощение Gd-DOTA, связанное с введением AgNP ( L на рис. 2а, б) (таблица 1). Таким образом, система оценки была утверждена. У животного, получавшего транстимпаническую инъекцию LPN + Gd-DOTA, через 3 часа после инъекции был обнаружен яркий сигнал на поверхности цепи слуховых косточек, вестибульной лестницы, барабанной лестницы и преддверия, что указывает на очевидное распределение LPN в этих областях (рис. 2c). , г). Интенсивность сигнала в вестибульной лестнице в базальном повороте была заметно выше, чем в барабанной лестнице, что свидетельствует об эффективном поступлении LPN через овальное окно у текущего животного [21]. Через 6 ч после инъекции интенсивность сигналов между вестибулами и барабанной лестницей в базальном повороте стала аналогичной, и вся улитка показала почти однородный сигнал, но в преддверии изменений были незначительные (рис. 2e, f). У животных, получавших внутривенные инъекции Gd-DOTA после транстимпанальной инъекции холостых LPN, обе стороны демонстрировали одинаковую интенсивность сигналов, за исключением того, что были сильные сигналы в среднем ухе, получавшем транстимпанальную инъекцию холостых LPN, подозревая накопление LPN на поверхности цепи слуховых косточек (рис. . 2г, з). Черная дыра в цепочке слуховых косточек, указывающая на полость стремени (рис. 2h). Равная интенсивность сигнала с обеих сторон свидетельствует о том, что способность к транспортировке Gd-DOTA барьеров кровь-перилимфа на обоих ушах не изменилась после транстимпанальной инъекции LPN (рис. 2g, h) (таблица 1).

МРТ внутреннего уха крысы с усилением гадолинием после введения липосомного наноносителя (ЛПН). Всем животным наноматериалы вводили на медиальную стенку полости левого среднего уха. Положительный контроль был получен у крыс через 2 часа после внутривенной инъекции Gd-DOTA, вторичной по отношению к транстимпанической инъекции наночастиц серебра (AgNP) за 5 часов до ( a , b ). Динамическое распределение LPN в среднем и внутреннем ухе показано на c . , d , e , f транстимпанической инъекцией Gd-DOTA-содержащего LPN без внутривенного введения Gd-DOTA. Воздействие пустых LPN на биологический барьер было показано с помощью МРТ через 2 часа после внутривенной инъекции Gd-DOTA (в / в Gd-DOTA) у крыс, получавших транстимпанальную инъекцию LPN за 5 часов до этого ( g , ч ). Я ампуляр заднего полукружного канала, Coch улитка, EES кожа внешнего уха, L левое ухо, LPN-Mu LPN на слизистой оболочке среднего уха, LPN-OC LPN на цепочке слуховых косточек ( OC ), МЕ-Му , слизистая среднего уха, R правое ухо, SM scala media , ST scala tympani, SV scala vestibuli, жилет вестибулум, 1H базальный верхний виток улитки, 1L базальный нижний оборот улитки, 2H второй высший виток улитки, 2L второй нижний виток улитки. Шкала масштаба =5 мм

Ни LPN + Gd-DOTA, ни LPN не вызывали значительной потери слуха, представленного как пороговое смещение ABR, которое измерялось с использованием стимулов щелчков и тональных пакетов на частотах 2, 4, 8, 16 и 32 кГц на частотах 2, 4 и Через 7 дней после введения, по сравнению с ушами, получавшими транстимпанальные инъекции деионизированной воды (dH ₂ О) (рис. 3).

