Разработка полимерных мицелл олеаноловой кислоты и оценка их клинической эффективности

Введение

Старение кожи включает дряблость (дряблость), истончение и появление морщин. Это может быть ускорено инфекцией, курением, ультрафиолетовым излучением, травмой, гормональным дисбалансом, стрессом и / или прооксидантами, такими как гидролазы, включая эластиназу или коллагеназу [1]. Активные формы кислорода или свободные радикалы, образующиеся по указанным выше причинам, повреждают соседние клетки и приводят к снижению эластичности кожи и ее истончению [2, 3]. В частности, известно, что ультрафиолетовый свет запускает генерацию активных форм кислорода, которые повреждают липиды мембран, клеточные белки и ДНК и тем самым ускоряют развитие мимических морщин, веснушек и меланодермии [1,2,3,4]. Олеаноловая кислота - это эффективный компонент натурального растительного происхождения, извлекаемый из нескольких видов растений и используемый в качестве основного медицинского и косметического ингредиента. Он также содержится в таких фруктах, как яблоки или груши [5]. Как разновидность гидроксипентациклического терпена, олеаноловая кислота была впервые выделена из оливок ( Olea europaea ) листья и широко встречается в растениях, включая восточноазиатскую свертию ( Eugenia jambos ) и горечавка желтая ( Gentiana lutea ). Он способствует антивозрастным функциям за счет синтеза не только проколлагена, который важен для синтеза коллагена, но также церамидов и филаггрина, а также путем ингибирования активности MMP-1, фермента, расщепляющего белки, такие как коллаген [ 5, 6]. На основании этих результатов можно предположить, что олеаноловая кислота обладает двойным антивозрастным действием, не только стимулируя выработку коллагена, но и предотвращая его деградацию [7]. В результате олеаноловая кислота является очень многообещающим антивозрастным ингредиентом косметических продуктов. Однако использование олеаноловой кислоты в косметических продуктах в качестве основного ингредиента ограничено ее плохой растворимостью в воде; таким образом, только небольшие количества олеаноловой кислоты в составе эмульгированной композиции использовались в качестве вспомогательного ингредиента в косметических продуктах [8]. Его физико-химические свойства, связанные с абсорбцией через кожу, включают температуру плавления, молекулярную массу, коэффициент распределения и гидрофильность. Его температура плавления выше 300 ° C, что указывает на то, что это высококристаллический материал. Высококристаллические материалы требуют большей энергии для растворения, демонстрируют плохую биодоступность из-за их ограниченной растворимости и поэтому плохо абсорбируются [9]. Кроме того, известно, что высокогидрофильные или липофильные соединения или соединения с высокой молекулярной массой нелегко проникают через кожу [10, 11]. Наиболее часто используемым методом улучшения проникновения таких молекул через кожу является синтез предшественников или использование коллоидных носителей лекарственных средств. В связи с этим активно изучаются липосомы, эмульсии и полимерные мицеллы [12].

Полимерные мицеллы представляют собой самоорганизующиеся наноразмерные агрегаты, образующие структуры ядро-оболочка в водном растворе. Полимерные мицеллы часто состоят из диблочных или триблочных сополимеров, которые могут образовывать гидрофобное внутреннее ядро ​​и гидрофильную внешнюю оболочку [13, 14]. Полимерные мицеллы считаются более физически стабильными, чем мицеллы поверхностно-активных веществ, поскольку свойства полимерных мицелл варьируются в зависимости от типа и соотношения полимерных мономеров в блок-сополимере и имеют относительно низкие критические концентрации мицелл [15, 16].

В этом исследовании мы приготовили полимерные мицеллы олеаноловой кислоты и оценили их размер и форму частиц, а также полученную эффективность инкапсуляции и скорость проникновения олеаноловой кислоты через кожу. Физическую стабильность олеаноловой кислоты в этой форме также оценивали в течение 3 месяцев. Также было исследовано действие олеаноловой кислоты против морщин в составе реальных косметических продуктов.

