Медные микропористые покрытия титана усиливают активность остеобластов и интеграцию с костью

Аннотация

Титановые сплавы — золотой стандарт для ортопедических имплантов благодаря прочности и биосовместимости. Однако их инертные поверхности могут ухудшать оссеоинтеграцию, ведя к ослаблению импланта. В этом исследовании мы изготовили медное титандиоксидное (Cu–TiO₂) микропористое покрытие на титане методом микродугового окисления (MAO). Характеризация поверхности подтвердила трехмерную пористую сеть с равномерным распределением Cu, Ca, P, Ti и O; XRD/XPS анализ выявил TiO₂ (рутил и анатаз) и CuO фазы. In vitro клетки MC3T3-E1 продемонстрировали превосходную адгезию, пролиферацию и экспрессию остеогенных маркеров на Cu–TiO₂ по сравнению с неоклеенным Ti и TCP-покрытым Ti. In vivo имплантация в кондилы бедренных костей кроликов показала увеличение долей костной ткани (BV/TV) и более тесный контакт кость-имплант для Cu–TiO₂ имплантов на 4 и 8 неделях. Результаты показывают, что Cu–TiO₂ MAO покрытия заметно улучшают биологическую активность титана, стимулируя новое костообразование и предлагая перспективную стратегию для клинических ортопедических имплантов.

Введение

Титан и его сплавы остаются золотым стандартом для нагрузочных имплантов благодаря отличным механическим свойствам и врожденной биосовместимости. Однако их химически инертные поверхности лишены остеоиндуктивных сигналов, опираясь исключительно на механическое зацепление для стабильности, что может дать сбой под физиологическими нагрузками. Инженерство поверхности — особенно микродуговое окисление — стало универсальной техникой для внедрения пористости, шероховатости и биоактивных ионов, тем самым улучшая адсорбцию белков, адгезию клеток и в конечном итоге оссеоинтеграцию.

Хотя существует множество стратегий покрытий (плазменное напыление, электрофоретическое осаждение, сол-гель и др.), они часто страдают от низкой кристалличности, слабого адгезирования или сложной обработки. MAO, напротив, предлагает быстрое, масштабируемое осаждение прочных, высокопористых оксидных слоев с настраиваемой химией.

Медь — следовой элемент, необходимый для костного обмена, стимулирует пролиферацию остеобластов, регулирует VEGF вверх и обладает антибактериальной активностью при физиологических концентрациях. Включение Cu в TiO₂ матрицы показывало синергетический эффект на остеогенез и микробную ингибицию.

В этой работе представлено Cu–TiO₂ микропористое покрытие, изготовленное MAO, оценены его физико-химические свойства и влияние на поведение остеобластов in vitro и интеграцию с костью в кроличьей модели, закладывая фундамент для клинической трансляции.

Материалы и методы

Подготовка образцов и характеристика

Коммерческие стержни Ti сплава (12 мм × 1 мм для поверхностного анализа; 3 мм × 8 мм для имплантации) шлифовали до 600 зерна, ультразвуково очищали и подвергали MAO. Низковольтная MAO система работала при 450 В (режим постоянного тока, 5 мин, 1 кГц). Электролит содержал 1 м.ч. Ca(CH₃COO)₂ и 0.5 м.ч. Ca₃(PO₄)₂, с или без добавки CuO (0.1 м.ч. для TCP Cu I и 0.3 м.ч. для TCP Cu II). Образцы маркировали: Ti, TCP, TCP Cu I, TCP Cu II.

Морфология поверхности изучали FE-SEM; элементная карта через EDS; шероховатость профилометром (Ra). Фазовый анализ XRD (Cu Kα, 2θ = 10–80°); химические состояния XPS (энергии связи 520–1100 эВ).

Клеточная культура

Муриновые преостеобласты MC3T3-E1 культивировали в MEM с 10% FBS и 1% пенициллин/стрептомицин при 37 °C, 5% CO₂. Клетки 3-го прохода использовались для всех тестов.

Live/Dead окраска

Клетки (1.5×10⁴ клеток/см²) посевали на каждый субстрат, инкубировали 3 дня, окрашивали кальцеином AM/этидиев гидомером. Соотношение живых/мертвых kvantифицировали флуоресцентной микроскопией.

Адгезия и пролиферация клеток

Адгезия оценивали через 1, 2 и 6 часов DAPI окраской ядер и конфокальной микроскопией. Пролиферация — CCK-8 тестом на 1, 3 и 10 дни. Данные как абсорбция при 450 нм.

Экспрессия остеогенных генов

На 1, 3 и 10 днях извлекали общий RNA, обратную транскрипцию и qRT-PCR для BMP-2, COL-I, ALP, OCN с GAPDH как внутренним контролем. Праймеры в Таблице 2.

Животные и хирургия

16 взрослых кроликов новозеландской белой породы (3.6 кг) рандомизировали в экспериментальную (Cu-покрытые) и контрольную (TCP) группы. Под натрий-пентобарбитальной анестезией создавали дефект 2.7 мм × 6 мм в латеральном кондиле бедра и имплантировали соответствующие стержни. Постоперационный уход включал пенициллин 3 дня.