Влияние транстимпанической инъекции липосомных наноносителей на функцию слуха у крыс, измеренную по слуховой реакции ствола мозга. Потеря слуха выражалась сдвигом порога. Между группами была незначительная разница ( p > 0,05, односторонний дисперсионный анализ). нет =6 в каждой группе. H2O транстимпаническая инъекция деионизированной воды в группе отрицательного контроля, LPN пустой липосомный наноноситель, LPN + Gd-DOTA Gd-DOTA-содержащий LPN, 2d , 4d , и 7d 2, 4 и 7 дней после инъекции

LPN не индуцируют накопление гликозаминогликанов в улитке крыс

Окрашивание гематоксилином и эозином не показало какой-либо воспалительной инфильтрации лейкоцитов и фибрина в улитке всех проанализированных животных, включая стремени и овальное окно, через которое проходят LPN (рис. 4). Окрашивание периодической кислотой по Шиффу продемонстрировало наличие гликозаминогликанов в костной стенке, спиральном лимбе, спиральной связке, текториальной мембране, мембране Рейсснера, костной спиральной пластине и сосудистой полоске в улитке животных, получавших транстимпанические инъекции dH ₂ О. Наблюдалось градиентное увеличение интенсивности сигнала от базального поворота к верхушке, и разница была значительной в сосудистой полоске (рис. 5 и 6). Градиент сигнала в улитке не изменился у животных, получавших транстимпаническую инъекцию LPN и LPN + Gd-DOTA (рис. 5 и 6).

Окрашивание гематоксилин-эозином улиток крыс, подвергшихся воздействию липосомных наноносителей. Не было воспалительной инфильтрации в улитке, получавшей LPN ( a ), LPN + Gd ( b ) и H2O ( c ). Обведенная область указал выбор области интересов для измерения интенсивности ( a ). LPN пустой липосомный наноноситель, LPN + Gd Gd-DOTA-содержащий LPN. Сб мешочек, SFP подножка стремени, SVJ стапедиовестибулярный сустав, SM scala media, ST scala tympani, SV scala vestibuli, Ут utricule. Шкала масштаба =1 мм

Секрецию гликозаминогликанов в улитке крысы, подвергшуюся воздействию липосомных наноносителей, определяли с помощью световой микроскопии с периодическим кислотным окрашиванием по Шиффу. Спиральный лимб ( SLim ) и костяная стена ( BW ) улитки показали наиболее интенсивное окрашивание в группах отрицательного контроля ( H2O ) ( а - c ), пустой липосомный наноноситель (LPN) ( d - е ) и Gd-DOTA-содержащий LPN ( LPN + Gd ) ( г - я ). Области окрашивания с заметно более высокой интенсивностью обозначены * в c , f , и h по сравнению с левым столбцом. RM Мембрана Рейсснера, SGC спиральные ганглиозные клетки, SLig спиральная связка, StrV stria vascularis, 1-й базальный поворот, 2-й вторая очередь. Шкала масштаба =50 мкм

Количественная оценка секреции гликозаминогликанов в улитке крысы, подвергшейся воздействию липосомных наноносителей, обнаруженная с помощью периодического кислотного окрашивания по Шиффу. нет =3 в каждой группе. Австралия произвольная единица, H2O отрицательный контроль, LPN пустой липосомный наноноситель, LPN + Gd LPN, содержащий Gd-DOTA, SLig спиральная связка, Slim спиральный лимб, StrV stria vascularis, 1-й базальный поворот, 2-й вторая очередь. * p <0,05, ** p <0,01 (односторонний дисперсионный анализ с использованием LSD-теста в качестве апостериорного анализа)

LPN оказали незначительное влияние на секрецию гиалуроновой кислоты в улитке крыс

В улитке крыс, получавших транстимпанические инъекции dH2O, положительное окрашивание на гиалуроновую кислоту было обнаружено преимущественно в клетках спирального ганглия, базальных клетках стрия, клетках наружной борозды и эндотелиальных клетках капилляров, среди других клеток (рис. 7). Интенсивность сигнала в фиброцитах спиральной связки базального и второго витков была значительно выше, чем у верхушки. Эти различия стали несущественными в улитке крыс при применении LPN и LPN + Gd-DOTA, что свидетельствует о влиянии LPN на секрецию гиалуроновой кислоты фиброцитами спиральной связки (рис. 8). LPN + Gd-DOTA также снижает окрашивание фиброцитов спиральной связки базального витка. Однако транстимпанальная инъекция LPN и LPN + Gd-DOTA не оказала влияния на секрецию гиалуроновой кислоты в большинстве клеток улитки (рис. 7 и 8).