Материалы и методы

Материалы

Олеаноловая кислота, Твин 80, Твин 20 и Твин 60 были приобретены в TCI (Токио, Япония). ПЭГ 400, Плюроник F127 и Плюроник F68 были получены от BASF (Людвигсхафен, Германия). Пропиленгликоль, ПЭГ 300 и ПЭГ 200 были получены от JUNSEI (Токио, Япония). TRANSCUTOL P, LABRASOL, LAUROGLYCOL FCC, LABRAFAC, Capryol® 90 и Capryol ™ PGMC были приобретены у Gattefossé (Лион, Франция). Динатрий ЭДТА (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Сихын, Корея), аллантоин (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Мичиган, США), дипропиленгликоль (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Сихын, Корея), пропандиол (DuPont Tate &Lyle Bio Products Company, LLC, Лаудон, США), карбомер (The Lubrizol Corporation, Огайо, США), ПЭГ / ППГ / полибутиленгликоль-8/5/3, глицерин (NOF Corporation, Токио, Япония), натрий гиалуронат (TCI, Токио, Япония), бета-глюкан (SK Bioland, Чхонан, Корея), феноксиэтанол (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Siheung, Корея), каприлилгликоль (J TWO K BIO CO., Ltd. , Cheongju, Корея) и этилгексилглицерин (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Korea) использовали для приготовления косметического продукта, содержащего олеаноловую кислоту. Ацетонитрил для ВЭЖХ был получен от Burdick &Jackson (Маскегон, Мичиган, США). Использовалась тройная дистиллированная вода, другие растворители и реагенты класса EP и GR. Crlori:бесшерстные самки мышей SKH1-hr были приобретены у OrientBio (Соннам, Корея).

Анализ ВЭЖХ

Олеаноловую кислоту анализировали с помощью ВЭЖХ серии Shimadzu LC-30 (Shimadzu Corporation, Киото, Япония). Аналитическую колонку Kromasil 100 C18 250 мм × 4,6 мм, 5 мкм (Teknokroma, Барселона, Испания) использовали при температуре окружающей среды. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила и воды (85:15, об. / Об.), Скорость потока составляла 1 мл / мин, объем впрыска 10 мкл. Олеаноловую кислоту анализировали при УФ λ =210 нм. Все измерения проводились при температуре окружающей среды [17].

Исследование растворимости и оптимизации рецептуры

Отмеренное количество олеаноловой кислоты добавляли в солюбилизатор, перемешивали при 60 ° C в течение 48 часов и обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут с использованием ультразвукового очистителя. Суспензию центрифугировали при 2000 об / мин с использованием центрифуги Universal 320R (Hettich, Tuttlingen, Германия), а затем собирали супернатант. Затем супернатант фильтровали через мембранный фильтр из ПВДФ 0,45 мкм (Whatman, Kent, UK). Растворимость олеаноловой кислоты в соответствующем солюбилизаторе оценивалась путем вычитания веса оставшихся твердых веществ из суммы начальных масс олеаноловой кислоты и солюбилизатора (таблица 1).

Исследование по оптимизации состава было проведено с использованием полоксамера 188, полоксамера 407, Твин 60 и Твин 80. Были опробованы различные соотношения амфифильных полимеров и поверхностно-активных веществ, как показано в Таблице 2. Каждый из олеаноловой кислоты и Capryol® 90 взвешивали, нагревали и перемешивали. при температуре выше 60 ° C до появления прозрачных растворов. Затем к прозрачному раствору добавляли полимеры / поверхностно-активные вещества, показанные в таблице 2, и перемешивали при температуре выше 60 ° C до появления прозрачных растворов. Затем растворы диспергировали в дистиллированной воде (рис. 1). Полученный раствор оставляли примерно на 48 часов, а затем проводили визуальный осмотр для выбора оптимального состава. Результаты визуальных проверок каждого состава в Таблице 2, включая наблюдения за осаждением, фазовым разделением, прозрачностью и гелеобразованием, сведены в Таблицу 3.

Схематическое изображение получения мицелл олеаноловой кислоты

Получение полимерных мицелл олеаноловой кислоты

Полимерные мицеллы олеаноловой кислоты (PMO) были приготовлены с использованием составов G и H в таблице 2 с использованием метода, показанного на рис. 1. PMO-G и PMO-H были использованы для последующих экспериментов, а PMO-H в косметических продуктах для клинические испытания.