Микро-КТ анализ

На 4 и 8 неделях по 8 кроликов в группе эвтаназировали. Экцизированные кондилы фиксировали, сканировали при вокселе 9 мкм, cuantificировали BV/TV (%), толщину трабекул и связность коммерческим софтом.

Гистология

Образцы дегидратировали, встраивали в смолу, сечили (20–30 мкм), окрашивали толуидиновым синим и фуксином-метиленовым синим. Костно-имплантные интерфейсы изучали световой микроскопией на новое костообразование и фиброзные зазоры.

Статистический анализ

Данные как mean ± SD. Однофакторный ANOVA с тестом SNK оценивали различия групп (p < 0.05 значимо). Использовали SPSS 16.0.

Результаты

Морфология и состав поверхности

FE-SEM изображения (Рис. 1) показали равномерную взаимосвязанную микропористую сеть на TCP, TCP Cu I и TCP Cu II, отсутствующую на голом Ti. EDS карта (Рис. 2) подтвердила гомогенное распределение Cu, Ca, P, Ti, O без токсичных примесей. XRD паттерны (Рис. 3) выявили пики TiO₂ (рутил/анатаз) и CuO в Cu-легированных образцах. XPS спектры (Рис. 4) подтвердили наличие TiO₂ и CuO (Cu 2p ≈ 932.7 эВ).

Шероховатость поверхности

Профилометрия (Рис. 5) выдала Ra: 1.2 мкм для TCP, 1.3 мкм для TCP Cu I, 1.4 мкм для TCP Cu II, значительно выше Ti (0.4 мкм). Добавление меди не меняло шероховатость существенно.

Адгезия и пролиферация клеток

DAPI окраска (Рис. 6a) показала рост числа клеток во времени. Квантификация (Рис. 6b) продемонстрировала порядок: TCP Cu II > TCP Cu I > TCP > Ti, с значимым (p < 0.01) улучшением на Cu-легированных поверхностях. Пролиферационные тесты (Рис. 6c) зеркалили тренды адгезии, подтверждая стимулирующий эффект Cu-легированной пористости.

Инкорпорация EdU

EdU окраска (Рис. 7) выявила более высокий процент пролиферирующих ядер на TCP Cu II, затем TCP Cu I, TCP, Ti, подкрепляя пролиферационное преимущество медной аддитивы.

Цитотоксичность

Live/Dead тест (Рис. 8) показал минимальные красные (мертвые) клетки во всех группах, указывая на отсутствие значимой цитотоксичности от Cu легирования.

Экспрессия остеогенных генов

qRT-PCR (Рис. 9) продемонстрировал прогрессивную урегуляцию BMP-2, COL-I, ALP, OCN во времени, с наивысшей экспрессией на TCP Cu II, затем TCP Cu I, TCP, Ti. Различия статистически значимы (p < 0.05).

Микро-КТ и гистология

Микро-КТ реконструкции (Рис. 10) выявили большую BV/TV в Cu-покрытой группе на 4 и 8 неделях (p < 0.01). Гистологические срезы (Рис. 11) показали более узкий фиброзный зазор и более зрелую кость вокруг Cu-покрытых имплантов, подтверждая улучшенную оссеоинтеграцию.

Обсуждение

Настоящее исследование демонстрирует, что MAO-фабрицированные Cu–TiO₂ микропористые покрытия обеспечивают прочную, биоактивную поверхность, способствующую адгезии, пролиферации и дифференцировке остеобластов, ведущей к превосходной интеграции с костью in vivo. Прочное связывание керамического покрытия с Ti подложкой — укорененное в высокотемпературном плазменном спекании TiO₂ матрицы — гарантирует долгосрочную стабильность, решая общее ограничение конвенциональных покрытий.

Двойная роль Cu — стимуляция остеогенеза и антибактериальная активность — добавляет терапевтическую ценность. Равномерное распределение CuO внутри пористой TiO₂ сети позволяет устойчивое выделение ионов при физиологических концентрациях, согласуясь с предыдущими находками, что низкий уровень Cu (≤ 0.1 м.ч.) улучшает функцию остеобластов без цитотоксичности.

Взаимосвязанная пористая архитектура имитирует родную микроструктуру кости, увеличивая площадь поверхности для адсорбции белков и ингроута клеток, в то время как повышенная шероховатость дополнительно поощряет формирование фокальных адгезий. Вместе эти физико-химические сигналы синергетично ускоряют костное аппозиционирование, как подтверждено увеличением BV/TV и прямым контактом кость-имплант в кроличьей модели.

Ограничения включают короткий период имплантации и использование одного вида животных. Будущие исследования должны оценить долгосрочную стабильность, механическую нагрузку и трансляцию к крупным животным моделям.

Заключение

Микродуговое окисление Ti сплавов для производства Cu-легированного TiO₂ микропористого покрытия дает прочную, биоактивную поверхность, усиливающую активность остеобластов и интеграцию с костью без цитотоксичности. Эти находки поддерживают клинический потенциал Cu–TiO₂ MAO покрытий для ортопедических имплантов нового поколения.

Доступность данных и материалов

Не применимо.

Аббревиатуры

MAO

микродуговое окисление

Cu

медь

Cu–TiO₂ coating

медно-диоксид титана покрытие

BV/TV

объем кости/общий объем

ALP

щелочная фосфатаза