Секреция гиалуроновой кислоты в улитке крысы, подвергшейся воздействию липосомных наноносителей, была обнаружена с помощью иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии. Положительное окрашивание было обнаружено в клетках базальной полоски ( SBC ), клетка наружной борозды ( OSC ), спиральные ганглиозные клетки ( SGC ) и эндотелиальные клетки капилляров ( CEC ) модиолуса групп отрицательного контроля ( H2O ) ( а - c , j ), пустые липосомные наноносители ( LPN ) ( г - е , k ) и Gd-DOTA-содержащий LPN ( LPN + Gd ) ( г - я , l ). Не было окрашивания в антителе без отрицательного контроля ( AbNC ) ( м ). ЦИК капиллярная эндотелиальная клетка, ISC внутренняя борозда, SBC базальная клетка полоски, SL-I фиброциты спиральной связки типа I, SLSF спиральный лимб сателлитный фиброцит, SMC маргинальная клетка stria vascularis. Шкала масштаба =16 мкм

Количественная оценка секреции гиалуроновой кислоты в улитке крысы, подвергшейся воздействию липосомных наноносителей, обнаруженных с помощью иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии. нет =3 в каждой группе. Австралия произвольная единица, H2O отрицательный контроль, LPN пустой липосомный наноноситель, LPN + Gd LPN, содержащие Gd-DOTA, SBC базальные клетки полоски, SGC спиральные ганглиозные клетки, SLig , спиральная связка, Slim спиральный лимб, 1-й базальный поворот, 2-й вторая очередь. ** p <0,01 (по сравнению с апексом), ## p <0,01 (по сравнению с группами LPN и H2O базального поворота) (односторонний дисперсионный анализ с использованием LSD-теста в качестве апостериорного анализа)

LPN не изменяют популяцию клеток CD44 в улитке крысы

В улитке, подвергшейся действию dH ₂ О, промежуточные стриальные клетки, базальные стриальные клетки, фиброциты спиральной связки, клетки спирального ганглия, клетки Дейтерса в кортиевом органе и эндотелиальные клетки капилляров в модиолусе и спиральной связке показали интенсивное окрашивание на CD44. Между витками улитки разница в интенсивности сигналов была незначительной. На CD44-положительную популяцию и интенсивность экспрессии не влияла транстимпанальная инъекция LPN + Gd-DOTA или LPN (рис. 9 и 10).

Распределение CD44-положительных клеток в улитке крысы, подвергшейся воздействию липосомного наноносителя, продемонстрировано с помощью иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии. CD44-положительные клетки в основном обнаруживались в базальных клетках полоски ( SBC ), спиральная связка ( SL ), Клетки Дитера ( DC ), спиральные ганглиозные клетки ( SGC ) и эндотелиальные клетки капилляров ( CEC ) в группах отрицательного контроля ( H2O ) ( а - е ), пустые липосомные наноносители ( LPN ) ( f - j ) и Gd-DOTA-содержащий LPN ( LPN + Gd ) ( k - н ). Не было окрашивания в антителе без отрицательного контроля ( AbNC ) ( o ). IHC внутренние волосковые клетки, M-CEC эндотелиальные клетки капилляров в модиолусе, SL-CEC эндотелиальные клетки капилляров в спиральной связке:клетки спирального ганглия, SL-III фиброциты спиральной связки типа III, SL-IV фиброциты спиральной связки IV типа, TM текториальная мембрана, OHC внешние волосковые клетки. Шкала масштаба =16 мкм