Тест на окрашивание

Полимерная мицеллизация при диспергировании состава G или H в воде была подтверждена визуальным наблюдением, то есть прозрачностью. Образование PMO (PMO-G или PMO-H) также подтверждалось тестом на окрашивание. Метиленовый синий добавляли к смесям воды и Capryol® 90, воды, Capryol® 90, PMO-G и PMO-H, и цвет растворов наблюдали визуально и фотографировали.

Измерение размера частиц

Метод ELS (электрофоретическое рассеяние света) измеряет флуктуацию интенсивности рассеяния от частиц как функцию времени, когда частицы демонстрируют как случайное броуновское движение, так и ориентированное электрофоретическое движение в четко определенном электрическом поле. Электрофоретическая подвижность частиц измеряется методом ELS [18] и позволяет оценить размер частиц как PMO-G, так и PMO-H с помощью спектрофотометра электрофоретического светорассеяния (ELS-Z, Photal, Otsuka Electronics, Япония).

Анализ с помощью сканирующей электронной криомикроскопии (Cryo-SEM)

Криогенная сканирующая электронная микроскопия или сканирующая электронная криомикроскопия (крио-СЭМ) - это мощный метод визуализации состояния микроструктуры или наноструктуры суспензий или дисперсий коллоидного полимера после того, как они были иммобилизованы путем быстрого замораживания и разрушения для получения изображений. Трещину делают и исследуют при -196 ° C, нормальной температуре кипения жидкого азота, и намного ниже температуры стеклования как объемных, так и полностью слипшихся частиц. Крио-СЭМ-изображения показывают диапазон реакции частиц на трещины, которые распространяются мимо них через лед [19]. Сканирующая электронная криомикроскопия (Tescan Mira 3 LMU FEG / Quorum Technologies PP3000T Cryo-SEM Sample Preparation System) использовалась для наблюдения за формой PMO.

Эффективность инкапсуляции

Оценивали эффективность инкапсуляции полимерных мицелл олеаноловой кислоты. PMO центрифугировали при 2000 об / мин в течение 15 минут, супернатант собирали и анализировали с помощью ВЭЖХ. Эффективность инкапсуляции рассчитывалась как количество олеаноловой кислоты в полимерных мицеллах, деленное на количество олеаноловой кислоты, первоначально добавленной (мг) во время приготовления PMO.

Стабильность PMO-H

Физическую стабильность PMO-H оценивали, храня его при 40 ° C в течение 3 месяцев. Изменения цвета, фазовое разделение, наличие осадков и изменения мутности оценивали визуально. Образцы PMO-H, взятые через регулярные интервалы времени, анализировали с помощью ВЭЖХ для определения количества оставшейся олеаноловой кислоты и с помощью ELS-Z для определения размера частиц PMO-H. Результаты представлены на рис. 9

Тест на проницаемость кожи in vitro

Исследование проницаемости кожи in vitro проводили с использованием диффузионной ячейки Франца для исследования увеличения проникновения олеаноловой кислоты через кожу. Испытание проводилось на PMO-G, PMO-H, смеси олеаноловой кислоты и Tween 80, диспергированных в дистиллированной воде, и смеси олеаноловой кислоты и пропиленгликоля, диспергированных в дистиллированной воде. Кожу 6-недельной самки безволосой мыши разрезали на кусочки необходимого размера. Использовались вертикальные ячейки Франца, и кожа фиксировалась между двумя камерами роговым слоем вверх. 330 мкл выбранного состава наносили на кожу и клетки Франца покрывали парапленкой. Рецептор заполняли раствором PBS (pH 7,4) и этанолом в соотношении 9:1 (об. / Об.). Рецепторный раствор наполняли свежим раствором PBS при каждом взятии пробы. Образцы отбирали через 2, 4, 6, 8, 10, 20 и 24 часа и анализировали с помощью ВЭЖХ. Через 24 часа излишки состава, оставшиеся на коже, были удалены с помощью Kimwipes (Kimberly-Clark professional, NSW, Australia). Кожу, использованную в исследовании проницаемости, очищали раствором PBS, и олеаноловую кислоту, остающуюся в коже, измеряли с помощью ВЭЖХ. Все эксперименты по проникновению проводились в трех повторностях.