Количественная оценка уровня белка CD44 в улитке крысы, подвергшейся воздействию липосомных наноносителей, обнаруженных с помощью иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии. Между группами была незначительная разница ( p > 0,05, односторонний дисперсионный анализ). нет =3 в каждой группе. нет =3 в каждой группе. Австралия произвольная единица, H2O отрицательный контроль, LPN пустой липосомный наноноситель, LPN + Gd LPN, содержащие Gd-DOTA, SBC базальные клетки полоски, SGC спиральные ганглиозные клетки, SLig спиральная связка, 1-я базальный поворот, 2-й вторая очередь

LPN не изменяют экспрессию TLR2 в улитке крысы

В улитках, подвергшихся действию dH2O, базальные клетки стрия, фиброциты спиральной связки, клетки корня, клетки спирального ганглия, столбчатые клетки кортиевого органа и эндотелиальные клетки капилляров в модиолусе показали интенсивное окрашивание на TLR2. Между витками улитки разница в интенсивности сигналов была незначительной. На TLR2-положительную популяцию и интенсивность экспрессии не влияла транстимпаническая инъекция LPN + Gd-DOTA или LPN (рис. 11 и 12).

Распределение TLR2-положительных клеток в улитке крыс, подвергшихся воздействию липосомных наноносителей, продемонстрировано с помощью иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии. TLR2-положительные клетки в основном обнаруживались в базальных клетках полоски ( SBC ), спиральная связка ( SL ), корневая ячейка ( RC ), столбчатая ячейка ( ПК ), спиральные ганглиозные клетки ( SGC ) и эндотелиальные клетки капилляров ( CEC ) в группах отрицательного контроля ( H2O ) ( а - е ), пустые липосомные наноносители ( LPN ) ( k - н ) и Gd-DOTA-содержащий LPN ( LPN + Gd ) ( f - j ). Не было окрашивания в отрицательном контроле без антител ( AbNC ) ( o ). IHC внутренние волосковые клетки, SL-III фиброциты спиральной связки типа III, OHC внешние волосковые клетки. Шкала масштаба =16 мкм

Количественная оценка уровня белка TLR2 в улитке крысы, подвергшейся воздействию липосомных наноносителей, обнаруженных с помощью иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии. Между группами была незначительная разница ( p > 0,05, односторонний дисперсионный анализ). нет =3 в каждой группе. Австралия произвольная единица, H2O отрицательный контроль, LPN пустой липосомный наноноситель, LPN + Gd LPN, содержащие Gd-DOTA, SBC базальные клетки полоски, SGC спиральные ганглиозные клетки, SLig спиральная связка, 1-я базальный поворот, 2-й вторая очередь

LPN не вызывают гибели клеток в улитке крыс

Были редкие апоптотические клетки, которые случайным образом распределялись в улитке необработанных крыс. Неожиданно было обнаружено множество апоптотических клеток в подошве стремени и в нише овального окна. Введение LPN и LPN + Gd-DOTA не оказало влияния на количество и характер распределения апоптотических клеток (рис. 13).

Апоптоз в улитке крысы, подвергшейся воздействию липосомных наноносителей, продемонстрирован с помощью конфокальной микроскопии с окрашиванием TUNEL. Апоптотические клетки редко обнаруживались в клетках улитки крыс в группах отрицательного контроля ( H2O ) ( а - c ), пустые липосомные наноносители ( LPN ) ( f - я ) и Gd-DOTA-содержащий LPN ( LPN + Gd ) ( j - l ). В подошве стремени было много апоптотических клеток ( FP ) и овальной оконной ниши ( СОБСТВЕННЫЙ ) обеих групп ( d , e ). В положительном контроле (ПК) обильное окрашивание TUNEL было обнаружено в фиброцитах спиральной связки ( SL ), базальные клетки полоски ( SBC ) и клетки края полоски ( SMC ). PP периферический отросток спиральной ганглиозной клетки ( SGC ), OC остеоцит, OSC ячейка наружной борозды, SL-IV тип IV фиброцитов спиральной связки, SLim спиральный лимб, StrV stria vascularis. Шкала масштаба а - l =32 мкм, м =16 мкм