Статистика исследования

Эксперименты были выполнены в трех повторах независимо, и результаты этого исследования были представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Статистический анализ подтвержден независимым t test, а значение p <0,05 считалось статистически значимым.

Подготовка ампулы с PMO-H

Для клинического испытания в качестве исследуемого продукта использовали PMO-H. Добавляли PMO-H, очищенную воду, динатрий EDTA, аллантоин, дипропиленгликоль, пропандиол, карбомер и глицерин PEG / PPG / полибутиленгликоль-8/5/3 и перемешивали в течение 10-15 минут с использованием магнитной мешалки, а затем калий гидроксид и смесь перемешивали еще 5 ~ 10 мин. После того, как ингредиенты были гомогенно смешаны, добавляли гиалуронат натрия и бета-глюкан и перемешивали еще 2 ~ 5 минут, а затем добавляли феноксиэтанол, пропандиол, каприлилгликоль и этилгексилглицерин и перемешивали в течение 2 ~ 5 минут. Окончательный состав был добавлен в ампулу в качестве тестируемого продукта. Перед испытанием пузырьки воздуха из ампулы удаляли с помощью вакуумного сушильного шкафа. Контроль был приготовлен по тому же методу, что и для тестируемого продукта, за исключением того, что олеаноловая кислота была исключена.

Тесты человеческого приложения

Исследование раздражения кожи человека

Тест кожного пластыря косметического продукта, который содержал PMO-H в ампуле, был проведен на 25 мужчинах и женщинах в возрасте от 22 до 56 лет, которые согласились участвовать в тесте на раздражение кожи человека. Каждое тестируемое вещество капали на плечо и фиксировали пластырем. Пластырь прикрепляли на 24 часа, и 2 специалиста наблюдали за степенью стимуляции через 30 минут, 24 часа и 48 часов после удаления пластыря в соответствии с критериями Международной исследовательской группы контактного дерматита (ICDRG).

Клиническое испытание по уменьшению морщин

Полимерные мицеллы, содержащие олеаноловую кислоту в ампуле в качестве конечной формы продукта, наносили вокруг глаз 23 женщин в возрасте от 30 до 65 лет, которые согласились участвовать в тесте на уменьшение морщин. Субъекты соответствовали критериям включения и ни одному из критериев исключения и согласились участвовать в прикладном тесте на людях. Двойному слепому методу следовали как исследователи, так и испытуемые. Тест проводился в течение 8 недель, а оценка проводилась каждые 4 недели. Использовались двойной слепой метод и случайное распределение. Исследуемый продукт и контроль наносили по отдельности случайным образом на левую или правую сторону лица одного и того же испытуемого. Пять параметров оценивали с помощью оптической профилометрии с использованием Skin Visiometer SV 700 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Кельн, Германия) каждые 4 недели в течение 8 недель - средняя шероховатость (R3) была первичной конечной точкой, а четыре параметра шероховатости кожи (R1) , максимальная шероховатость (R2), глубина гладкости (R4) и средняя арифметическая шероховатость (R5) были вторичными конечными точками. Увеличение или уменьшение пяти параметров на одной и той же области объекта измеряли с течением времени, и средние значения увеличения или уменьшения пяти параметров рассчитывали и сравнивали между обработкой контрольным продуктом и тестируемым продуктом. Кроме того, профессионалы провели визуальный осмотр кожи. Фотографии морщин вокруг глаз были сделаны с помощью Janus 1 Mark II (PIE Co., Ltd., Сувон, Корея). Критерии, используемые для определения баллов визуальной оценки, показаны на рис. S1, а визуальные результаты представлены на рис. 13. Параметры сравнивались и анализировались с использованием парных выборок t тест с надежностью 95% [20,21,22,23,24,25].