Обсуждение

LPN эффективно поступали во внутреннее ухо после транстимпанической инъекции, продемонстрированной с помощью МРТ с использованием Gd-DOTA в качестве миметиков лекарств, которые были инкапсулированы внутри LPN (рис. 2c-f). Хотя предыдущее исследование показало, что круглое окно было основным путем проникновения LPN во внутреннюю часть [6], настоящее наблюдение показало, что путь через овальное окно был более эффективным, чем круглое окно, для транспортировки LPN из среднего уха во внутреннее пространство. ухо. Этот результат свидетельствует о том, что оба пути важны для нагрузки LPN на внутреннее ухо после целенаправленного введения в медиальную стенку среднего уха. Используя наиболее эффективный метод МРТ внутреннего уха с усилением гадолиния in vivo для оценки биологического барьера и частотно-зависимой ABR для оценки функции слуха, настоящее исследование продемонстрировало, что транстимпанальная инъекция LPN и LPN + Gd-DOTA не нарушает функцию барьеры внутреннего уха не вызывали ухудшения слуха у крыс. Анализируя ранее продемонстрированные критические биологические маркеры воспаления [11, 22], LPN и LPN + Gd-DOTA не вызывали воспалительного ответа в улитке. Хотя мембрана круглого окна не оценивалась, отсутствие воспаления в стремени и овальном окне исключало очевидную воспалительную реакцию в мембране круглого окна, поскольку настоящее исследование продемонстрировало, что путь через овальное окно превосходит подход круглого окна для LPN. / P>

МРТ внутреннего уха после внутривенной инъекции хелата гадолиния способна выявить вызванное окислительным стрессом нарушение барьеров кровь-перилимфа и кровь-эндолимфа, вызванное митохондриальными токсинами [23]. Сообщалось, что AgNP вызывают клеточные нарушения за счет генерации активных форм кислорода (ROS) и активации аминоконцевых киназ Jun (JNK), что приводит к высвобождению цитохрома C в цитозоль и перемещению Bax в митохондрии [24 ]. При транстимпанической инъекции AgNP попадали во внутреннее ухо и вызывали изменения проницаемости биологических барьеров внутреннего уха крысы [11, 25]. LPN также поступали во внутреннее ухо крысы после транстимпанической инъекции в зависимости от размера, а LPN диаметром 95 нм показали самую высокую эффективность при прохождении через средне-внутреннее ухо [3]. В настоящем исследовании средний размер LPN составлял от 100 до 115 нм, что немного превышало наиболее эффективный размер. LPN + Gd-DOTA показали, что LPN такого размера попадают во внутреннее ухо, что соответствует предыдущему отчету [3]. Однако попадание LPN во внутреннее ухо не вызывало изменений проницаемости барьеров кровь-перилимфа и кровь-эндолимфа. Этот результат показал, что LPN безопасны для внутреннего уха. Результаты ABR, указывающие на нормальную функцию слуха, подтвердили результат МРТ.

There was an association between hyaluronic acid secretion and permeability change and microcirculation inflammation in renal ischemic reperfusion injury [12]. The previous study also showed that AgNPs caused the accumulation of hyaluronic acid in the rat cochlea [11]. CD44 and toll-like receptor 2/4 (TLR2/4) work as receptors of hyaluronic acid and trigger biological reactions [13, 14]. CD44 also mediates the metabolism of hyaluronic acid through cellular uptake and degradation in addition to recruiting T cells to inflammatory sites and regulating T cell-mediated endothelial injury [18]. In the present study, hyaluronic acid, CD44, and TLR2 were detected in the rat cochlea. LPN + Gd-DOTA reduced the secretion of hyaluronic acid in the spiral ligament fibrocytes. The expressions of CD44 and TLR2 were not changed after the transtympanic injection of either LPNs or LPN + Gd-DOTA. The total glycosaminoglycan, which contains hyaluronic acid in the cochlea was not affected by the administrations of LPNs and LPN + Gd-DOTA. The impact of LPNs on the hyaluronic acid distribution in rat cochlea did not cause either permeability change or hearing loss, indicating that the modification is unharmful. It was reported that macrophages undergo phenotypic changes dependent on molecular weight of hyaluronan that correspond to either pro-inflammatory response for low molecular weight hyaluronic acid or anti-inflammatory response for high molecular weight hyaluronic acid [26]. The observed minor changes of hyaluronic acid distribution in the cochlea might have high molecular weight and anti-inflammatory function. Therefore, there was no hint of an inflammatory reaction in the rat cochlea.