Результаты и обсуждение

Определение солюбилизатора, поверхностно-активного вещества и полимера

Растворимость олеаноловой кислоты в биосовместимых солюбилизаторах, в частности, в поверхностно-активных веществах и полимерах, показана в таблице 1. Олеаноловая кислота имеет тенденцию быть растворимой в гидрофобных маслах с низким гидрофильно-липофильным балансом (HLB). Capryol® 90 имеет немного более высокое значение HLB по сравнению с обычными маслами [26]. Однако олеаноловая кислота показывает относительно высокую растворимость в Capryol® 90. Кроме того, Capryol® 90 может быть легко стабилизирован в качестве внутреннего ядра мицелл [27]. После выбора Capryol® 90 были проверены несколько типов поверхностно-активных веществ или полоксамеров на предмет оболочки мицелл олеаноловой кислоты [27,28,29,30]. Композиции мицелл олеаноловой кислоты, показанные в таблице 2, были прозрачными сразу после разбавления дистиллированной водой. Однако некоторые композиции были нестабильными и претерпевали осаждение, фазовое разделение или гелеобразование в течение 24 часов. Типичные изображения осажденного, фазово-разделенного, прозрачного состояния жидкости и геля показаны на рис. 2. Конечное состояние каждой формулы суммировано в таблице 3. Композиции G и H оставались прозрачными даже через 24 часа. Хотя состав I оставался прозрачным, это был гель, а не жидкость. Композиции от A до D становились непрозрачными из-за выпадения осадка через 24 часа. Учитывая эти результаты, композиции G и H были выбраны для дальнейшей разработки.

Репрезентативные изображения a осадки, b разделение фаз, c прозрачная жидкость и d гелеобразование мицелл олеаноловой кислоты

Характеристики полимерных мицелл олеаноловой кислоты

Структуры полимерных мицелл олеаноловой кислоты исследовали методом окрашивания. На рисунке 3 показаны изображения смеси Capryol® 90 и дистиллированной воды, Capryol® 90, дистиллированной воды и полимерных мицелл состава G (PMO-G) и состава H (PMO-H) после добавления метиленового синего к решение. Четкое разделение фаз произошло для смеси Capryol® 90 и дистиллированной воды. Осаждение метиленового синего наблюдалось в случае Capryol® 90. Дистиллированная вода становилась темно-синей после добавления метиленового синего. PMO-G и PMO-H также стали синими, что указывает на то, что полимерные мицеллы состояли из внутреннего ядра масляной фазы и внешней оболочки водной фазы. Другими словами, амфифильный полимер, полоксамер 407 в композициях G и H, служит внешней оболочкой и помогает успешно формировать полимерные мицеллы олеаноловой кислоты путем инкапсуляции внутреннего ядра Capryol® 90, содержащего олеаноловую кислоту [31].>

Тест на окрашивание метиленовым синим:( a ) смесь Capryol® 90 и дистиллированной воды, ( b ) Capryol® 90, ( c ) дистиллированная вода, ( d ) PMO-G и ( e ) PMO-H

Размер, распределение по размерам и форма частиц могут быть хорошими индикаторами для прогнозирования физической стабильности составов мицелл. Средний размер частиц PMO-G составлял 80,4 нм, а PMO-H - 57 нм (рис. 4). Гистограммы PMO-A, G и H показаны на рис. 5 для сравнения распределений по размерам, на которые влияет фазовое состояние. Как показано в таблице 3, PMO-A непрозрачен из-за осаждения, а PMO-G и H прозрачны. Размер частиц PMO-A составляет более 100 нм, и PMO-A показывает более широкое распределение по размерам, чем PMO-G и H (рис. 5). PMO-H имеет более узкое распределение частиц по размеру, чем PMO-G, и обладает текучестью, подходящей для косметических продуктов.

Средний размер частиц PMO-G и PMO-H из таблицы 2:80,4 ± 11,1 нм (PMO-G) и 57 ± 5,24 нм (PMO-H)

Гистограмма анализа частиц трех разных образцов PMO. а PMO-A, 121,28 нм; б PMO-G, 80,4 нм; и ( c ) PMO-H, 57 нм

Эффективность инкапсуляции как для PMO-G, так и для PMO-H составляла от 99 до 100%, что указывает на то, что почти 100% олеаноловой кислоты было инкапсулировано во внутреннем ядре PMO (рис. 6).