The observed apoptosis in the stapes footplate cells might be normal biological activity. A balance between survival and apoptosis in the stapes footplate cells was reportedly as necessary to inactivate the otosclerosis [27]. Administration of LPN + Gd-DOTA did not affect apoptosis in the rat stapes.

Выводы

The present study demonstrated that the transtympanic injection of liposome nanocarriers neither impaired the biological barriers of the inner ear nor caused hearing loss in the rats. The critical inflammatory mechanism was not activated by the administration of liposome nanocarriers, either. The results suggested that transtympanic injection of liposome nanocarrier is safe for the cochlea of rat.

Methods

Materials

Sphingosine (Sph), 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (SOPC), and 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000] (ammonium salt) [DSPE-PEG-2000] were purchased from Avanti polar lipids (Alabaster, USA). DiI (Vybrant DiI cell-labeling solution, 1 mM in solvent) and N-(6-tetramethylrhodaminethiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-hosphoethanolamine, triethylammonium salt (TRITC-DHPE) were purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA). Gd-DOTA (DOTAREM) was from Guerbet, Cedex, France. Hepes and EDTA were from Sigma. The purity of the lipids was evaluated using thin-layer chromatography on silicic acid-coated plates (Merck, Darmstadt, Germany) developed with a chloroform/methanol/water mixture (65:25:4, v/v/v). An examination of the plates after iodine staining and, when appropriate, upon UV illumination revealed no impurities. The lipid concentrations were determined gravimetrically with SuperG (Kibron, Espoo, Finland); a high-precision microbalance. The polyvinylpyrrolidone-stabilized AgNPs were supplied by Colorobbia (Firenze, Italy). The AgNPs were dispersed in deionized water (370.7 mM), and scanning electron microscopy showed that the AgNPs are spheroids with a particle size of around 100 nm. Dynamic light scattering (DLS) showed a mean hydrodynamic size of 117 ± 24 nm and a mean zeta potential of −20 ± 9 mV.

In the visualization of nanocarrier uptake in the inner ear and the evaluation of biological barrier function, 5 male Sprague Dawley rats, weighing between 334 and 348 g, were provided by the Biomedicum Helsinki, Laboratory Animal Centre, University of Helsinki, Finland (this is the defined animal center that provides animals for MRI experiments in Biomedicum); in the ABR and histological studies, 18 Sprague Dawley rats, weighing between 300 and 400 g, were provided by the Experimental Animal Unit of the University of Tampere School of Medicine in Finland. Animal assignments in each study were shown in Table 2. All animal experiments were approved by the Ethical Committee of University of Tampere (permission number:ESAVI/3033/04.10.03/2011). Animal care and experimental procedures were conducted in accordance with European legislation. Animals in the Gd-MRI study were anesthetized with isoflurane with 5% isoflurane–oxygen mixture (flow-rate 1.0 L/min) for induction and 3% for maintenance via a facemask. Animals for the ABR and histological studies were anesthetized with a mixture of 0.5 mg/kg medetomidine hydrochloride (Domitor ^® , Orion, Espoo, Finland) and 75 mg/kg ketamine hydrochloride (Ketalar ^® , Pfizer, Helsinki, Finland) via intraperitoneal injection followed by an intramuscular injection of enrofloxacin (Baytril ^® vet, Orion, Turku, Finland) at a dose of 10 mg/kg to prevent potential infection. The animal’s eyes were protected by Viscotears® (Novartis Healthcare A/S, Copenhagen, Denmark).

Preparation and Characterization of LPNs with and without Gd

Preparation of Gd-containing LPNs

LPNs of unilamellar vesicles with an apparent hydrodynamic particle diameter (Z _av ) of 110 ± 15 nm that contain Gd-DOTA were prepared according to the previously published method [6]. A concentration of 1 mM Gd-DOTA-containing LPN (LPN + Gd-DOTA) refers to 1 mM liposomes encapsulating 500 mmol/L of Gd-DOTA.

Preparation of Blank LPNs

Blank LPNs of unilamellar vesicles with Z _av of 115 ± 10 nm were prepared according to a previous publication [6].

Administration of LPNs

Under general anesthesia with isoflurane with 5% isoflurane–oxygen mixture (flow-rate 1.0 L/min), 50 μl of either LPNs or LPN + Gd-DOTA were injected into the left middle ear cavity through the tympanic membrane penetration under an operating microscope (OPMI1-F, Carl Zeiss, Jena, Germany). The same amount of deionized water (H₂ O) was injected transtympanically in rats that were assigned to the negative group. After the injection, the animals were kept in the lateral position with the injected ear oriented upward for 15 min before further measurements.

Evaluation on Biological Barrier Function Using Gd-MRI

One animal receiving transtympanic injection of LPN + Gd-DOTA was selected to demonstrate distributions of LPN in the inner ear using MRI without contrast agent. Two animals receiving transtympanic injection of blank LPNs were engaged in MRI study for evaluation of the biological barrier function. Two animals receiving transtympanic injection of AgNPs (370.7 mM, 40 μl) were used as positive control. The contralateral ear without any injection was used as negative control in all studies. A 4.7T MR scanner with a bore diameter of 155 mm (PharmaScan, Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany) was utilized. The maximum gradient strength was 300 mT/m with an 80-μs rise time. A gadolinium-tetraazacyclododecane-tetraacetic acid (Gd-DOTA, 500 mM, DOTAREM, Guerbet, Cedex, France) solution was injected into the tail vein (0.725 mM/kg) 2 h before the MRI measurements. The imaging protocol and rapid acquisition with relaxation enhancement (RARE) sequences were applied according to a previous publication [10]. MRI scanning commenced at several time points after the transtympanic injection. The first MRI time of around 5 h was determined by taking the penetration time of liposome nanoparticles from the middle ear to the inner ear as a reference [1, 3, 6]. The final imaging time of 8 d was selected according to the course of potential acute inflammation and the availability of the scanner. ParaVision PV 4.0 (Bruker, MA, USA) software was used for the post-processing and quantification of MR images.

ABR Measurement

The auditory function of animals receiving injections of both blank and Gd-containing LPNs were evaluated using ABR measurements using BioSig32 (Tucker Davis Technologies, FL, USA) in a custom made, soundproof chamber. The ABR thresholds upon click and tone burst stimuli were recorded before and at a certain time point post-administration of LPNs. The first ABR measurement was followed on 2 days post-administration of AgNPs, allowing the animals to recover from the general anesthesia during the injection and to ensure the injected solution to be entirely cleared from the middle ear cavity. The second follow-up time of 4 days post-injection was chosen because it is close to the peak time of potential mitochondrial impairment-induced cell death in the cochlea [22]. The third follow-up time of 7 days is the time point when temporary threshold shifts remained significantly approved in an animal model of mitochondrial toxin-induced hearing loss [28]. The ABR recording procedure followed the previous report [11].

Glycosaminoglycan Staining in Rat Cochlea After Administration of LPNs

Hematoxylin-eosin staining to assess potential inflammatory infiltration and periodic acid Schiff’s staining to evaluate potential glycosaminoglycan accumulation in the cochlea after administration of LPNs were performed according to a previous publication after ABR measurements over 7 days [11] The slices were observed and digital images were acquired under a light microscope (Leica DM2000 microscope equipped with an Olympus DP25 camera) for further analysis.