Эффективность инкапсуляции PMO-G и PMO-H показывает почти 100% эффективность инкапсуляции лекарственного средства:98,26 ± 0,17% (PMO-G) и 99,18 ± 1,06% (PMO-H)

Форму PMO-G и PMO-H исследовали с помощью сканирующей электронной криомикроскопии (Cryo-SEM). Крио-сканирующая электронная микроскопия показала, что и PMO-G, и PMO-H представляют собой полимерные мицеллы сферической формы. Однако полимерные мицеллы PMO-H были более однородными по размеру и форме, чем полимерные мицеллы PMO-G (рис. 7).

Сканирующие электронные криомикроскопические изображения а PMO-G и b PMO-H

Исследование проницаемости PMO через кожу in vitro

Общее количество олеаноловой кислоты, остающейся в коже, и общее количество олеаноловой кислоты, проникшей через кожу, как функция времени измеряли с использованием кожи самки бесшерстной мыши в возрасте 6 недель. С точки зрения кожи сравнивались четыре различных препарата:PMO-G, PMO-H, смесь олеаноловой кислоты и Tween 80, диспергированных в дистиллированной воде (OTw), и смесь олеаноловой кислоты и пропиленгликоля, диспергированной в дистиллированной воде (OPG). эффективность проникновения олеаноловой кислоты. Общее количество олеаноловой кислоты, проникшей через кожу через 24 часа, составило 29,49 ± 4,00% для PMO-H, 21,39 ± 5,91% для PMO-G, 13,66 ± 0,81% для OTw и 5,90 ± 2,47% для OPG. Как показано на рис.7, первое обнаружение олеаноловой кислоты в случае как PMO-G, так и PMO-H было возможно через 8 часов, в то время как первое обнаружение олеаноловой кислоты в OTw было возможно через 10 часов, а OPG - через 20 часов. час Доли олеаноловой кислоты, оставшейся в коже, составляли 56,22 ± 13,50% для PMO-H, 36,74 ± 0,72% для PMO-G, 27,44 ± 7,02% для OTw и 26,28 ± 5,42% для OPG. PMO-H показал наибольшее количество олеаноловой кислоты, проникающей через кожу, и олеаноловой кислоты, оставшейся в коже (рис. 8). Эти результаты показывают, что PMO могут проникать быстрее и больше, чем составы, не образующие мицеллы.

Общее количество олеаноловой кислоты в смеси PMO-G, PMO-H, олеаноловой кислоты и Tween 80, диспергированных в дистиллированной воде (Otw), и смеси олеаноловой кислоты и пропиленгликоля, диспергированной в дистиллированной воде (OPG), проникающей через кожу, и количество олеаноловой кислоты кислоты в каждой рецептуре как функция времени. Количество олеаноловой кислоты, оставшееся в коже через 24 часа:36,74 ± 0,72% (PMO-G), 56,22 ± 13,50% (PMO-H), 27,44 ± 7,02% (Otw) и 26,28 ± 5,42% (OPG). Количество олеаноловой кислоты, проникшей через 24 часа:21,39 ± 5,91% (PMO-G), 29,49 ± 4,00% (PMO-H), 13,66 ± 0,81% (Otw) и 5,90 ± 2,67% (OPG)

Стабильность полимерных мицелл жидкой олеаноловой кислоты

На основе характеристик и исследований проникновения in vitro PMO-H был окончательно выбран для приготовления ампул. Перед приготовлением ампулы оценивали стабильность ONM-H. Для исследования стабильности PMO-H хранили во флаконах в условиях ускоренного исследования стабильности при 40 ° C / 75% относительной влажности в течение 3 месяцев. Затем визуально оценивали осаждение, фазовое разделение, изменение цвета и прозрачность. Затем измеряли долю олеаноловой кислоты с помощью ВЭЖХ, а также проверяли изменения размера частиц. Стабильность проверена временем. PMO-H оставался прозрачным без осаждения или разделения фаз, и его цвет не менялся в течение 3 месяцев в условиях ускоренной стабильности. Доля олеаноловой кислоты, измеренная с помощью ВЭЖХ, и изменения размера частиц с течением времени показаны на рис. 9. Доля олеаноловой кислоты оставалась более 98%, а размер частиц 49,6 ± 5 нм оставался почти постоянным в течение 3 месяцев стабильности. период обучения. Эти результаты показывают, что PMO-H физически и химически стабилен в течение 3 месяцев в условиях ускоренной стабильности.

Изменения содержания и размера частиц PMO-H в течение 3 месяцев испытания стабильности в условиях ускорения при 40 ° C / 75% относительной влажности. Доля олеаноловой кислоты в PMO-H:100 ± 1,6% (0 месяцев), 99,9 ± 0,2% (1 месяц), 99,5 ± 0,2% (2 месяца) и 99,3 ± 0,2% (3 месяца). Размер частиц PMO-H:55,3 ± 6,5 нм (0 месяцев), 54,6 ± 7 нм (1 месяц), 51,0 ± 5,56 нм (2 месяца) и 49,6 ± 5 нм (3 месяца)

Клинический тест

Тест на раздражение человека

Перед клиническим испытанием был проведен тест на раздражение человека на 25 здоровых добровольцах женского и мужского пола в возрасте от 22 до 56 лет. Тестируемый продукт накладывали на плечо субъектов на 24 часа, а индекс раздражения кожи измеряли через 30 минут, 24 часа и 48 часов после удаления пластыря. Раздражение не наблюдалось при использовании формулы косметической ампулы, содержащей PMO-H, через 1 или 48 часов после удаления пластыря.

Клиническое испытание

Клиническое испытание проводилось с участием 23 женщин в возрасте от 30 до 65 лет с морщинами вокруг глаз; Исключая 3 выбывших, 20 субъектов завершили испытание, по отдельности нанеся тестируемый продукт, ампулу PMO-H и контроль на левую или правую сторону лица в течение 8 недель. Изменения кожи оценивались по пяти параметрам:средняя шероховатость (R3) в качестве первичной конечной точки и четыре дополнительных параметра в качестве вторичных конечных точек, а именно шероховатость кожи (R1), максимальная шероховатость (R2), глубина гладкости (R4) и средняя арифметическая шероховатость. (R5). Оценка визуальной оценки добавила еще одну вторичную конечную точку. Результаты представлены в таблице 4.

Первичная конечная точка R3 снизилась на 0,673% после 4 недель использования тестируемого продукта и статистически значимо на 7,835% после 8 недель использования ( p =0,006). При контрольном применении R3 увеличился на 5,127% после 4 недель использования и статистически значимо на 9,971% после 8 недель использования ( p =0,010). The difference in R3 value between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.000) but not statistically significant after 4 weeks of use, perhaps due to inter-subject variation (Fig. 10).

Changes in primary endpoint value, R3, before, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of an ampoule containing polymeric micelles of oleanolic acid and the control during clinical trial. R3 value of test product use:0.094 ± 0.023 before use, 0.093 ± 0.023 after 4 weeks use, 0.086 ± 0.020 after 8 weeks use. R3 value of control product:0.087 ± 0.023 before use, 0.091 ± 0.025 after 4 weeks use, 0.095 ± 0.024 after 8 weeks use (A.U. for arbitrary unit). * ¹ The wrinkle analysis of R3 value decreased statistically significantly. * ² The wrinkle analysis of R3 value increased statistically significantly

The analysis of the secondary endpoint R1 showed that the value had decreased by 4.629% after 4 weeks of test product use and statistically significantly by 9.973% after 8 weeks of use (p =0.017). With control application, R1 had increased by 8.037% after 4 weeks of use and 4.799% after 8 weeks of use. The difference in R1 values between the areas using the test product and the control was not statistically significant after 4 weeks of use but was after 8 weeks of use (p =0.024). The secondary endpoint R2 had decreased by 1.048% after 4 weeks of test product use and 5.803% after 8 weeks. With control application, it had increased by 7.261% after 4 weeks and 9.536% after 8 weeks. The difference in R2 value between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.016) but not after 4 weeks of use. The secondary endpoint R4 had significantly decreased by 8.594% (p =0.039) after 4 weeks of test product use and by 9.747% after 8 weeks of use. With the control, R4 had increased by 10.764% after 4 weeks of use and 3.491% after 8 weeks of use. Interestingly, the difference in R4 value between the areas using the test product and the control was statistically significant after 4 weeks of use (p =0.008) but not after 8 weeks. The secondary endpoint R5 had decreased by 6.333% after 4 weeks of test product use and 8.556% after 8 weeks of use. The difference in R5 value between the areas of using the test product and the control was not statistically significant following 4 weeks or even 8 weeks of use.