Immunofluorescence Staining for Hyaluronic Acid and Receptors

Immunofluorescence staining for hyaluronic acid, CD44, and TLR2 were performed according to a previous publication after ABR measurements over 7 days [11, 21].

Cell Death Detection

Potential nuclear DNA fragmentation in the cochlea was investigated using terminal transferase (TdT) to label the free 3′OH breaks in the DNA strands of apoptotic cells with TMR-dUTP (TUNEL staining) following the reported procedure [11]. Slices exposed to recombinant DNase I (Fermentas, Vantaa, Finland, 100 U/ml in 50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mg/ml bovine serum albumin) at 37 °C for 10 min, which induced DNA strand breaks prior to the labeling procedures, were utilized as positive controls. The samples were observed under a confocal microscope.

Confocal Microscopy

The samples were observed under a Nikon inverted microscope (ECLIPSE Ti) combined with an Andor confocal system installed with Andor iQ 2.8 software (Andor Technology, Belfast, UK). The excitation lasers were 488 nm (green excitation) and 568 nm (red excitation) from an Andor laser combiner system, and the corresponding emission filters were 525/50 (Alexa Fluor-488) and 607/45 nm (Cy ^TM 3 and TMR Red). DAPI was excited with light at 405 nm generated from a light-emitting diode and was detected using a 450–465 nm filter.

Analysis and Statistics

ImageJ (1.45S, National Institutes of Health, Bethesda, USA) software was used for signal intensity measurements. For light microscopy of periodic acid Schiff’s staining, the region of interests (ROIs) including spiral ligament, spiral limbus, and stria vascularis were selected using freehand selections button. The “measure” function was used to obtain the mean gray scale value of the ROI, which was inversely correlated with the staining intensity. For confocal microscopy of immunofluorescence staining, the ROIs including stria basal cells, spiral ganglion cells, spiral ligament, and spiral limbus were extracted using photoshop CS6 (version 13.0, Adobe Systems Software Ireland Ltd, Dublin, Ireland) program and were imported into ImageJ program. The images were split into individual channel, and the green (corresponded to CD44 and TLR2) and red (corresponded to hyaluronic acid) channels were selected for further quantifications. The “Threshold” was adjusted using the “set” button in the “Image” menu, and “Limit to Threshold” option should be selected and “Direct to” should be defined to the corresponding channel in the “Analyze” menu. Then the gray scale value, which was inversely correlated with the staining intensity, was obtained using the “Measure” function in the same menu.

Statistical analyses were performed using the IBM ^® SPSS ^® Statistics Version 20 software package (SPSS Inc., Chicago, USA). A one-way ANOVA and Kruskal-Wallis test were used to compare ABR threshold shifts and signal intensities (grayscale) of staining for glycosaminoglycan and hyaluronic acid secretions, and TLR2 and CD44 staining between the LPN injected-ear and saline injected-ear groups in the different cochlear structures among various turns. Least significant difference (LSD) test was used as post hoc analysis. Higher numbers in the grayscale analysis correlate with lower signal intensities of the staining. p  < 0.05 was accepted as statistically significant.

Сокращения

ABR:

Auditory brainstem response

AgNPs:

Silver nanoparticles

dH₂ O:

Deionized water

GAB1:

Growth factor receptor-bound protein 2-associated-binding protein 1

Gd-DOTA:

Gadolinium-tetra-azacyclo-dodecane-tetra-acetic acid (DOTAREM)

Gd-MRI:

Gadolinium-enhanced magnetic resonance imaging

JNK:

Jun amino-terminal kinases

LPN + Gd-DOTA:

Gd-DOTA-containing LPNs

LPNs:

Liposome nanocarriers

ROI:

Region of interests

ROS:

Reactive oxygen species

TLR:

Toll-like receptor