The analysis of the further secondary endpoint, the visual evaluation of wrinkles, showed that the visual evaluation score had decreased by 2.917% after 4 weeks of test product use and statistically significantly decreased by 8.333% after 8 weeks of use (p =0.034). With application of the control, the visual evaluation score had increased by 1.667% after 4 weeks and 4.167% after 8 weeks. The difference of the visual evaluation score between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.046) but not after 4.

In summary, the analysis of the wrinkled area around the eyes showed that the difference in the primary endpoint value R3 between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use. In terms of the secondary endpoints, all values had decreased after test product use and increased after control use. The difference in R4 values between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 4 weeks of use, but the difference of the R1 and R2 values were statistically significant only after 8 weeks of use (Fig. 11). The visual evaluation score by professionals showed that all the average visual evaluation scores for wrinkles had decreased after 4 weeks and 8 weeks of test product treatment compared to the control (Table 5). The difference in the visual evaluation score between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use (Fig. 12). Overall, according to all endpoints, the cosmetics formula containing PMO-H as a primary ingredient was found to help improve wrinkles after 8 weeks of use (Fig. 13).

Results of secondary endpoint R1, R2, R4, and R5 for skin wrinkle measurement—before use, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of the test product and the control. Please refer to Table 4 for the exact values (A.U. for arbitrary unit)

Results of visual evaluation of skin—before use, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of the test product and the control. Test product:3.050 ± 0.887 before use, 2.95 ± 0.999 after 4 weeks use, and 2.75 ± 0.851 after 8 weeks. Control product:2.900 ± 0.887 before use, 2.95 ± 0.945 after 4 weeks use, and 3.000 ± 0.918 after 8 weeks use. * ¹ The visual evaluation grade of wrinkles by professionals decreased significantly. * ² The visual evaluation grade of wrinkles by professionals increased significantly

Pictures of the tested areas

Conclusions

Surfactants are commonly used excipients in cosmetic products to improve solubility of poorly soluble materials. One caveat would be the amount included in the product. Surfactants should be added in sufficient amount to dissolve poorly soluble materials without precipitation. Only a minimal amount should be added for safety reasons. Micelle formulation could be the solution to this problem. Polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study improve the solubility of oleanolic acid with a minimum amount of surfactants and enhance the permeation of oleanolic acid through the skin. Stable polymeric micelles of oleanolic acid were developed using Capryol 90 and poloxamer. The polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study were stable, that is, they did not show any precipitation, phase separation, or degradation at 40 °C after 3 months. The clinical trial showed that, as a main active ingredient, the oleanolic acid in the polymeric micelle formulation is effective for alleviating human wrinkles. Based on these findings, it can be concluded that oleanolic acid, which is poorly soluble in water and therefore, unusable in a native form as a principal ingredient for alleviating skin wrinkles, can be formulated into applicable polymeric micelles. Furthermore, it is expected that the polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study will prove very useful for alleviating human wrinkles and will prove widely applicable to cosmetic applications.

Доступность данных и материалов

Not applicable

Сокращения

PMO:

Polymeric micelles of oleanolic acid

PEG:

Полиэтиленгликоль

TRANSCUTOL P:

Highly purified diethylene glycol monoethyl ether

LABRASOL:

PEG-8 Caprylic/Capric Glycerides

LAUROGLYCOL FCC:

Propylene glycol monolaurate (type I, monoesters>45%)

LABRAFAC:

Caprylic/Capric Triglyceride

Capryol® 90:

Propylene glycol monocaprylate (type II, monoesters>90%)

Capryol™ PGMC:

Propylene glycol monocaprylate (type I, monoesters>55%)

EDTA:

Ethylenediaminetetraacetic Acid

ELS:

Electrophoretic light scattering